CN116555085A - 一种生物膜传感器及用其检测生物毒性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物领域,具体涉及一种生物膜传感器及用其检测生物毒性的方法。具体技术方案为:一种菌制剂,包括地杆菌、不动杆菌和假单胞菌。利用所述菌制剂制备传感器并用其检测污染物的生物毒性。本发明提供了一种新的生物膜传感器,基于地杆菌较高的电活性,及配合培养时限制碳源用量,最终获得厚度低于现有技术的电活性生物膜,并实现了极高的检测灵敏度,具有巨大的检测应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域,具体涉及一种生物膜传感器及用其检测生物毒性的方法。
背景技术
随着医药、生化领域技术的不断发展,许多新污染物(有毒有害化学物质)例如氨苄西林、红霉素、三氯乙酸、三氯乙醛等也逐渐走入人们的视野。与传统的环境污染物相比,新污染物多具有器官毒性、神经毒性、生殖和发育毒性、免疫毒性、内分泌干扰效应、致癌性、致畸性等多种生物毒性,容易对生态环境和人体健康造成严重影响。因此,检测新污染物生物毒性对于科学筛查评估新污染物的环境风险非常重要。
现有检测技术中,基于水生动物和发光细菌的水体生物毒性方法准确性较高,但存在检测指标假阴性高、客观性弱等缺陷,限制了其广泛应用。而使用酶、抗体和DNA作为敏感元件的生物电化学传感器可以弥补上述缺陷,但又存在成本高、寿命短、可持续性差及对水环境要求苛刻等问题,难以在实践中进行使用。
电活性生物膜传感器具有灵敏度高、响应快速、成本低等优点。该技术的关键在于电极生物膜的筛选。迄今为止,多数电活性生物膜传感器均采用生物阳极作为传感元件,通过阳极消耗有机物产生电流,毒性污染物通过抑制敏感微生物的活性衰减电流,从而表征污染物的毒性程度。然而,纯菌所构建的系统难以在开放环境中进行使用。
并且,环境中新污染物的实际浓度极低,对生物传感器的灵敏度要求较高。现有技术中的阳极生物膜大多过厚,极大影响了检测灵敏度。因此,调节生物膜的厚度是保证生物膜灵敏度的关键。
综上,如果能开发一种能够快速、灵敏检测新污染物的生物毒性电活性生物膜传感器,有利于推进对新污染物的全过程环境风险管控。
发明内容
本发明目的是提供一种生物膜传感器及用其检测生物毒性的方法。
为实现上述发明目的,本发明所采用的技术方案是:一种菌制剂,所述菌制剂包括地杆菌(Geobactersulfurreducens)、不动杆菌(Acinetobactersp.)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)。
优选的,所述假单胞菌为假单胞菌CIB-66,于2022年5月16日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2022638。
优选的,所述假单胞菌为假单胞菌CIB-66,其16S rDNA如SEQ.ID.NO:1所示。
优选的,按活菌量,地杆菌:不动杆菌:假单胞菌=3:1:1。
相应的,所述菌制剂在检测污染物生物毒性中的应用。
相应的,利用所述菌制剂制备生物膜的方法,所述方法中使用的营养成分中的碳源只提供维持微生物生存的量。
相应的,利用所述菌制剂制备的传感器,所述传感器的阳极电极上接种有所述菌制剂,所述阳极电解液中包括可维持菌制剂正常生长的营养成分。
相应的,所述传感器在检测污染物生物毒性中的应用。
优选的,所述检测的方法为:待电流稳定后,向阳极加入待检测污染物。
优选的,所述检测的方法为:加入待检测污染物后,根据电流变化情况判断污染物的生物毒性。
本发明具有以下有益效果:本发明提供了一种新的生物膜传感器,基于地杆菌较高的电活性,及配合培养时限制碳源用量,最终获得厚度远低于现有技术的电活性生物膜,并实现了极高的检测灵敏度,具有巨大的检测应用潜力。
附图说明
图1为本发明检测污染物生物毒性原理示意图;
图2为本发明制备的生物膜电镜扫描图;
图3为本发明方法检测氨苄西林I-T输出曲线及抑制率示意图;
图4为本发明方法检测红霉素I-T输出曲线及抑制率示意图;
图5为本发明方法检测三氯乙酸I-T输出曲线及抑制率示意图;
图6为本发明方法检测三氯乙醛I-T输出曲线及抑制率示意图;
图7为CCK-8法检测各新污染物抑制率示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测污染物生物毒性的菌制剂,尤其适用于检测新污染物的毒性。新污染物指氨苄西林、红霉素、三氯乙酸、三氯乙醛等医药/生化领域近年来新出现或新进引起关注的、尚未列入常规检测系统的、对环境和人类健康存在危害或潜在风险的化学或生物污染物。
所述菌制剂包括地杆菌(Geobactersulfurreducens)、不动杆菌(Acinetobactersp.)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)。优选的方案为:所述假单胞菌为假单胞菌CIB-66,于2022年5月16日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏地址为:中国武汉,武汉大学;保藏编号为CCTCCNO:M 2022638,其16S rDNA序列如SEQ.ID.NO:1所示;所述地杆菌可购自宁波明舟生物科技有限公司(BMZ134954)或美国模式培养物集存库ATCC(BAA-1151)等;所述不动杆菌可购自宁波明舟生物科技有限公司(BMZ135422)或美国模式培养物集存库ATCC(ATCC 16756)等。
更优选的方案为:按活菌量,地杆菌:不动杆菌:假单胞菌=3:1:1。
本发明还提供了利用所述菌制剂制备的传感器。所述传感器的阳极电极上接种有菌制剂,阳极和阴极分别连接正极和负极,同时在阳极室设置参考电极。所述阳极电解液为可维持菌制剂正常生长的培养基,所述阴极电解液为pH=7.0~7.2的50mM的PBS,即7.8g/L的二水磷酸氢二钠和1升纯水配置。完成传感器构建后,向阳极室注入待检测液体即可进行检测。
本发明还提供了将所述菌制剂和用于污染物生物毒性的方法,将所述菌制剂制备为电极生物膜,将所述电极生物膜置于含有待检测污染物的液体中,检测电流变化情况,从而检测液体中污染物的生物毒性。原理示意图如图1所示,具体方法包括:
1、驯化微生物。在室温下将地杆菌、假单胞菌和不动杆菌按比例加入驯化培养基,150r/min震荡培养,培养至OD600=2.0时,更换新的驯化培养基,重复2~3次。将驯化后的混合菌液6000rpm离心10min,PBS将离心所得的菌体沉淀清洗两次后悬浮在PBS中,得到混合菌液。
驯化培养基:Na2HPO4 4.58g、NaH2PO4·2H2O 2.45g、CH3COONa 0.5g、NH4Cl 0.31g、KCl 0.13g、矿物质1mL,加入1L的超纯水中,高压灭菌。所述驯化培养基为示例性的,使用本领域常规的异养微生物培养基即可,但驯化培养基中只提供低浓度的、可维持微生物生存的碳源,微生物在代谢过程中,会产生甲酸、乙酸等有机物,可进一步维持微生物的生存,同时避免了微生物大量繁殖,以获得更薄的生物膜。以本段所述驯化培养基为例,CH3COONa为碳源,使用浓度在0.3~0.5g范围内均可。
2、微生物挂膜、构建生物膜传感器。以电极生物膜为阳极,并填充适合电极生物膜上微生物生长的培养基。同时阳极室填充介质,电连接阳极和阴极。
生物膜传感器的具体设置方式可根据本领域常规技术进行调整,此处提供一种可选的方案:用丙酮、1M HCl、1M NaOH和纯水对电极材料进行预处理,以确保清洁无污染。所述电极可以是碳毡电极、不锈钢电极或金刚石电极,优选为碳毡电极。
搭建双室反应器:在阴极室填充PBS缓冲液,在阳极室中填充35mL培养介质,培养介质可选为:Na2HPO4 4.58g;NaH2PO4·2H2O 2.45g、CH3COONa0.5g、NH4Cl 0.31g、KCl0.13g、矿物质维生素混合溶液1mL,再加入50mM PBS,将pH值调节为7.0~7.2。
所述矿物质维生素混合溶液可购自成都科隆化学试剂有限公司,组成为:0.02g/L生物素、0.02g/L叶酸、0.1g/L盐酸吡哆醇、0.05g/L核黄素、0.05g/L硫胺素、0.05g/L烟酸、0.05g/L泛酸、0.001g/LB-12、0.05g/L对氨基苯甲酸、0.05g/L硫辛酸、15g/L亚硝基三乙酸,60g/L MgSO4·7H2O、5g/L MnSO4·H2O、1g/L FeSO4·7H2O、0.1g/LCuSO4·5H2O、0.1g/L AlK(SO4)2·12H2O、10g/L NaCl、1g/L CaCl2·2H2O、1g/L CoCl2·6H2O、1.3g/L ZnCl2、0.25g/LNa2MoO4、0.25g/L NiCl2·6H2O、1g/L H3BO3、0.25g/L Na2WO4·2H2O。
此处培养介质和矿物质维生素溶液为示例性的,可以根据实际情况和微生物选择本领域所公知的对应异养微生物培养基和矿物质维生素。需要注意的是:培养介质中也需要控制碳源浓度,只提供低浓度的、可维持微生物生存的碳源,以控制生物膜厚度。
提供如下两种生物挂膜方法:
方法1:将10mL混合菌液吸入阳极室,补充新鲜培养介质至45mL;在阴极室加入45mL新鲜PBS。使用恒电位器对传感器外加0.3V电压(参考电极:Ag/AgCl),每24h更换一次、合计45mL阳极室内的新鲜培养介质和PBS。当电流连续三个周期(24h为一个周期)保持稳定时,电活性生物膜制备成功,可以进行生物毒性传感检测。
方法2:将碳毡片放置于100mL的混合菌液中,待24h后将负载有菌种的碳毡转移至阳极室中,用新鲜培养介质补充至45mL,在阴极室加入45mL新鲜PBS。使用恒电位器对传感器外加0.3V电压(参考电极:Ag/AgCl),每24h更换一次、合计45mL阳极室内的新鲜培养介质和PBS。当电流连续三个周期(24h为一个周期)保持稳定时,电活性生物膜制备成功,可以进行生物毒性传感检测。
3、检测液体中污染物的生物毒性。采用安培法检测电流变化。测试并计算挂膜完成时的总库伦量,随后在相同条件下将待测液体加入阳极室,计算加入待测液体后的总库伦量。通过比较两个总库伦量的差值,可计算获得微生物抑制率,从而表征待测液体中污染物的生物毒性。
以驯化培养基和培养介质中的碳源为乙酸钠为例,以乙酸钠氧化峰最大电流为标准值计算毒性抑制率。毒性抑制率(IR)计算公式如下:
其中,I为电流,单位A;t为时间,单位为秒(s);Qnon为无外加污染物时总库伦量,Qn为加入待测液体后的总库伦量。实践中,可以先采集水样,使用现有的GC-MS等方法确定水体中新污染物的种类,再使用本方法测定该新污染物在待测水体中的具体生物毒性。
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所获得的数据均为进行至少3次重复后获得的平均值,且各重复获得的均为有效数据。
实施例:各种新污染物的生物毒性检测效果展示
1、制备生物膜传感器。驯化微生物。在室温下将地杆菌、假单胞菌和不动杆菌按3:1:1加入驯化培养基,150r/min震荡培养;所述地杆菌为BMZ134954,所述假单胞菌为CIB-66,所述不动杆菌为BMZ135422。培养至OD600=2.0时,更换新的驯化培养基,重复2~3次。将驯化后的混合菌液6000rpm离心10min,PBS将离心所得的菌体沉淀清洗两次后悬浮在PBS中,得到混合菌液。
驯化培养基:Na2HPO4 4.58g、NaH2PO4·2H2O 2.45g、CH3COONa 1.2g、NH4Cl 0.31g、KCl 0.13g、矿物质1mL,超纯水定容至1L,高压灭菌。
2、微生物挂膜、构建生物膜传感器。搭建双室反应器:在阳极室中填充培养介质,培养介质:Na2HPO4 4.58g;NaH2PO4·2H2O 2.45g、CH3COONa0.5g、NH4Cl 0.31g、KCl 0.13g、矿物质1mL,再加入50mM PBS,将pH值调节为7.0~7.2。将10mL混合菌液吸入工作室,补充新鲜培养基至45mL。在阴极室加入45mL新鲜PBS。使用恒电位器对传感器外加0.3V电压(参考电极:Ag/AgCl),每24h更换一次阳极室内的新鲜培养介质和PBS,每次更换总体积为45mL。当电流连续三个周期保持稳定时,电活性生物膜制备成功。
制备的生物膜电镜扫描图如图2所示。图2A为20微米比例下的生物膜某一断面示意图,图2B为20微米比例下的生物膜另一断面示意图,图2C为40微米比例下的生物膜断面示意图,图2D为30微米比例下的生物膜断面示意图。结果显示,利用本发明方法制备的生物膜,厚度均在10μm以下,最薄为4.5μm以内。
更换微生物进行相同试验:其余条件相同,将假单胞菌CIB-66替换为其它假单胞菌时,生物膜厚度最薄为12.1μm,难以获得10μm以下的生物膜。替换其余微生物对生物膜的厚度影响不大。
3、新污染物生物毒性检测。
分别制备0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、3μg/L、4μg/L的氨苄西林(Amp),0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、3μg/L、4μg/L红霉素(EC),25μg/L、50μg/L、75μg/L、100μg/L的三氯乙酸,25μg/L、50μg/L、75μg/L、100μg/L的三氯乙醛,分别加入生物膜传感器阳极室,检测不同浓度的各污染物的生物毒性,并根据公式分别计算抑制率,得到浓度-抑制率曲线,同时计算IC50。结果如表1和图3~6所示。
表1各污染物的IC50值
污染物 | 氨苄西林 | 红霉素 | 三氯乙醛 | 三氯乙酸 |
IC50(μg/L) | 6.03 | 4.22 | 87.24 | 103.90 |
同时,使用CCK-8试剂盒、基于CCK-8法检测上述各新污染物的生物毒性。具体检测方法为:将细胞悬液(200μL/孔)接种于96孔板,每孔接种4000~5000个细胞。实验组在每个孔中加入细胞悬液和ECs,对照组的孔中只加入细胞悬液。同时在空白对照中加入200μL新鲜培养基。所有孵育均在细胞培养箱(30℃)中孵育24h,在96孔板周围加入一滴PBS以缓解蒸发。在细胞增殖结束时,向每个孔中添加CCK-8(起始培养体积的十分之一),并在细胞培养箱中继续培养1小时。培养结束时,使用酶标记物(Synergy HTX,USA)测量450nm处的吸光度。
用CCK-8方法检测生物毒性抑制率计算公式如,结果如图7所示。
ODt为实验组吸光度,OD0为对照组吸光度,ODck为空白对照组吸光度。
图7左上为氯苄西林浓度与抑制率相关性分析,右上为红霉素浓度与抑制率的相关性分析;左下为三氯乙酸浓度与抑制率的相关性分析;右下为三氯乙醛浓度与抑制率的相关性分析。根据图7,CCK-8法检测红霉素、三氯乙酸和三氯乙醛的拟合相关性均低于0.6,证明其检测低浓度新污染物的准确度较低,不如本发明提供方法。
4、各新污染物的检测极限测试。
使用步骤3相同方法,逐渐降低加入的各新污染物的浓度,测试本发明方法对各污染物的最低检测限。结果如表2所示。
表2各污染物最低检测限
污染物 | 最低检测限(μM) |
青霉素 | 0.001346 |
红霉素 | 0.0006813 |
三氯乙醛 | 0.17391 |
三氯乙酸 | 0.153 |
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种菌制剂,其特征在于:所述菌制剂包括地杆菌(Geobactersulfurreducens)、不动杆菌(Acinetobactersp.)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)。
2.根据权利要求1所述菌制剂,其特征在于:所述假单胞菌为假单胞菌CIB-66,于2022年5月16日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2022638。
3.根据权利要求1所述菌制剂,其特征在于:所述假单胞菌为假单胞菌CIB-66,其16SrDNA如SEQ.ID.NO:1所示。
4.根据权利要求1所述菌制剂,其特征在于:按活菌量,地杆菌:不动杆菌:假单胞菌=3:1:1。
5.权利要求1~4任意一项所述菌制剂在检测污染物生物毒性中的应用。
6.利用权利要求1~4任意一项所述菌制剂制备生物膜的方法,其特征在于:所述方法在制备生物膜时,碳源只提供维持微生物生存的量。
7.利用权利要求1~4任意一项所述菌制剂制备的传感器,其特征在于:所述传感器的阳极电极上接种有所述菌制剂,所述阳极电解液中包括可维持菌制剂正常生长的营养成分。
8.权利要求7所述传感器在检测污染物生物毒性中的应用。
9.根据权利要求8所述应用,其特征在于:所述检测的方法为:待电流稳定后,向阳极加入待检测污染物。
10.根据权利要求9所述应用,其特征在于:所述检测的方法为:加入待检测污染物后,根据电流变化情况判断污染物的生物毒性。
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