CN104458607A

CN104458607A - 一种快速检测微生物胞外呼吸活性的方法

Info

Publication number: CN104458607A
Application number: CN201410686040.6A
Authority: CN
Inventors: 温俊林; 周顺桂; 陈俊华; 陆琴
Original assignee: Guangdong Institute of Eco Environment and Soil Sciences
Current assignee: Guangdong Institute of Eco Environment and Soil Sciences
Priority date: 2014-11-24
Filing date: 2014-11-24
Publication date: 2015-03-25

Abstract

本发明公开了一种快速检测微生物胞外呼吸活性的方法。该方法为将微生物菌悬浮液中加入含有四甲基联苯胺和过氧化氢的显色液，使显色反应充分进行；再加入硫酸溶液终止显色反应，将蓝色转变为黄色，用酶标仪检测其OD450nm值，该OD值即为微生物样品的胞外呼吸活性值。本发明方法操作简单、迅速，最快3min可得检测结果，可用于微生物样品的快速检测；且具有很好的特异性，检测结果几乎不受其他常见微生物的影响。

Description

一种快速检测微生物胞外呼吸活性的方法

技术领域

本发明属于微生物检测领域，涉及一种快速检测微生物胞外呼吸活性的方法。

背景技术

微生物胞外呼吸是指在厌氧条件下微生物在胞内氧化有机物释放电子，并且偶联呼吸链将产生的电子传递到胞外受体使其还原的过程。能够接受其电子而被还原的胞外受体种类繁多，包括水溶性的铀，金和银离子，硫酸盐，铁锰矿物和腐殖质等。此外，人造电极也能够接受胞外呼吸过程传递到胞外的电子，从而产生电流。因此，微生物胞外呼吸具有重要的应用价值，在污染物原位修复、污水处理、微生物冶炼、微生物合成及微生物产电等方面表现出重要的应用前景。鉴于胞外呼吸广泛的应用前景，开发低成本快速检测微生物胞外呼吸活性的方法具有重要意义。目前，针对微生物胞外呼吸活性的检测方法，有异化铁还原法，腐殖质还原法和生物电流法。然而，这些方法操作程序复杂而且耗用时间长。

微生物自身携带的酶催化显色反应是进行微生物活性检测的有效方法。在胞外呼吸过程中，微生物氧化有机物产生的电子必须通过复杂电子传递网络传递到达细胞外膜，然后通过外膜上的多血红素细胞色素c传递到胞外。已有研究表明，胞外呼吸菌80％的膜结合的c型细胞色素位于细胞外膜，而且这些c型细胞色素与辣根过氧化物酶具有铁卟啉结构，因此具有相似的过氧化氢酶活性。对现有的技术检索发现，目前还没针对微生物胞外酶开发的检测胞外呼吸活性的方法。因此，利用胞外呼吸菌外膜细胞色素c的过氧化氢酶活性，结合微孔板快速检测技术，可以开发出一种新型微生物胞外呼吸活性快速检测方法。

发明内容

针对现有技术中所存在的不足，本发明通过研究将微生物外膜细胞色素c过氧化氢酶活性的信号放大作用与微孔板快速检测系统相结合，构建了一种快速检测微生物胞外呼吸活性的方法。该方法具有可靠性高，操作简单，检测迅速。

本发明的目的在于提供一种快速检测微生物胞外呼吸活性的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种快速检测微生物胞外呼吸活性的方法，包括以下操作步骤：

1）将待测的微生物菌悬液中加入显色液进行显色反应；

所述显色液含有柠檬酸钠、磷酸氢二钠、四甲基联苯胺和过氧化氢，pH为4～5；

2）往上一步的反应液中加入终止液以终止显色反应，然后检测反应液在450nm处的OD值；

3）结果分析：OD_450nm值越大说明待测微生物胞外呼吸活性越强。

进一步的，上述微生物菌悬液中微生物浓度不小于2×10⁸ cfu/ml。

进一步的，上述微生物菌悬液中的液体为生理盐水或HEPES缓冲液。

进一步的，上述显色液的体积为微生物菌悬液的0.8～1.2倍。

进一步的，上述显色液含有80～120mM柠檬酸钠，180～220mM磷酸氢二钠，0.3～0.35mM四甲基联苯胺和1.8～2.2mM过氧化氢，pH为4～5。

进一步的，上述显色液含有100mM柠檬酸钠，200mM磷酸氢二钠，0.32mM四甲基联苯胺和2mM过氧化氢，pH为4.3。

进一步的，上述显色反应时间为15～25min，温度为18～27℃。

进一步的，上述终止液的体积为显色液体积的0.4～0.6倍。

进一步的，上述终止液为硫酸溶液。

进一步的，上述终止液为1.8～2.2M硫酸溶液。

本发明的有益效果是：

（1）细胞色素c是胞外呼吸菌的关键酶，具有较强的过氧化氢酶活性，能够快速催化过氧化氢快速氧化四甲基联苯胺产生蓝色产物，最快3分钟即可获得检测结果；

（2）本发明方法可采用微孔板检测，能够实现对多个样品同时进行微量、批量、快速地检测；

（3）本发明所述的微生物胞外呼吸活性的检测方法可靠性高，其检测结果与传统的异化铁还原法和生物电流法结果一致。

附图说明

图1为快速检测微生物胞外呼吸活性的示意图；

图2为各微生物中胞外细胞色素c的漫反射光谱图及含量，A为漫反射光谱图，B为胞外细胞色素c的含量；

图3为异化铁还原法和生物电流法检测各微生物胞外呼吸活性结果图；A和B为异化铁还原法检测各微生物胞外呼吸活性结果，C为生物电流法检测的结果；

图4为实施例2检测各微生物胞外呼吸活性的结果；

图5为快速检测法与传统方法的相关分析；

图6为快速检测方法的特异性结果。

具体实施方式

1）将待测的微生物菌悬液中加入显色液进行显色反应；

优选的，上述微生物菌悬液中微生物浓度不小2×10⁸ cfu/ml。

优选的，上述微生物菌悬液中的液体为生理盐水或HEPES缓冲液。。

优选的，上述显色液的体积为微生物菌悬液的0.8～1.2倍。

优选的，上述显色液含有80～120mM柠檬酸钠，180～220mM磷酸氢二钠，0.3～0.35mM四甲基联苯胺和1.8～2.2mM过氧化氢，pH为4～5。

最优选的，上述显色液含有100mM柠檬酸钠，200mM磷酸氢二钠，0.32mM四甲基联苯胺和2mM过氧化氢，pH为4.3。

优选的，上述显色反应时间为15～25min，温度为18～27℃。

优选的，上述终止液的体积为显色液体积的0.4～0.6倍。

优选的，上述终止液为硫酸溶液。

更优选的，上述终止液为1.8～2.2M硫酸溶液。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1：微生物细胞色素c漫反射光谱扫描

（1）微生物悬浮液的制备

将微生物保存液以1:50比例接种于含有5ml无菌LB培养基的试管中，在30℃，转速180rpm振荡培养至对数生长期；将培养菌液以7000g离心5min，倒去上清液收集沉淀，以HEPES缓冲液洗涤3遍；以HEPES缓冲液将菌液浓度调至OD600为0.5左右（约2.5×10⁸ CFU/mL），4℃保存待用。

（2）漫反射光谱扫描

取1cm光径、1ml容积石英比色皿，以1ml HEPES缓冲液为空白，校正积分球紫外的漫反射吸收光谱；将HEPES缓冲液换为微生物菌悬液，记录波长范围300-700 nm的漫反射吸收光谱。根据Kubelka-Munk方程F(R)=(1-R∞)²/(2R∞)=K/S计算微生物细胞色素c含量。

实施例2：快速检测微生物胞外呼吸活性的方法

快速检测微生物（Shewanella oneidensis MR-1, Shewanella putrefaciens SP200, Shewanella decolorationis S12, Pantoea agglomerans MFC-3, Aeromonas hydrophila HS01, Comamonas guandongensis CY01, Pseudomonas aeruginosa PAH-1, Fontibacter ferrireducens SgZ-2, Thauera humireducens SgZ-1, Escherichia coli K12 和 Bacillus subtilis DMS10）胞外呼吸活性方法的示意图如图1所示，具体操作步骤为：

1）在96微孔板中加入100μL按实施例1所述方法制备得到上述各微生物的菌悬液；

2）再在上述96孔板中加入100μL显色液(100mM柠檬酸钠，200mM磷酸氢二钠，0.32mM四甲基联苯胺和2mM过氧化氢，pH 4.3)，室温（18～27℃）显色反应20min；

3）最后加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，用酶标仪检测其在450nm处OD值，即可。

检测结果如图4和表1所示，横坐标为上述进行检测的菌株，纵坐标OD_450nm值代表所测菌株的胞外呼吸活性大小，从图4和表1中可以看出所测菌株胞外呼吸活性从大到小依次为MR-1、SgZ-2、SP200、S12、MFC-3、SgZ-1、CY01、HS01、DMS10、K12、PAH-1。

为了研究胞外细胞色素c是否在本发明方法中起到主要作用，进一步利用漫反射光谱扫描计算微生物胞外细胞色素c的含量，将细胞色素c的含量与本发明方法、传统异化铁还原法和生物电流法所测值做相关分析。

一、微生物胞外细胞色素c的含量的测定

将实施例2中所用到的微生物，按实施例1所述的方法，进行胞外细胞色素c的含量的测定，各微生物在波长300-700nm范围内的漫反射吸收光谱如图2A所示，从图2A中可以看出具有胞外呼吸功能的菌株在410nm处具有吸收峰，而且不同菌株具有不同吸收峰值；再根据Kubelka-Munk方程F(R)=(1-R∞)²/(2R∞)=K/S计算微生物细胞色素c含量，结果如图2B所示，从图2B中可以看出不同菌株的细胞色素c含量不同。

表1所测菌株的细胞色素c含量及胞外呼吸活性值

上述微生物细胞色素c含量与本发明方法所测得的微生物胞外呼吸活性值（见表1）进行相关性分析，结果显示其相关性为0.770（P<0.006）。

二、传统检测微生物胞外呼吸活性的方法

（1）异化铁还原法检测微生物胞外呼吸活性

1）在含有无菌培养基的血清瓶中加入10mM水铁矿和10mM葡萄糖/乳酸，然后分别接入实施例2中所用到的微生物，使菌浓度终为1×10⁷cfu/mL，置于30℃培养12-30天；

2）每个2-5天取样，以5 mM 盐酸提取二价铁，然后以邻二氮杂菲法测定二价铁浓度；

3）以二价铁浓度为纵轴，培养时间为横轴，画图计算回归曲线斜率，该斜率即为所测微生物的胞外呼吸活性。

检测结果如图3A和3B所示，菌株MR-1, SP200, S12和 SgZ-2 具有较强铁还原能力12天还原Fe(III)浓度分别为2.92, 2.51, 2.36 和 1.98 mM；菌株MFC-3, CY01, SgZ-1, HS01 和 PAH-1 铁还原能力较弱，15天还原Fe(III)浓度分别为1.06, 1.68, 0.89, 0.66 和 0.32 Mm；菌株 DMS10 和 K12几乎没有铁还原能力，30天还原Fe(III)浓度分别为0.09 和 0.18 mM。根据所还原的二价铁浓度为纵轴，培养时间为横轴，画图计算回归曲线斜率，该斜率即为所测微生物的胞外呼吸活性值（见表2）。

从表2中可以看出所测菌株胞外呼吸活性从大到小依次为MR-1、SP200、S12、SgZ-2、MFC-3/CY01、SgZ-1、HS01、PAH-1、DMS10、K12。

表2所测菌株胞外呼吸活性菌类的细胞色素c含量及胞外呼吸活性值

上述“一”中各微生物细胞色素c的含量与传统的异化铁还原法所测得的微生物胞外呼吸活性值（见表2）进行相关性分析，结果显示其相关性为0.877（P<0.001）。

生物电流法检测微生物胞外呼吸活性

1）以炭布为阳极，载有铂炭的炭布(7cm²)为阴极制作单室微生物燃料电池，以1000欧姆电阻连接电池阴极和阳极；

2）组装好的微生物燃料电池经检查密封后，分别加入培养基和接入实施例2中所用到的微生物的培养液，以高纯氮气除氧；

3）记录电阻两边电压，并且将电压转换为电流，根据阴极面积计算电流密度；

以电流密度值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制电流密度-时间曲线，且以积分方式计算单位面积的累积转移电荷，该值即为所测微生物胞外呼吸活性。

检测结果如图3C所示，菌株MR-1, SP200, S12 和 SgZ-2产生电流密度为 148-278 mA/m²；菌株MFC-3, CY01, SgZ-1, HS01 和 PAH-1, 产电能力较弱，其生产电流密度为31-47 mA/m²；菌株DMS10 和 K12 几乎没有产电能力，为7.56 和 4.42 mA/m²。

从图3C中可以看出所测菌株胞外呼吸活性从大到小依次为MR-1、SgZ-2、SP200、S12、MFC-3、SgZ-1、HS01/CY01/PAH-1、DMS10、K12。

表3所测菌株胞外呼吸活性菌类的细胞色素c含量及胞外呼吸活性值

上述“一”中各微生物细胞色素c的含量与传统的生物电流法所测得的微生物胞外呼吸活性值（表3）进行相关性分析，结果显示其相关性为0.818（P<0.002）。

综上所述，细胞色素c含量值与本发明方法、传统异化铁还原法和生物电流法所测得的微生物胞外呼吸活性的相关性分别为0.711（P<0.014），0.800（P<0.003）和0.752（P<0.008）。说明细胞色素c在微生物胞外呼吸中具有的关键作用，从而说明了细胞色素c在本发明方法中起到主要作用。

实施例3快速检测微生物胞外呼吸活性的方法

1）待测的微生物菌悬液的制备

将微生物Shewanella oneidensis MR-1保存液以1:50比例接种于含有5ml无菌LB培养基的试管中，在30℃，转速180rpm振荡培养至对数生长期；将培养菌液以7000g离心5min，倒去上清液收集沉淀，以生理盐水洗涤3遍；以生理盐水将菌液浓度调至2.5×10⁸ CFU/mL左右，即为待测的微生物菌悬液，4℃保存待用；

2）将待测的微生物菌悬液中加入显色液进行显色反应

将上述制备的菌悬液加到96孔板中，每孔100μL；以8通道移液器吸取100μL显色液加入96孔板中，发生显色反应，使蓝色产物生成完全；

上述显色液为新鲜配制的，含有100mM柠檬酸钠，200mM磷酸氢二钠，0.32mM四甲基联苯胺和2mM过氧化氢，pH 4.3；

3）以8通道移液器吸取50μL 2M硫酸溶液加入蓝色产物中以终止显色反应，且将蓝色产物转为黄色产物，有酶标仪检测其在450nm处的OD值，该值大小为微生物的胞外呼吸活性的大小。

下面对本发明的快速检测微生物胞外呼吸活性的方法作进一步的效果评估。

一、可靠性

为了确认本发明快速检测微生物胞外呼吸活性方法的可行性。其检测的结果是否与传统的异化铁还原法和生物电流法一致，将本发明方法检测结果分别与传统的异化铁还原法和生物电流法检测结果做相关分析，结果显示本发明方法检测值与传统方法结果一致，相关系数分别为0.929（P<0.01）(见图5A)和0.938（P<0.01）(见图5B)。

二、特异性

分别配制浓度为2.5×10⁸cfu/ml的胞外呼吸菌菌液（S. oneidensis）、大肠杆菌菌液、Bacillus subtilis 菌液，以及空白对照，采用实施例2中的方法检测这些不同菌种的菌液，其OD_450nm值如图6所示，从中可以看出，本发明的快速检测方法对胞外呼吸菌具有明显检测效果。说明本发明方法具有很好的特异性和准确性。

三、与其它微生物胞外呼吸活性检测方法的比较

与文献报道的其它微生物胞外呼吸活性菌检测方法，如微生物燃料电池微阵列法（Hou, H. et al. Microfabricated microbial fuel cell arrays reveal electrochemically active microbes. PLoS ONE 4, e6570 (2009).）（所需时间大于5天）和电致发光法（Yuan S J, Li W W, Cheng Y Y, et al. A plate-based electrochromic approach for the high-throughput detection of electrochemically active bacteria [J]. Nature protocols, 2014, 9(1): 112-119.）（显色产物为固体，需要进行板扫描和图像分析）相比较，本发明方法（最快3min可以得到检测结果，显色产物为可溶性物质，可直接用酶标仪读取OD值）具有更好的检测性能。

综上所述，本发明的快速检测微生物胞外呼吸活性的方法具有可靠性高，检测过程方便、迅速，可用于微生物样品的快速检测；此外，本发明的检测方法具有很好的特异性，常见的其他微生物对检测不产生干扰。

为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。

Claims

1.一种快速检测微生物胞外呼吸活性的方法，其特征在于：包括以下操作步骤：

1）将待测的微生物菌悬液中加入显色液进行显色反应；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的微生物菌悬液中微生物浓度不小于2×10⁸ cfu/ml。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的微生物菌悬液中的液体为生理盐水或HEPES缓冲液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述显色液的体积为微生物菌悬液的0.8～1.2倍。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：所述显色液含有80～120mM柠檬酸钠，180～220mM磷酸氢二钠，0.3～0.35mM四甲基联苯胺和1.8～2.2mM过氧化氢，pH为4～5。

6.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：所述的显色液含有100mM柠檬酸钠，200mM磷酸氢二钠，0.32mM四甲基联苯胺和2mM过氧化氢，pH为4.3。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的显色反应时间为15～25min，温度为18～27℃。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述终止液的体积为显色液体积的0.4～0.6倍。

9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于：所述终止液为硫酸溶液。

10.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于：所述终止液为1.8～2.2M硫酸溶液。