CN105954208A - 一种快速测定微生物外膜蛋白状态的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速测定微生物外膜蛋白状态的装置和方法。该装置包含光源、准直镜、比色皿、比色皿支架、积分球和光纤光谱仪；沿着光轴方向，光源、准直镜、比色皿支架、积分球的入射孔依次排布，其中，准直镜、比色皿支架和积分球的入射孔为紧贴着连接；比色皿设置于比色皿支架上，比色皿宽度不小于积分球的入射孔的直径；积分球通过光纤与光纤光谱仪连接。本发明通过将待检测悬液样品放置于设置于比色皿支架上的比色皿中；光束由光源发出，经准直镜到达比色皿支架，经过待检测悬液样品后发生散射，由积分球捕获散射光，捕获的信号由光纤传导至光纤光谱仪；光纤光谱仪采集到的吸收光谱信号输送到计算机，分析后得到微生物外膜蛋白状态。

Description

一种快速测定微生物外膜蛋白状态的装置和方法
技术领域
本发明属于蛋白检测领域，特别涉及一种快速测定微生物外膜蛋白状态的装置和方法。
背景技术
土壤微生物是驱动元素生物地球化学循环的引擎，其驱动的氧化还原过程是联系不同圈层物质与能量交换的重要纽带。
1987年，美国科学家Derek Lovely首次从沉积物中分离获取了一株能够利用胞外固态物质为电子受体的微生物—金属还原地杆菌GS-15(Geobactermetallireducens GS-15)。1988年，美国科学家Ken Nealson从纽约Oneida湖的沉积物中分离获取了另一株具有相同能力的微生物—希瓦氏奥奈达MR-1(Shewanella oneidensis MR-1)。这两株微生物的发现，开启了胞外呼吸的新领域。
胞外呼吸是指厌氧条件下，微生物在胞内彻底氧化有机物释放电子，产生的电子经胞内呼吸链传递到胞外电子受体，并产生能量维持自身生长的过程。微生物胞外呼吸机制需要从蛋白水平来探究。在胞外电子传递过程中，微生物细胞膜上的细胞色素c(c-type cytochromes，c-Cyts)是最重要的活性物种，电子通过细胞膜上细胞色素c之间的相互作用，从微生物内部传递至细胞外膜，从而完成整个氧化还原反应。鉴于微生物胞外呼吸左右着土壤中矿物的氧化还原，并能够与重金属的迁移转化以及有机污染物的降解相偶联，在生物地球化学过程中具有重要的意义，细胞色素c的研究变得十分关键。
胞外呼吸过程中电子的传递实质上是各物质间的氧化还原，然而，活体细胞色素c的氧化还原状态并不容易测量。常用的分子生物学手段，如RNA表达量分析、转录组分析等，均只能获得细胞色素c的总量变化。鉴于细胞色素c中含有大量血红素基团，该基团在410～419纳米、522纳米以及550纳米处具有较强吸收，可以采用这些吸收峰来测试细胞色素c的状态变化。因此，研究者将细胞色素c进行提取纯化，结合其光谱吸收进行表征，用于胞外电子传递机制的研究。
然而，提取纯化后的细胞色素c与活体微生物外膜上的细胞色素c差异较大，难以反映微生物功能蛋白的真实状态。测试活体微生物细胞色素c，是真实反映微生物功能蛋白状态的关键。但是活体细菌是大颗粒，在溶液中形成悬浊液，入射光经过悬液后发生散射而改变方向，使得大部分透射光无法进入检测器，难以检测实际的透射光量，带来很高的背景吸收误差，普通光谱测试无法顺利进行。积分球是一种能够对处于球内或放在球外并靠近某个窗口处的试样对光的散射或发射进行收集的一种高效率器件，近年来，利用紫外―可见光谱与积分球相连，实现了对散射光的捕获，顺利扣除散射光背景值，降低了基线噪声，从方法学上解决散射光背景吸收问题，活体细胞色素c测试得到应用。利用积分球构建紫外―可见漫透射光谱系统对悬液体系进行光谱测试，Nakamura等首次利用光谱手段获取了希瓦氏菌细胞色素c的氧化还原状态变化。
然而，紫外-可见分光光度计进行宽波段的光谱测试时，必须不断调整波长进行扫描，扫描过程则需要足够的时间。以北京普析通用TU-1901型分光光度计为例，扫描速度设置为“快”，扫描间隔为“1纳米”，从600纳米扫描至300纳米，大约需要70秒。而胞外呼吸微生物外膜细胞色素c状态的变化属于秒级反应。显然利用普通分光光度计搭建的传统慢速漫透射光谱仪无法实现微生物外膜细胞色素c状态变化的实时监测。市面上，光纤光谱仪能够对200-1100nm的整个光谱进行快速数据记录，但是，虽然光纤光谱仪具有快速数据记录的功能，却尚无与光纤光谱仪联用的适用于悬液测试的积分球设备，普通光纤光谱仪对悬液体系进行测试时，将会有非常高的基线噪声，使得测试无法进行。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种快速测定微生物外膜蛋白状态的装置。
本发明的另一目的在于提供一种快速测定微生物外膜蛋白状态的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种快速测定微生物外膜蛋白状态的装置，包含光源、准直镜、比色皿、比色皿支架、积分球和光纤光谱仪；沿着光轴方向，光源、准直镜、比色皿支架、积分球的入射孔依次排布，其中，准直镜、比色皿支架和积分球的入射孔为紧贴着连接；比色皿设置于比色皿支架上，比色皿的宽度不小于积分球的入射孔的直径，从而光源发出的光，是通过比色皿中的待检液体后，才能完全被积分球捕获到；积分球通过光纤与光纤光谱仪连接。
所述的光源包含氘灯与卤灯。
所述的氘灯优选为光谱范围为190-400nm、功率为100W的氘灯。
所述的卤素灯优选为光谱范围为350-2500nm、功率为10W或大于10W的卤素灯。
所述的快速测定微生物外膜蛋白状态的装置还包含变阻器，卤灯与变阻器连接，通过变阻器调节光强度。
所述的比色皿的宽度略大于所述的积分球的入射孔的直径。
所述的积分球为入射孔直径是9mm的积分球。
所述的比色皿为宽度是10mm的比色皿。
所述的比色皿优选为具有如下结构的比色皿：在比色皿的密封塞上设置进样口和出样口，从而在持续测量中的操作更为简便。
所述的进样口的直径优选为1mm。
所述的出样口的直径优选为1mm。
所述的积分球为辐射用积分球。
所述的光纤光谱仪优选为热电制冷型光纤光谱仪。
所述的热电制冷型光纤光谱仪优选为Avantes的AvaSpec-ULS2048L热电制冷型光纤光谱仪。
所述的比色皿与所述的比色皿支架的连接是活动连接。
所述的准直镜设置于光源与比色皿支架之间，选择准直镜直接连接光源与比色皿支架而不使用光纤连接，减少了光源与比色皿之间的光强衰减，达到测试悬液体系所需的光强。
所述的积分球与所述的比色皿支架紧贴相连，有利于减少散射光的损失。
一种快速测定微生物外膜蛋白状态的方法，是使用上述装置实现，包括如下步骤：
(1)将待检测悬液样品放置于设置于比色皿支架上的比色皿中；
(2)光束由光源发出，经准直镜到达比色皿支架，经过待检测悬液样品后发生散射，由积分球捕获散射光，捕获的信号由光纤传导至光纤光谱仪；
(3)光纤光谱仪采集到的吸收光谱信号输送到计算机，分析后得到微生物外膜蛋白状态。
所述的待检测悬液样品优选为通过如下步骤制备得到：
①将待检测的微生物菌悬液用磷酸缓冲液调节浓度；
②将菌悬液置于锥形瓶中，通入惰性气体进行除氧处理；
③配制乳酸钠溶液，通入惰性气体进行除氧处理；
④将步骤②除氧处理后得到的菌悬液和步骤③除氧处理后得到的乳酸钠溶液混合，得到待检测悬液样品。
步骤①中所述的磷酸盐缓冲液为pH＝6.8～7.2、100～200mmol/L的磷酸盐缓冲液；优选为pH＝7、200mmol/L的磷酸盐缓冲液。
所述的磷酸盐缓冲液为磷酸钠缓冲液，即磷酸氢二钠和磷酸二氢钠组成的缓冲液。
步骤①中所述的浓度优选为OD600＝1.0。
步骤②和步骤③中所述的惰性气体优选为氮气。
步骤②和步骤③中所述的除氧处理的时间为大于20分钟。
步骤③中所述的乳酸钠的浓度优选为0.5～1.5mol/L；优选为1mol/L。
步骤④优选为：将3.61ml步骤②除氧处理后得到的菌悬液和0.19ml步骤③除氧处理后得到的乳酸钠溶液混合，得到待检测悬液样品。
所述的微生物优选为Shewanella oneidensis MR-1。
所述的微生物外膜蛋白为细胞色素c。
所述的状态指的是还原状态或氧化状态。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明通过将光源与积分球进行设计，优化连接方式，将积分球与悬液比色皿测试系统相连，使得利用积分球测试悬液光谱吸收的方法能够在光纤光谱仪中进行，将积分球能够获取漫透射光谱信号的优点、和光纤光谱仪进行快速数据记录的优点相结合，成功应用于微生物悬液体系吸收光谱的快速测试，实现了以秒为单位的活体微生物外膜氧化态/还原态细胞色素c的测试。这种测试手段还可用于微生物与可溶性底物反应的悬液体系，进行原位在线测试，以及其它悬浊液化学反应体系的紫外可见吸收光谱快速测试，具有较大的应用价值。具体分析如下：
第一，本发明利用积分球可以对放在球外并靠近窗口处的试样的光的散射进行收集的原理，实现了对悬液体系吸收光谱进行测试的目的，达到满足测试要求的基线背景值。如图3所示。
第二，本发明实现了积分球测试悬液光谱时所需的光强大小，从而实现了利用积分球测试悬液体系的可能。
第三，本发明通过积分球与光纤光谱仪联用，与传统慢速漫透射光谱相比，测试快速，实现秒级甚至100毫秒级采集数据，可以对悬液体系的快速反应进行测试。如图4所示。100毫秒级的意思是：如果只需要测试可见光区的光谱，本发明的装置可以通过调节卤灯光强，获得高强度的可见光，光强增大后，可实现在可见光区的更快速的测试。
第四，在本发明中，卤灯光强可调，可以灵活改变紫外光与可见光的强度差别，实现不同需求的测试。
附图说明
图1是快速测定微生物外膜蛋白状态的装置的结构示意图；其中，1-变阻器、2-光源、3-准直镜、4-比色皿支架、5-积分球、6-光纤、7-光纤光谱仪、8-积分球光入射孔。
图2是改造后的比色皿的结构示意图；其中，9-比色皿，10-密封塞，11-进样口，12-出样口。
图3是四种装置的背景噪声分析果图。
图4是本发明对悬液体系快速反应的测试结果图；其中：图A为使用传统慢速光谱仪得到的结果图；图B为使用本发明装置得到的结果图；图C为图A和B中552nm处峰值随时间变化的结果图，曲线e为由本发明测试得到的数据点，曲线f为由传统慢速漫透射光谱法测试得到的数据点。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种快速测定微生物外膜蛋白状态的装置，如图1所示，包括卤灯光强衰减器1、光源2、准直镜3、比色皿、比色皿支架4、积分球5和光纤光谱仪7；沿着光轴方向，光源2、准直镜3、比色皿支架4、积分球入射孔8依次排布，其中，准直镜3、比色皿支架4和积分球入射孔8为紧贴着连接；比色皿设置于比色皿支架4上，积分球入射孔8与比色皿匹配；积分球5通过光纤6与光纤光谱仪7连接。光源2中包含氘灯与卤灯，其中卤灯部分可以由变阻器1进行光强调节。积分球5为辐照型积分球，其入射孔8经过改造，直径为9mm；比色皿的宽度为10mm。光纤光谱仪7为热电制冷型光纤光谱仪(Avantes公司AvaSpec-ULS2048L热电制冷型光纤光谱仪)。
一种优选的方案中，是对比色皿的密封塞进行改造，使其在持续测量中的操作更为简便，具体如图2所示：在比色皿9的密封塞10上设置进样口11和出样口12。进样口11的直径优选为1mm，出样口12的直径优选为1mm。
一种优选的方案中，光源2中的氘灯光谱范围为190-400nm，卤素灯的光谱范围为350-2500nm，氘灯的功率为100W和卤素灯的功率为10W或大于10W(可调节)。
实施例2
对4种装置的菌体散射光背景噪声进行分析：装置A为单独的光纤光谱仪，装置B为光纤光谱仪搭配常规的积分球套件(即光源通过光纤与比色皿支架(用于可溶性溶液测试的支架)连接、辐射积分球通过光纤和光谱仪连接，比色皿支架设置在辐射积分球的入射孔处)，装置C为传统慢速漫透射光谱仪(搭配积分球的紫外可见分光光度计)，装置D为本发明实施例1提供的装置。
测试过程如下：
(1)将待检测的希瓦氏奥奈达MR-1Shewanella oneidensis MR-1菌(中国海洋微生物菌种保藏管理中心)悬液用pH＝7、200mmol/L的磷酸钠缓冲液调节浓度至OD600＝1.0；
(2)将菌悬液置于锥形瓶中，通入高纯氮进行除氧处理，通气时间大于20分钟；
(3)配制1mol/L的乳酸钠溶液，通入高纯氮进行除氧处理，通气时间大于20分钟；
(4)分别在四种装置的带有聚四氟乙烯密封塞的比色皿中，加入0.19mL浓度为1mol/L的乳酸钠溶液；
(5)将经过通氮气除氧后的菌悬液3.61mL加入至已添加乳酸钠溶液的比色皿中，迅速盖上密封塞；
(6)放置一分钟之后，将装有待检测悬液样品的比色皿放置于比色皿支架上；
(7)各装置的运行过程如下：
①装置A：光束由光源发出，经光纤到达比色皿支架(Avantes公司CUV-UV/VIS比色皿支架)，经过待检测悬液样品后发生散射，散射后的光由光纤传导至光纤光谱仪；光纤光谱仪采集到的吸收光谱信号输送到计算机，分析后得到微生物外膜蛋白状态。
②装置B：光束由光源发出，经光纤到达比色皿支架(Avantes公司CUV-UV/VIS比色皿支架)，经过待检测悬液样品后发生散射，由辐射积分球(Avantes公司AvaSphere-30-IRRAD)捕获散射光，捕获的信号由光纤传导至光纤光谱仪；光纤光谱仪采集到的吸收光谱信号输送到计算机，分析后得到微生物外膜蛋白状态。
③装置C：传统慢速光谱仪进行光谱扫描，扫描完成后，获得300-600nm的吸光值，分析后得到微生物外膜蛋白状态。
④装置D：光束由光源发出经准直镜到达比色皿支架，经过待检测悬液样品后发生散射，由积分球捕获散射光，捕获的信号由光纤传导至光纤光谱仪；光纤光谱仪采集到的吸收光谱信号输送到计算机，分析后得到微生物外膜蛋白状态。
(8)检测结果如图3所示，其中装置A-D测试得到的菌体散射背景值分别依次对应曲线a-d，可见，a、b两条线菌体散射背景值很高，无法测试；d结果达到c结果类似的效果，即本发明装置测试所得的菌体散射背景值达到与传统慢速漫透射光谱仪相似的效果，满足测试要求。
注：在样品悬液的检测中，由于悬液对光的散射，很多未被吸收的散射光同样没有进入检测器，这部分光被光谱仪误认为是“吸收光”，因此光谱仪认为“吸收值”很高，即带来了很高的背景值；而积分球收集了这些散射光，使得光谱仪正确地识别了“吸收光”的多少，减少了背景值，即“菌体散射背景值”。
实施例3
一、使用本发明装置检测微生物外膜蛋白状态，为使用实施例1的装置实现，使用普通比色皿，具体包括如下步骤：
(1)将待检测的希瓦氏奥奈达MR-1Shewanella oneidensis MR-1菌(中国海洋微生物菌种保藏管理中心)悬液用pH＝7、200mmol/L的磷酸钠缓冲液调节浓度至OD600＝1.0；
(2)将菌悬液置于锥形瓶中，通入高纯氮进行除氧处理，通气时间大于20分钟；
(3)配制1mol/L的乳酸钠溶液，通入高纯氮进行除氧处理，通气时间大于20分钟；
(4)在带有聚四氟乙烯密封塞的比色皿中，加入0.19mL浓度为1mol/L的乳酸钠溶液；
(5)将经过通氮气除氧后的菌悬液3.61mL加入至已添加乳酸钠溶液的比色皿中，迅速盖上密封塞；
(6)迅速将装有待检测悬液样品的比色皿放置于比色皿支架上；
(7)光束由光源发出，经准直镜到达比色皿支架，经过待检测悬液样品后发生散射，由积分球捕获散射光，捕获的信号由光纤传导至光纤光谱仪；
(8)光纤光谱仪采集到的吸收光谱信号输送到计算机，分析后得到微生物外膜蛋白状态。
二、使用传统慢速光谱仪检测微生物外膜蛋白状态
(1)将待检测的Shewanella oneidensis MR-1菌悬液用pH＝7，200mmol/L的磷酸钠缓冲液调节浓度至OD600＝1.0；
(2)将菌悬液置于锥形瓶中，通入高纯氮进行除氧处理，通气时间大于20分钟；
(3)配制1mol/L的乳酸钠溶液，通入高纯氮进行除氧处理，通气时间大于20分钟；
(4)在带有聚四氟乙烯密封塞的比色皿中，加入0.19mL浓度为1mol/L的乳酸钠溶液；
(5)将经过通氮气除氧后的菌悬液3.61mL加入至已添加乳酸钠溶液的比色皿中，迅速盖上密封塞；
(6)迅速将装有待检测悬液样品的比色皿放置于传统慢速光谱仪的比色皿支架上；
(7)传统慢速光谱仪进行光谱扫描，扫描完成后，获得300-600nm的吸光值，分析后得到微生物外膜蛋白状态。
三、检测结果，如图4所示：图A为使用传统慢速光谱仪得到的结果，图B为使用本发明装置得到的结果，图C为图A和B中552nm处峰值(552nm处峰值代表细胞色素c还原态的吸收)随时间变化的情况。可见，使用传统慢速光谱仪(图A、C)，70s之内只获得了两个数据点；使用本发明装置(图B、C)，顺利监测到了24s内Shewanella Oneidensis MR-1的外膜细胞色素c在乳酸钠存在条件下的光谱变化情况。结论：本发明与传统慢速漫透射光谱相比，测试快速，实现了秒级的数据采集，顺利获得了Shewanella oneidensis MR-1在乳酸钠存在条件下外膜细胞色素c被还原的快速动态过程，对于其动力学研究具有重要意义，而传统方法无法捕捉动态过程。
实施例4
一种快速测定微生物外膜蛋白状态的方法，为使用实施例1的装置实现，使用改造后的比色皿，具体包括如下步骤：
(1)将待检测的Shewanella oneidensis MR-1菌悬液用pH＝7，200mmol/L的磷酸钠缓冲液调节浓度至OD600＝1.0。
(2)将菌悬液置于锥形瓶中，通入高纯氮进行除氧处理，通气时间大于20分钟；
(3)配制1mol/L的乳酸钠溶液，通入高纯氮进行除氧处理，通气时间大于20分钟；
(4)将经过通氮气除氧后的菌悬液3.61mL加入至已添加乳酸钠溶液的比色皿中，盖上特制密封塞；
(5)将塞好密封塞的比色皿放置于比色皿支架上；
(6)光束由光源发出，经准直镜到达比色皿支架，经过待检测悬液样品后发生散射，由积分球捕获散射光，捕获的信号由光纤传导至光纤光谱仪；
(7)光纤光谱仪采集到的吸收光谱信号输送到计算机，分析后得到微生物外膜蛋白状态；
(8)在光谱仪持续测量的同时，利用注射器，在密封塞的进样口注入0.19mL浓度为1mol/L的乳酸钠溶液，多出的样品在密封塞的出样口溢出，作为废液；
(9)光谱仪持续监测微生物外膜蛋白状态，获得外膜细胞色素c氧化还原状态秒级的变化情况。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种快速测定微生物外膜蛋白状态的装置，其特征在于：包含光源、准直镜、比色皿、比色皿支架、积分球和光纤光谱仪；沿着光轴方向，光源、准直镜、比色皿支架、积分球的入射孔依次排布，其中，准直镜、比色皿支架和积分球的入射孔为紧贴着连接；比色皿设置于比色皿支架上，比色皿宽度不小于积分球的入射孔的直径；积分球通过光纤与光纤光谱仪连接。
2.根据权利要求1所述的快速测定微生物外膜蛋白状态的装置，其特征在于：所述的光源包含氘灯与卤灯。
3.根据权利要求2所述的快速测定微生物外膜蛋白状态的装置，其特征在于：还包括变阻器，卤灯与变阻器连接；
所述的氘灯为光谱范围为190-400nm、功率为100W的氘灯；
所述的卤素灯为光谱范围为350-2500nm、功率为不小于10W的卤素灯。
4.根据权利要求1～3任一项所述的快速测定微生物外膜蛋白状态的装置，其特征在于：
所述的积分球为入射孔直径是9mm的积分球；
所述的比色皿为宽度是10mm的比色皿。
5.根据权利要求4所述的快速测定微生物外膜蛋白状态的装置，其特征在于：
所述的积分球为辐射用积分球；
所述的光纤光谱仪为热电制冷型光纤光谱仪。
6.根据权利要求5所述的快速测定微生物外膜蛋白状态的装置，其特征在于：
所述的热电制冷型光纤光谱仪为Avantes的AvaSpec-ULS2048L热电制冷型光纤光谱仪；
所述的比色皿为具有如下结构的比色皿：在比色皿的密封塞上设置进样口和出样口。
7.一种快速测定微生物外膜蛋白状态的方法，其特征在于：是使用权利要求1～6任一项所述的装置实现，包括如下步骤：
(1)将待检测悬液样品放置于设置于比色皿支架上的比色皿中；
(2)光束由光源发出，经准直镜到达比色皿支架，经过待检测悬液样品后发生散射，由积分球捕获散射光，捕获的信号由光纤传导至光纤光谱仪；
(3)光纤光谱仪采集到的吸收光谱信号输送到计算机，分析后得到微生物外膜蛋白状态。
8.根据权利要求7所述快速测定微生物外膜蛋白状态的方法，其特征在于：所述的待检测悬液样品为通过如下步骤制备得到：
①将待检测的微生物菌悬液用磷酸缓冲液调节浓度；
②将菌悬液置于锥形瓶中，通入惰性气体进行除氧处理；
③配制乳酸钠溶液，通入惰性气体进行除氧处理；
④将步骤②除氧处理后得到的菌悬液和步骤③除氧处理后得到的乳酸钠溶液混合，得到待检测悬液样品。
9.根据权利要求8所述快速测定微生物外膜蛋白状态的方法，其特征在于：
步骤①中所述的磷酸盐缓冲液为pH＝6.8～7.2、100～200mmol/L的磷酸盐缓冲液；
步骤①中所述的浓度为OD600＝1.0；
步骤②和步骤③中所述的惰性气体为氮气；
步骤②和步骤③中所述的除氧处理的时间为大于20分钟；
步骤③中所述的乳酸钠的浓度为0.5～1.5mol/L；
步骤④为：将3.61ml步骤②除氧处理后得到的菌悬液和0.19ml步骤③除氧处理后得到的乳酸钠溶液混合，得到待检测悬液样品。
10.根据权利要求7所述快速测定微生物外膜蛋白状态的方法，其特征在于：
所述的微生物外膜蛋白为细胞色素c；
所述的状态指的是还原状态或氧化状态。
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