CN110607337B - 一种发酵产氢细菌和电活性细菌互养互作的产氢方法 - Google Patents

一种发酵产氢细菌和电活性细菌互养互作的产氢方法 Download PDF

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Abstract

一种发酵产氢细菌和电活性细菌互养互作的产氢方法，具体涉及一种利用发酵产氢细菌与电活性细菌的互养互作及种间电子传递实现高效产氢的方法，属于发酵产氢技术领域。本发明为了解决现有厌氧生物制氢过程受细菌代谢抑制，底物利用不彻底，进而影响产氢效率的问题。本发明将哈尔滨产乙醇杆菌W1和地杆菌PCA进行共培养，利用电活性细菌消耗发酵系统中产氢细菌产生的乙酸和乙醇等末端代谢产物，降低了密闭发酵体系细菌间的代谢抑制，进而促进产氢持续高效进行；并且本方法的碳源可以使用只有发酵产氢菌可以利用的葡萄糖，减轻了底物竞争，制取的氢气产率更大，纯度更高。

Description

一种发酵产氢细菌和电活性细菌互养互作的产氢方法
技术领域
本发明涉及一种发酵产氢细菌和电活性细菌互养互作的产氢方法，具体涉及一种利用发酵产氢细菌与电活性细菌的互养互作及种间电子传递实现高效产氢的方法，属于发酵产氢技术领域。
背景技术
氢能，是一种清洁环保、能量密度高、来源广泛、优于传统矿物燃料的能源。但传统工业制取氢气的方法，如甲烷裂化法、水煤气转化法、水电解法等，成本高，消耗大量资源和能源，并产生严重环境污染。
发酵法生物制氢技术利用厌氧发酵产氢细菌，以有机废水为底物制取氢气，无需外加光源、常温常压下即可稳定进行，在消耗有机废物的同时产生清洁高效的氢气能源，是一种低能耗、可持续的制取氢气方法。但现有厌氧生物制氢过程常受细菌代谢抑制，底物利用不彻底，存在产氢效率低，氢气不纯等问题。因此解决现有厌氧生物制氢方法中存在的受细菌代谢抑制，底物利用不彻底的问题是十分必要的。
发明内容
本发明为解决现有厌氧生物制氢过程受细菌代谢抑制，底物利用不彻底，进而影响产氢效率的问题，提供了一种发酵产氢细菌和电活性细菌互养互作的产氢方法。
本发明的技术方案：
一种发酵产氢细菌和电活性细菌互养互作的产氢方法，该方法的具体操作步骤如下：将哈尔滨产乙醇杆菌(Ethanoligenens harbinense)W1和地杆菌(Geobactersulfurreducens) PCA进行共培养，所述的共培养为将哈尔滨乙醇杆菌W1的接种物和地杆菌PCA的接种物接种至灭菌后的厌氧培养基中，在35℃恒温摇床中震荡培养1小时～5小时产生氢气并收集。
所述的哈尔滨乙醇杆菌W1的接种物的培养操作步骤如下：首先将盛装液体培养基A 的厌氧瓶依次经高温煮沸、纯度为99.99％的高纯N2曝气和高温高压蒸汽灭菌，然后将哈尔滨乙醇杆菌W1接种在该厌氧瓶中，并将其放置在恒温摇床里震荡培养24小时～48小时，得到伴有白色絮状哈尔滨乙醇杆菌W1接种物的淡黄色浑浊菌液，取5ml～50ml淡黄色浑浊菌液，5000r/h离心10分钟，弃上清液，得到哈尔滨乙醇杆菌W1的接种物。并且哈尔滨乙醇杆菌W1接种在该厌氧瓶中，放置在恒温摇床里震荡培养时间不局限于24小时～48小时，培养达到菌液浑浊并伴有白色絮状菌体即可。
每1L所述的液体培养基A由5g～20g的葡萄糖、4.5g的蛋白胨、1.8g的牛肉膏、 6g的NaCl、1.6g的K2HPO4、0.05g的MgCl2·6H2O、0.1ml的体积分数为0.1％的刃天青和0.05g～0.2g的L-半胱氨酸组成。
所述的地杆菌PCA的接种物的培养操作步骤如下：首先将盛装液体培养基B的厌氧瓶经体积比为80:20的N2/CO2混合气曝气并高温高压蒸汽灭菌，然后将地杆菌PCA接种在该厌氧瓶中，并将其放置在恒温摇床里震荡培养12小时～24小时，得到含有地杆菌 PCA接种物的粉红色浑浊菌液，取5ml～50ml粉红色浑浊菌液，5000r/h离心10分钟，弃上清液，得到地杆菌PCA的接种物。并且地杆菌PCA接种在该厌氧瓶中，放置在恒温摇床里震荡培养时间不局限于12小时～24小时，培养达到菌液微红，在波长600nm处的吸光度达到0.9～1.2即可。
每1L所述的液体培养基B由0.3g的KCl、0.5g的NH4Cl、0.6g的NaH2PO4、1.5g 的NaHCO3、0.2g的CH3COONa和1.0g～4.0g的延胡索酸钠组成。
所述的厌氧培养基接种前使用体积比为80:20的N2和CO2混合气曝气并高温高压蒸汽灭菌。
每1L所述的厌氧培养基由5g～20g的葡萄糖、4.5g的蛋白胨、1g的牛肉膏、2g 的NaCl、1.6g的K2HPO4、0.1g的MgCl2·6H2O、0.3g的KCl、0.5g的NH4Cl、0.6g 的NaH2PO4、1.5g的NaHCO3、0.2g的CH3COONa、0.1ml体积分数为0.1％的刃天青和0.05g～0.2g的L半胱氨酸组成。
所述的厌氧培养基配置方法为，将除了L-半胱氨酸外的成分煮沸冷却至室温后，再加入L-半胱氨酸。
每1L所述的厌氧培养基中接入0.01g～0.03g哈尔滨产乙醇杆菌W1的接种物和0.01 g～0.02g地杆菌PCA的接种物。
所述的高压蒸汽灭菌的条件为121℃，维持时间为20分钟。
本发明具有以下有益效果：本发明一种发酵产氢细菌和电活性细菌互养互作的产氢方法，本方法利用电活性细菌消耗发酵系统中产氢细菌产生的乙酸和乙醇等末端代谢产物，降低发酵产氢细菌的代谢抑制，进而促进产氢持续高效进行；并且本方法的碳源可以使用只有发酵产氢菌可以利用的葡萄糖，减轻了底物竞争，因此制取的氢气产率更大，纯度更高。并利用共同培养的发酵产氢细菌与电活性细菌的互养互作及种间电子传递实现高效产氢，与传统方法相比，本发明降低了密闭发酵体系细菌间的代谢抑制，提高底物利用率，进而提高产氢效率，并具有操作简便，适合扩大化的优势。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
下述具体实施例中涉及的哈尔滨产乙醇杆菌(Ethanoligenens harbinense)是2005年邢德峰等分离获得的乙醇型发酵的主要产氢功能细菌，其中菌株W1是一株具有高效的产氢效率强絮凝能力和耐酸特性的细菌，保藏编号为CGMCC1151。地杆菌(Geobactersulfurreducens)PCA是常见于微生物电化学系统，是一种能够利用乙酸生长并进行胞外电子传递的电活性细菌。Bond DR和Lovley DR等人在文章Electricity production byGeobacter sulfurreducens attached to electrodes中有关于这株菌种的记载。
具体实施方式1：本实施方式中提供了一种利用哈尔滨产乙醇杆菌(Ethanoligenens harbinense)W1与地杆菌(Geobacter sulfurreducens)PCA互养互作及种间电子传递高效产氢的方法，该方法的具体操作步骤如下：
(一)采用厌氧培养法培养哈尔滨产乙醇杆菌W1：采用经高温煮沸、纯度为99.99％高纯N2曝气并高温高压蒸汽灭菌后的液体培养基A培养哈尔滨产乙醇杆菌W1，将接种哈尔滨产乙醇杆菌W1后的厌氧瓶放置在恒温摇床里35℃、170rpm下震荡培养，46小时后在厌氧瓶内形成淡黄色浑浊菌液并伴有白色絮状菌体，转速为5000r/h离心10分钟，弃除上清液，得到哈尔滨产乙醇杆菌W1的接种物；
其中，每1L液体培养基A由13g的葡萄糖，4.5g的蛋白胨，1.8g的牛肉膏，6g 的NaCl，1.6g的K2HPO4，0.05g的MgCl2·6H2O，0.1ml的体积分数为0.1％刃天青，0.08 g的L-半胱氨酸组成；
液体培养基A的配置方法为：先加入除L-半胱氨酸外的所有成分并煮沸，待稍微冷却至室温，再加入L-半胱氨酸，溶解定容，然后分装到250mL厌氧瓶中，每瓶150mL，并用多通道曝气针将高纯氮气(99.99％)曝入培养液中，直到培养液由粉红色变为啤酒色，稳定五分钟后将气针取出，瓶口用胶塞封死，最后经过121℃高压蒸汽灭菌，持续时间为20分钟。
(二)采用厌氧培养法培养地杆菌PCA：采用经N2/CO2(N2与CO2体积比为80:20) 混合气曝气并高温高压蒸汽灭菌后的液体培养基B培养地杆菌PCA，将接种地杆菌PCA 的厌氧瓶放置在恒温摇床里35℃、170rpm下震荡培养，20小时后形成粉红色浑浊菌液，转速为5000r/h离心10分钟，弃除上清液，得到地杆菌PCA的接种物；
其中，每1L液体培养基B由0.3g的KCl，0.5g的NH4Cl，0.6g的NaH2PO4，1.5g 的NaHCO3，0.2g的CH3COONa，3.5g的延胡索酸钠组成；
液体培养基B的配置方法为：将所有成分溶解定容，然后分装到250mL厌氧瓶中，每瓶150mL，并用多通道曝气针将N2/CO2(体积比＝80:20)混合气曝入培养液中，持续 20分钟后将气针取出，瓶口用胶塞封死，最后经过121℃高压蒸汽灭菌，持续时间为20 分钟。
(三)将上述步骤中得到的哈尔滨产乙醇杆菌W1的接种物和地杆菌PCA的接种物接种在经N2/CO2(体积比＝80:20)混合气曝气并高温高压蒸汽灭菌后的厌氧培养基中，其中每1L厌氧培养基中接入0.02g哈尔滨产乙醇杆菌W1和0.01g地杆菌PCA，在恒温摇床里35℃、170rpm下震荡培养，瓶口用一次性静脉输液针连接气袋，培养1小时后开始产气，45h左右达到最大产氢速率70mL/L-培养基·h，最终可获得的氢气产率为1.6 mol-氢气/mol-葡萄糖。
其中，每1L厌氧培养基由12g的葡萄糖，4.5g的蛋白胨，1g的牛肉膏，2g的NaCl，1.6g的K2HPO4，0.1g的MgCl2·6H2O，0.3g的KCl，0.5g的NH4Cl，0.6g的NaH2PO4， 1.5g的NaHCO3，0.2g的CH3COONa，体积分数为0.1％的0.1ml刃天青，0.08g的L- 半胱氨酸组成。
厌氧培养基的配置方法为：将所有成分溶解定容，然后分装到250mL厌氧瓶中，每瓶150mL，使用多通道曝气针将N2/CO2(N2和CO2体积比＝80:20)混合气曝入培养液中，持续20分钟后将气针取出，瓶口用胶塞封死，最后经过121℃高压蒸汽灭菌，持续时间为20分钟。
每1L的液体培养基A、液体培养基B和厌氧培养基中均提供微量元素溶液和维生素溶液各6ml。其中，微量元素溶液含有3.0g/L的MgSO4·7H2O，0.1g/L的FeSO4·7H2O， 0.01g/L的H3BO3，1.5g/L的N(CH2COOH)3，0.1g/L的CaCl2·2H2O，0.01g/L的 Na2MoO4·2H2O，0.1g/L的CoCl2·6H2O，0.025g/L的Na2WO4·2H2O，0.5g/L的MnSO4·H2O， 0.01g/L的CuSO4·5H2O。维生素溶液的组成为0.2g/L的维生素H，0.5g/L的维生素B1， 0.5g/L的维生素B5，1g/L的维生素B6，0.001g/L的维生素B12，0.025g/L的核黄素，0.02 g/L的柠檬酸，0.5g/L的硫辛酸，0.5g/L的对氨基苯甲酸。
并且本实施例中摇床培养的方式还可以采用恒温室内的多通道磁力搅拌器搅拌培养的方式替代，培养条件为35℃、120r/min(2cm磁力搅拌子)。
具体实施方式2：本实施方式中提供了哈尔滨产乙醇杆菌(Ethanoligenensharbinense) W1产氢的方法，具体实施方式2与具体实施方式1的主要区别为在步骤(三)中仅接种哈尔滨产乙醇杆菌W1的接种物，其余培养条件及步骤均相同，培养1.5小时后开始产气， 35h左右达到最大产氢速率32.8mL/L-培养基·h，最终可获得的氢气产率为1.08mol-氢气 /mol-葡萄糖。
具体实施方式1与具体实施方式2的产氢效果对比如下表，
Figure BDA0002213322770000051
由上表可知，哈尔滨产乙醇杆菌W1和地杆菌PCA的两菌共培养可以显著缩短产气时长，并且最大产氢速率明显增加，对底物利用率没有不利影响，共培养可以获得更高的氢气产率。

Claims (7)

1.一种发酵产氢细菌和电活性细菌互养互作的产氢方法，其特征在于：该方法的操作步骤为：将哈尔滨产乙醇杆菌(Ethanoligenens harbinense)W1和地杆菌(Geobactersulfurreducens)PCA进行共培养，所述的共培养为将哈尔滨乙醇杆菌W1的接种物和地杆菌PCA的接种物接种至灭菌后的厌氧培养基中，在35℃恒温摇床中厌氧条件下震荡培养1小时～5小时产生氢气并收集；
哈尔滨产乙醇杆菌(Ethanoligenens harbinense)W1的保藏编号为CGMCC1151；
每1L所述的厌氧培养基由5g-20g的葡萄糖、4.5g的蛋白胨、1g的牛肉膏、2g的NaCl、1.6g的K2HPO4、0.1g的MgCl2·6H2O、0.3g的KCl、0.5g的NH4Cl、0.6g的NaH2PO4、1.5g的NaHCO3、0.2g的CH3COONa、0.1ml体积分数为0.1％的刃天青和0.05g-0.2g的L-半胱氨酸组成。
2.根据权利要求1所述的一种发酵产氢细菌和电活性细菌互养互作的产氢方法，其特征在于：所述的哈尔滨乙醇杆菌(Ethanoligenens harbinense)W1的接种物的培养操作步骤如下：首先将盛装液体培养基A的厌氧瓶依次经高温煮沸、纯度为99.99％的N2曝气和高温高压蒸汽灭菌，然后将哈尔滨乙醇杆菌(Ethanoligenens harbinense)W1接种在该厌氧瓶中，并将其放置在恒温摇床里震荡培养24小时～48小时，得到伴有白色絮状的淡黄色浑浊菌液，取5ml-50ml淡黄色浑浊菌液，5000r/h离心10分钟，弃上清液，得到哈尔滨乙醇杆菌(Ethanoligenens harbinense)W1的接种物；
每1L所述的液体培养基A由5g-20g的葡萄糖、4.5g的蛋白胨、1.8g的牛肉膏、6g的NaCl、1.6g的K2HPO4、0.05g的MgCl2·6H2O、0.1ml的体积分数为0.1％的刃天青和0.05g-0.2g的L-半胱氨酸组成。
3.根据权利要求1所述的一种发酵产氢细菌和电活性细菌互养互作的产氢方法，其特征在于：所述的地杆菌(Geobacter sulfurreducens)PCA的接种物的培养操作步骤如下：首先将盛装液体培养基B的厌氧瓶经体积比为80:20的N2和CO2混合气曝气并高温高压蒸汽灭菌，然后将地杆菌(Geobacter sulfurreducens)PCA接种在该厌氧瓶中，并将其放置在恒温摇床里震荡培养12小时-24小时，得到粉红色浑浊菌液，取5ml-50ml粉红色浑浊菌液，转速5000r/h离心10分钟，弃上清液，得到地杆菌(Geobacter sulfurreducens)PCA的接种物；
每1L所述的液体培养基B由0.3g的KCl、0.5g的NH4Cl、0.6g的NaH2PO4、1.5g的NaHCO3、0.2g的CH3COONa和1.0g-4.0g的延胡索酸钠组成。
4.根据权利要求1所述的一种发酵产氢细菌和电活性细菌互养互作的产氢方法，其特征在于：所述的厌氧培养基接种前使用体积比为80:20的N2和CO2混合气曝气并高温高压蒸汽灭菌。
5.根据权利要求1所述的一种发酵产氢细菌和电活性细菌互养互作的产氢方法，其特征在于：所述的厌氧培养基配置方法为，将除L-半胱氨酸以外的成分煮沸并冷却至室温后，再加入L-半胱氨酸。
6.根据权利要求1所述的一种发酵产氢细菌和电活性细菌互养互作的产氢方法，其特征在于：每1L所述的厌氧培养基中接入0.01g-0.03g哈尔滨产乙醇杆菌(Ethanoligenensharbinense)W1的接种物和0.01g-0.02g地杆菌(Geobacter sulfurreducens)PCA的接种物。
7.根据权利要求2、3或4所述的一种发酵产氢细菌和电活性细菌互养互作的产氢方法，其特征在于：所述的高压蒸汽灭菌的条件为121℃，维持时间为20分钟。
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