CN109402214B - 利用mfc评价电磁辐射对生物体能量代谢影响的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物燃料电池领域,涉及一种利用MFC评价电磁辐射对生物体能量代谢影响的方法。其依据是:电子传递链是生物细胞能量代谢的重要组成部分;微生物燃料电池可实时记录电活性微生物电子传递链上的电流;电磁场强度与微生物燃料电池所产电流的波动幅度呈线性对应关系。其步骤如下:构建微生物燃料电池;采集同一微生物燃料电池在不同强度电磁场作用下的电流强度;以同一处理组电流的标准偏差代表电流的波动幅度,构建电磁场强度‑电流波幅标准曲线;该标准曲线用于指示电磁辐射对生物体能量代谢的影响。该方法实现了电磁辐射对生物体健康影响,尤其在能量代谢方面的量化分析,评价结果准确、可靠。
Description
技术领域
本发明属于微生物燃料电池领域,具体涉及一种利用MFC评价电磁辐射对生物体能量代谢影响的方法。
背景技术
电磁场以一定速度在空间里传播的过程就是电磁辐射。电磁辐射是一个客观存在,作为一种能量流,人类无法直接感受到,但它却无时不在、无处不在。当电磁辐射强度超过环保规定标准,就会产生负面效应,引起人体的不同病变和危害,这部分超过标准的电磁场强度的辐射叫电磁辐射污染。与化学性污染、生物性污染不同,电磁辐射污染是能量的污染,在环境中不会有残余物质产生。
自Wertheimer和Leeper首次报道交变电磁场与儿童白血病的发生有关以来(1979),电磁辐射对人体健康的影响已引起公众的广泛关注。Cicekcibasi等报道,1~4 μT电磁场处理可使小鼠体重增加(Cicekcibasi et al., 2008),表明电磁场可能会诱发肥胖症;Inhan-Garip等报道,50 Hz、0.5 mT电磁场可影响细菌染色体的分裂(Inhan-Garip etal., 2011)。总之,从微生物到高等动物,均有受电磁场影响的报道。
通过检测电磁场对线粒体膜电势(Iorio et al. 2011)、细胞ATP含量(Destefanis et al. 2015; Shi et al. 2015)、蛋白表达(Destefanis et al. 2015)、代谢物水平(Shi et al. 2015)等的影响表明,电磁场可影响生物体的能量代谢。然而,迄今为止,尚未发现可用于指示电磁场对生物体能量代谢影响的生物标志物。主要原因在于以上研究在开展时需要对细胞进行裂解,因而实验结果不能实时反映电磁场对生物体能量代谢的影响。此外,由于实验条件(如电磁场强度)、实验方法以及实验标准的不统一,使得一些实验重现性低,导致实验结果的可靠性和可信性备受质疑。一个理想的反映生物体能量代谢状况的生物标志物应该存在于所有的生物细胞内,均与能量代谢相关,且能实时灵敏的反映电磁场对生物体的影响。本发明利用微生物燃料电池(MFC)能实时检测微生物代谢所产生的电流,且该电流在不同的电磁场条件下有不同程度的波动;利用MFC电流波动与电磁场强度成线性关系的原理评价电磁场对生物体能量代谢的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用MFC评价电磁辐射对生物体能量代谢影响的方法,该方法简单、灵敏、快速、稳定。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的,其步骤包括:
(1)菌株培养:挑取单菌落至液体培养基中,培养10~18 h,离心收集菌体,用0.5mL,pH 7.0的PBS缓冲液重悬,制得MFC接种液;
(2)MFC构建:MFC装置由两个100 mL的玻璃瓶连接构成,阳极电极为碳板,阴极电极为碳毡,中间用阳离子交换膜隔开,两个电极通过连接外电阻形成闭合回路,MFC接种液接种于阳极室,用于提供电子,阴极利用空气中的氧气接收电子;
(3)电流采集:将MFC放置于在电磁场实验装置中,当MFC所产电流升至0.2-0.5 mA时,开启电磁场,并利用数据采集装置记录MFC所产生的电流;
(4)标准曲线制作:利用Excel 2010计算不同强度电磁场处理条件下微生物代谢电流的标准偏差,以标准偏差数值代表电流的波幅,利用origin 8.0绘制电磁场强度-电流波幅标准曲线,利用线性拟合原理建立拟合公式。
步骤(1)中菌株为任意可厌氧培养的具有产电活性的微生物。
步骤(2)中MFC阴极电极碳毡表面涂覆0.5 mg/cm2 的Pt以提高氧气接收电子的能力。
步骤(2)中MFC装置组装好后,阳极加入已灭菌、除氧的阳极液80 mL,接入MFC接种液,阳极室瓶盖与瓶口之间加硅胶垫密封防止外界空气进入;阴极加入阴极液80 mL,MFC工作时,阴极室不断通入空气,以溶解氧作为电子受体;整个实验过程中MFC均连接外电阻形成闭合电路。
阳极液由以下成分组成:NaHCO3 2.5 g/L,KCl 0.1 g/L,NH4Cl 0.25 g/L,NaH2PO40.6 g/L,10 mL维生素母液,10 mL微量元素母液,调节pH为7.2后,加入终浓度为15 mM的乙酸钠;阴极液为终浓度0.2 M的 PBS缓冲液,pH 7.0。
维生素母液由以下成分组成:生物素 2.0 mg/L,叶酸 2.0 mg/L,盐酸吡哆醇10.0 mg/L,核黄素 5.0 mg/L,硫胺素 5.0 mg/L,烟酸 5.0 mg/L,泛酸 5.0 mg/L,钴胺素0.1 mg/L,对氨基苯甲酸 5.0 mg/L,硫辛酸 5.0 mg/L。
微量元素母液由以下成分组成:氨三乙酸三钠 1.5 g/L,MgSO4·7H2O 3.0 g/L,MnSO4·H2O 0.5 g/L,NaCl 1.0 g/L,FeSO4·7H2O 0.1 g/L,CaCl2 0.1 g/L,CoCl2·6H2O0.1 g/L,ZnSO4·7H2O 0.1 g/L,Cu2SO4·5H2O 0.01 g/L,AlK(SO4)2·12H2O 0.01 g/L,H3BO3 0.01 g/L,Na2MoO4 0.025 g/L, NiCl2·6H2O 0.024 g/L,Na2WO4·2H2O 0.025 g/L。
步骤(3)中,电磁场实验装置的电磁场强度从1 Gs开始,以每20~60 min翻一倍的方式增强,数据采集设为1~10 s/次。
根据需要将上述方法应用于评价电磁场对生物细胞能量代谢的影响中。
本发明的优点在于:
(1)与直接测量电磁场强度的仪器相比,本发明不仅可以反映某个区域电磁场强度,还能反映该电磁场对生物体能量代谢的影响,尤其反映电磁场对能量代谢过程中电子流动的影响;
(2)本发明能实时检测微生物代谢所产生的电流,且该电流在不同的电磁场条件下有不同程度的波动,利用MFC电流波动与电磁场强度成线性关系的原理可以评价电磁场对生物体能量代谢的影响;
(3)该方法操作简单,不需要对细胞进行裂解,可重复性好,反应灵敏;
(4)该方法不但拓展了微生物电化学技术的应用,还推动了微生物电化学与环境健康学科之间的交叉融合。
附图说明
图1为双室MFC示意图。
图2 为实施例1MFC电流-时间曲线,最上面的曲线是处理组的结果,中间的曲线是对照组1的结果,最下面的曲线是对照组0的结果。
图3为实施例1电磁场强度-电流波幅标准曲线。
图4 为实施例2处理组的结果。
图5为实施例2电磁场强度-电流波幅标准曲线。
具体实施方式
实施例1
下面描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
实施例1:
(1)菌株培养:将产电微生物奥奈达希瓦氏菌(Shewane1la oneidensis MR-1,ATCC700550)划线接种于固体LB培养基(胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L,琼脂粉15 g,pH调为7.0),30℃培养24 h,挑取单菌落至液体LB培养基中,30℃,180 rpm,培养12 h。
(2)MFC接种液制备:将(1)中的菌液4℃ 6000 r/min,离心2 min,厌氧条件下去除上清液,获取菌体细胞,用PBS缓冲液,成分为(/L):Na2HPO4·12H2O 22.2 g;NaH2PO4·2H2O5.93 g;KCl 0.13 g,pH7.0,清洗三次,0.5 mL重新悬浮,制得MFC接种液。
(3)MFC电极液制备:MFC阴极液为pH 7.0 浓度为0.2 M的 PBS缓冲液。MFC阳极液为基础培养基(NaHCO3 2.5 g/L;KCl 0.1 g/L;NH4Cl 0.25 g/L; NaH2PO4 0.6 g/L;10 mL维生素母液;10 mL微量元素母液; pH调节为7.2)与电子供体乙酸钠的混合液,乙酸钠终浓度为15 mM。阳极液高温灭菌(121 ℃,20 min),然后充混合气(N2:CO2 = 80:20 v/v)30 min排除液体中的氧气,密封。其中,维生素母液由以下成分组成:生物素 2.0 mg/L,叶酸 2.0mg/L,盐酸吡哆醇 10.0 mg/L,核黄素 5.0 mg/L,硫胺素 5.0 mg/L,烟酸 5.0 mg/L,泛酸5.0 mg/L,钴胺素 0.1 mg/L,对氨基苯甲酸 5.0 mg/L,硫辛酸 5.0 mg/L;微量元素母液由以下成分组成:氨三乙酸三钠 1.5 g/L,MgSO4·7H2O 3.0 g/L,MnSO4·H2O 0.5 g/L,NaCl1.0 g/L,FeSO4·7H2O 0.1 g/L,CaCl2 0.1 g/L,CoCl2·6H2O 0.1 g/L,ZnSO4·7H2O 0.1g/L,Cu2SO4·5H2O 0.01 g/L,AlK(SO4)2·12H2O 0.01 g/L,H3BO3 0.01 g/L,Na2MoO4 0.025g/L, NiCl2·6H2O 0.024 g/L,Na2WO4·2H2O 0.025 g/L。
(4)MFC构建:本实施例采用双室MFC(图1),整个电池装置由两个100 mL的玻璃瓶连接构成,两个玻璃瓶均带有法兰接口。两个接口处各垫一个硅胶圈,中间夹上质子交换膜,接口由两个法兰固定连接在一起。碳毡电极上连接的导线从瓶子侧边瓶盖上的橡胶塞中央穿出,与橡胶塞接缝处用硅胶密封。在组装之前,瓶子高压灭菌,硅胶圈及阳离子交换膜涂抹75%酒精并置于超净台杀菌。组装好后,阳极加入已灭菌、除氧的MFC阳极液80 mL,顶端预留20 mL空间,接入MFC接种液,阳极室瓶盖与瓶口之间加硅胶垫密封防止外界空气进入。电池工作时,阴极室不断通入空气,以溶解氧作为电子受体。MFC的阳极和阴极均连接1000 Ω外电阻形成闭合电路。
阳极为碳板(长3 cm、宽2 cm、高0.5 cm,表面积为17 cm2),阴极为涂覆0.5 mg/cm2Pt 的碳毡(直径3.8 cm, 表面积7 cm2)。运行前反应器曝N2:CO2(80:20v/v) 混合气15 min以保证反应器内的厌氧环境,温度30 ± 1 ℃。构建12个MFC,其中9个接种奥奈达希瓦氏菌,3个接种相同体积的0.2 M,pH7.0的PBS缓冲液。
(5)电磁场暴露处理:将MFC放置于在电磁场实验装置(湖南永逸,FE-3580AF)中,当MFC所产电流升至0.2 mA时,开启电磁场,并利用数据采集装置记录MFC所产生的电流,数据采集设为10 s/次。从1 Gs开始,以每小时翻一倍的方式提高磁场强度,依次是1、2、4、8、16、32、64、128 Gs,以未接菌的3个MFC和3个接菌的MFC放置于远离电磁场发生装置5 m远的生物培养箱中作为对照,分别为对照组0和对照组1,6个放置于电磁场实验装置中的接菌的MFC作为研究对象,即处理组。实验显示,随着电磁场强度的增加,电流波动越大(图2)。
(6)标准曲线制作:利用Excel 2010计算每一处理条件下,微生物代谢电流的标准偏差(standard deviation, SD),以标准偏差数值代表电流的波幅,计算6个处理组SD值的平均值及SD值,利用origin 8.0绘制电磁场强度-电流波幅标准曲线,利用线性拟合原理建立拟合公式, 即I SD =4.15+0.24×B, , R2 = 0.83(图3)。其中I SD表示电流的波幅,B表示电磁场强度,R表示相关系数。
实施例2
(1)菌株培养:将产电微生物硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens PCA,DSMZ 12127)厌氧条件下接种于液体NBAF培养基(延胡索酸 4.64 g/L,NaHCO3 2.50 g/L,NH4Cl 0.25 g/L,NaH2PO4·2H2O 0.68 g/L,KCl 0.10 g/L,维生素母液10 ml/L,微量元素母液 10 ml/L,乙酸钠 0.85 g/L,pH调为7.0),菌液接种量为接种培养基量的10%,30℃培养18 h。
(2)MFC接种液制备:将(1)中的菌液4℃ 6000 r/min,离心2 min,厌氧条件下去除上清液,获取菌体细胞,用PBS缓冲液,成分为(/L):Na2HPO4·12H2O 22.2 g;NaH2PO4·2H2O5.93 g;KCl 0.13 g,清洗三次,0.5 mL重新悬浮,制得MFC接种液。
(3)MFC电极液制备:MFC阴极液为pH 7.0 浓度为0.2 M的 PBS缓冲液。MFC阳极液为基础培养基(NaHCO3 2.5 g/L;KCl 0.1 g/L;NH4Cl 0.25 g/L; NaH2PO4 0.6 g/L;10 mL维生素母液;10 mL微量元素母液; pH调节为7.2)与电子供体乙酸钠的混合液,乙酸钠终浓度为15 mM。阳极液高温灭菌(121 ℃,20 min),然后充混合气(N2:CO2 = 80:20 v/v)30 min排除液体中的氧气,密封;以上试剂均为分析纯。
(4)MFC构建:本实施例采用双室MFC,整个电池装置由两个100 mL的玻璃瓶连接构成,两个玻璃瓶均带有法兰接口。两个接口处各垫一个硅胶圈,中间夹上质子交换膜,接口由两个法兰固定连接在一起。碳毡电极上连接的导线从瓶子侧边瓶盖上的橡胶塞中央穿出,与橡胶塞接缝处用硅胶密封。在组装之前,瓶子高压灭菌,硅胶圈及阳离子交换膜涂抹75%酒精并置于超净台杀菌。组装好后,阳极加入已灭菌、除氧的MFC阳极液80 mL,顶端预留20 mL空间,接入MFC接种液,阳极室瓶盖与瓶口之间加硅胶垫密封防止外界空气进入。电池工作时,阴极室不断通入空气,以溶解氧作为电子受体。MFC的阳极和阴极均连接1000 Ω外电阻形成闭合电路。
阳极为碳板(长3 cm、宽2 cm、高0.5 cm,表面积为17 cm2),阴极为涂覆0.5 mg/cm2Pt 的碳毡(直径3.8 cm, 表面积7 cm2)。运行前反应器曝N2:CO2(80:20v/v) 混合气15 min以保证反应器内的厌氧环境,温度30 ± 1 ℃。构建12个MFC,其中9个接种硫还原地杆菌,3个接种相同体积的0.2 M,pH7.0的PBS缓冲液。
(5)电磁场暴露处理:将MFC放置于在电磁场实验装置(湖南永逸,FE-3580AF)中,当MFC所产电流升至0.2 mA时,开启电磁场,并利用数据采集装置记录MFC所产生的电流,数据采集设为10 s/次。从1 Gs开始,以每小时翻一倍的方式提高磁场强度,依次是1、2、4、8、16、32、64、128 Gs,以未接菌的3个MFC和3个接菌的MFC放置于远离电磁场发生装置5 m远的生物培养箱中作为对照,分别为对照组0和对照组1,6个放置于电磁场实验装置中的接菌的MFC作为研究对象,即处理组。电磁场暴露处理结果实验显示,随着电磁场强度的增加,电流波动越大(图4)。
(6)标准曲线制作:利用Excel 2010计算每一处理条件下,微生物代谢电流的标准偏差(standard deviation, SD),以标准偏差数值代表电流的波幅,计算6个处理组SD值的平均值及SD值,利用origin 8.0绘制电磁场强度-电流波幅标准曲线,利用线性拟合原理建立拟合公式, 即I SD =4.01+0.24×B, R2 = 0.84(图5)。其中I SD表示电流的波幅,B表示电磁场强度,R表示相关系数。
实施例结果表明MFC所产电流波幅I SD与电磁场强度B呈正相关关系,即电磁场强度越大,电流波动越大,相应的,生物细胞能量代谢受到的影响也就越大。R2 > 0.80说明电磁场强度与电流波幅之间关系的模拟较好,可以一定程度上通过该拟合公式反映电磁辐射对生物体能量代谢的影响。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (3)
1.利用MFC评价电磁辐射对生物体能量代谢影响的方法,其特征在于,所述评价方法建立步骤包括:
(1)菌株培养:挑取单菌落至液体培养基中,培养10~18 h,离心收集菌体,用0.5 mL,pH7.0的PBS缓冲液重悬,制得MFC接种液;
(2)MFC构建:MFC装置由两个100 mL的玻璃瓶连接构成,阳极电极为碳板,阴极电极为碳毡,中间用阳离子交换膜隔开,两个电极通过连接外电阻形成闭合回路,MFC接种液接种于阳极室,用于提供电子,阴极利用空气中的氧气接收电子;
(3)电流采集:将MFC放置于在电磁场实验装置中,当MFC所产电流升至0.2-0.5 mA时,开启电磁场,并利用数据采集装置记录MFC所产生的电流;
(4)标准曲线制作:计算不同强度电磁场处理条件下微生物代谢电流的标准偏差,以标准偏差数值代表电流的波幅,绘制电磁场强度-电流波幅标准曲线,利用线性拟合原理建立拟合公式;
所述步骤(2)中MFC装置组装好后,阳极加入已灭菌、除氧的阳极液80 mL,接入MFC接种液,阳极室瓶盖与瓶口之间加硅胶垫密封防止外界空气进入;阴极加入阴极液80 mL,MFC工作时,阴极室不断通入空气,以溶解氧作为电子受体;整个实验过程中MFC均连接外电阻形成闭合电路;所述阳极液由以下成分组成:NaHCO3 2.5 g/L,KCl 0.1 g/L,NH4Cl 0.25 g/L,NaH2PO4 0.6 g/L,10 mL维生素母液,10 mL微量元素母液,调节pH为7.2后,加入终浓度为15mM的乙酸钠;阴极液为终浓度0.2 M的 PBS缓冲液,pH 7.0;所述维生素母液由以下成分组成:生物素 2.0 mg/L,叶酸 2.0 mg/L,盐酸吡哆醇 10.0 mg/L,核黄素 5.0 mg/L,硫胺素5.0 mg/L,烟酸 5.0 mg/L,泛酸 5.0 mg/L,钴胺素 0.1 mg/L,对氨基苯甲酸 5.0 mg/L,硫辛酸 5.0 mg/L;
所述微量元素母液由以下成分组成:氨三乙酸三钠 1.5 g/L,MgSO4·7H2O 3.0 g/L,MnSO4·H2O 0.5 g/L,NaCl 1.0 g/L,FeSO4·7H2O 0.1 g/L,CaCl2 0.1 g/L,CoCl2·6H2O0.1 g/L,ZnSO4·7H2O 0.1 g/L,Cu2SO4·5H2O 0.01 g/L,AlK(SO4)2·12H2O 0.01 g/L,H3BO3 0.01 g/L,Na2MoO4 0.025 g/L, NiCl2·6H2O 0.024 g/L,Na2WO4·2H2O 0.025 g/L;所述步骤(3)中,电磁场实验装置的电磁场强度从1 Gs开始,以每20~60 min翻一倍的方式增强,数据采集设为1~10 s/次;所述步骤(1)中菌株为任意可厌氧培养的具有产电活性的微生物。
2.根据权利要求1所述利用MFC评价电磁辐射对生物体能量代谢影响的方法,其特征在于:所述步骤(2)中MFC阴极电极碳毡表面涂覆0.5 mg/cm2 的Pt以提高氧气接收电子的能力。
3.如权利要求1~2任一项所述利用MFC评价电磁辐射对生物体能量代谢影响的方法在评价电磁场对生物细胞能量代谢影响中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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