CN108139327A - 在线过程监测 - Google Patents

Abstract

一种分析样本的方法，包括在样本上执行样本询问循环以产生重复分析结果。通过以下步骤执行每一个样本询问循环：用不同波长的两个或更多个荧光激发信号照射样本；并且，检测样本对于该两个或更多个荧光激发信号中的每一个的荧光发射光谱分布和荧光寿命曲线两者，以产生该样本的两个或更多个荧光发射光谱分布和两个或更多个荧光寿命曲线。每一个重复分析结果包括对于样本询问循环中的相应一个样本询问循环产生的两个或更多个荧光发射光谱分布和两个或更多个荧光寿命曲线。该方法包括执行重复分析结果与预定光谱关系的比较。该方法包括基于重复分析结果与预定光谱关系的比较结果确定该样本的目标分析物浓度。

Description

在线过程监测

技术领域

本文所述的示例性实施方式涉及在线过程监测。

背景技术

除非另外指明，背景技术部分中描述的材料并不是本申请中的权利要求的现有技术，并不因为将它们包含在本部分中而承认为是现有技术。

许多公司希望用能够在生产过程中监测产品质量的系统取代它们现有的质量控制实验室。先进的测试和诊断系统不断变得体积更小、更灵敏并且鲁棒得足以在核心实验室环境之外进行应用。这一趋势在临床和工业市场中一直在稳步增长。临床诊断可以立即在医生办公室和急诊室对患者进行，而实验室检查结果则需要等待数天。许多工业公司正在推进使用系统实时监测产品配方和质量，以提高生产效率和灵活性。直到最近，这些进展主要限于化学和材料测试领域，因为这些测试非常精确并且可重复。

相比之下，微生物学测试是复杂的。活生物体并不总是以可预测的方式来反应。因此，微生物学测试一般保持“在实验室中(in the lab)”进行而不是“在现场(on thefloor)”进行。检测活生物体的微生物学测试通常是劳动密集型、高成本并且缓慢的。根据进行测试的类型，通常在2-14天或更长时间后才能收到结果。微生物学测试可能是对于产品成分和产品质量这两者的关键性测量，并且通常在法律上需要这些测试来证明产品的安全性。由于这些微生物学测试效率低下并且存在延迟，工业界和监管部门都希望将测试从追溯性的、基于实验室的测试变为实时监测。

本文要求保护的主题不限于解决任何如上所述的缺点的实施方式，或者仅在如上所述的环境中操作的实施方式。相反，仅提供此背景技术来说明其中可实践本文所述的一些实施方式的一个示例性技术领域。

发明内容

提供本发明内容是为了以简化的形式介绍将在以下具体实施方式中进一步描述的一些概念。本发明内容并非旨在认定所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在用作确定所要求保护主题的范围的辅助手段。在一个示例性实施方式中，一种分析样本的方法包括在该样本上执行多个样本询问(interrogation)循环以产生多个重复分析结果(replicate)，其中通过以下步骤执行每一个样本询问循环：用不同荧光激发波长的两个或更多个荧光激发信号照射该样本；检测该样本对于所述两个或更多个荧光激发信号中的每一个荧光激发信号的荧光发射光谱分布，以产生该样本的两个或更多个荧光发射光谱分布；以及，检测该样本对于所述两个或更多个荧光激发信号中的每一个荧光激发信号的荧光寿命曲线，以产生该样本的两个或更多个荧光寿命曲线。每一个重复分析结果包括对于所述样本询问循环中的相应一个样本询问循环产生的两个或更多个荧光发射光谱分布和两个或更多个荧光寿命曲线。该方法还包括执行重复分析结果与多个预定光谱关系的比较。该方法还包括基于重复分析结果与预定光谱关系的比较结果确定该样本的目标分析物(target analyte)浓度。

在另一个示例性实施方式中，一种分析样本的方法包括在样本上执行样本询问循环以产生重复分析结果，其中通过以下步骤执行样本询问循环：用不同荧光激发波长的两个或更多个荧光激发信号照射该样本；检测该样本对于所述两个或更多个荧光激发信号中的每一个荧光激发信号的荧光发射光谱分布，以产生该样本的两个或更多个荧光发射光谱分布；以及，检测该样本对于所述两个或更多个荧光激发信号中的每一个荧光激发信号的荧光寿命曲线，以产生该样本的两个或更多个荧光寿命曲线。该重复分析结果包括对于该样本询问循环产生的两个或更多个荧光发射光谱分布和两个或更多个荧光寿命曲线。该方法还包括执行重复分析结果与多个预定光谱关系的比较。该方法还包括基于重复分析结果与预定光谱关系的比较结果来确定该样本的目标分析物浓度。

在另一个示例性实施方式中，分析样本的过程监测器包括：样本区、两个或更多个荧光激发源、一个或多个检测器以及控制器。样本存在于样本区中。两个或更多个荧光激发源光学地耦接到样本区。一个或多个检测器光学地耦接到在由两个或更多个荧光激发源发射的两个或更多个荧光激发信号中的每一个荧光激发信号的光路之外的样本区。控制器通信地耦接到两个或更多个荧光激发源中的每一个荧光激发源和一个或多个检测器，并且被配置为控制过程监测器(包括两个或更多个荧光激发源和一个或多个检测器)执行各种操作。这些操作包括在样本上执行多个样本询问循环以产生多个重复分析结果，其中通过以下步骤执行每一个样本询问循环：使用两个或更多个荧光激发源，用不同荧光激发波长的两个或更多个荧光激发信号照射样本；使用一个或多个检测器检测样本对于所述两个或更多个荧光激发信号中的每一个荧光激发信号的荧光发射光谱分布，以产生样本的两个或更多个荧光发射光谱分布；以及，使用一个或多个检测器检测样本对于所述两个或更多个荧光激发信号中的每一个荧光激发信号的荧光寿命曲线，以产生样本的两个或更多个荧光寿命曲线。每一个重复分析结果包括对于样本询问循环中的相应一个样本询问循环产生的两个或更多个荧光发射光谱分布和两个或更多个荧光寿命曲线。该操作还包括执行重复分析结果与多个预定光谱关系的比较。该操作还包括基于重复分析结果与预定光谱关系的比较结果来确定样本的目标分析物浓度。

本公开的附加特征和优点将在下面的描述中进行阐述，并且将部分地从描述中变得显而易见，或者可以通过本公开的实践而得到教导。本公开的特征和优点可以通过在所附权利要求书中特别指出的手段和组合来实现和获得。从以下描述和所附权利要求书中，本公开的这些和其他特征将变得更加彻底地显而易见，或者可以通过如下所述的本公开的实践而得到教导。

附图说明

为了进一步阐明本公开的上述和其他优点和特征，将通过参考在附图中示出的其具体实施方式来呈现本公开的更具体描述。可以理解的是，这些附图仅描绘了本公开的典型实施方式，并且因此不认为是对其范围的限制。将通过使用附图根据额外的特征和细节来描述和解释本公开，其中：

图1是描绘了一些系统如何区分目标分析物与干扰颗粒的图示；

图2是响应于特定荧光激发波长的各种目标分析物和干扰物质的荧光发射光谱分布的图示；

图3是响应于两个不同荧光激发波长的两种目标分析物的荧光发射光谱分布的图示；

图4是由于两个不同荧光激发波长的目标分析物和干扰物质的荧光发射光谱分布的图示；

图5是目标分析物和干扰物质对于340nm荧光激发波长和613nm荧光发射波长的荧光寿命曲线的图示；

图6示出了一种示例性过程监测器；

图7是分析一种例如在图6的样本区内的流体样本的方法的流程图；

图8示出了与图7的方法相关联的各种图示；

图9示出了图6的过程监测器和/或其一些部分的示例性实现；

图10示出了图6的过程监测器和/或其一些部分的另一个示例性实现；

图11示出了图6的过程监测器和/或其一些部分的另一个示例性实现；

图12示出了图6的过程监测器和/或其一些部分的另一个示例性实现；

图13示出了图6的过程监测器和/或其一些部分的另一个示例性实现；

图14示出了图6的过程监测器和/或其一些部分的另一个示例性实现；以及

图15示出了图6的过程监测器和/或其一些部分的另一个示例性实现，

这些附图全部是根据本文所述的至少一个实施方式来布置的。

具体实施方式

一些在线的水生物负荷监测系统是基于液体颗粒计数技术，并附加了荧光检测。由于受监测的水系统中的干扰物质影响产生假阳性结果，这些系统受到了不能满足灵敏度和准确度要求的严重挑战。干扰物质可以包括诸如聚四氟乙烯、橡胶、塑料、不锈钢、红铁粉等微观颗粒的物质。这些干扰物质可能会产生干扰，因为它们可能具有与目标分析物(例如微生物)相似的尺寸从而产生相似的尺寸测定结果，和/或它们可能具有与在这些系统中响应于荧光激发信号的目标分析物相似的光谱分布。这些系统通常包括单个激发源，其在单个荧光激发波长(或者更具体地，相对窄的波长带)，有时称为激发通道上发射荧光激发信号。

这些系统根据以下假设运行。首先，必须检测到一个颗粒(米氏散射)。其次，来自目标分析物的自身荧光在特定时间和荧光强度范围内明显不同于干扰物质的自身荧光；来自目标分析物的荧光发射可以称为荧光信号。第三，来自水中其他物质/化学品的背景荧光不会掩盖目标分析物的荧光信号。

图1是描绘了这些系统如何区分目标分析物与干扰颗粒的图示。具体地，这些系统将荧光激发信号发射到水中，并同时检测荧光信号、散射光信号和颗粒尺寸。荧光信号和散射光信号中的每一个可以包括对应于所检测到的颗粒的、作为时间的函数的峰值。荧光信号的每一个峰的值可以指示相应颗粒的荧光强度。散射光信号的每一个峰的值可以指示相应颗粒的尺寸。那些具有在生物荧光强度范围(在图1中所标记的“荧光强度范围”)内的荧光强度并且具有在一定比率范围内(未示出)的尺寸与荧光强度比率(size-to-fluorescence intensity ratio)的颗粒可以确定为目标分析物(在图1中称为“生物颗粒”)。那些具有在所述生物荧光强度范围外的荧光强度和/或具有在所述比率范围外的尺寸与荧光强度比率的颗粒可以确定为干扰颗粒(在图1中称为“非生物颗粒”)。

目标分析物和干扰物质相似的尺寸和定向可能对那些利用颗粒尺寸作为区分因素的系统造成混淆。另外，目标分析物和干扰物质相似的荧光发射光谱分布可能对那些利用荧光强度作为区分因素的系统造成混淆。

可以通过并入多个激发源——其有不同荧光激发波长和多个产生的荧光发射光谱分布——来稍微改善这些系统。然而，如果目标分析物和干扰物质具有相似的自身荧光特性，则可能会破坏区分它们的能力。

能否区分目标分析物和干扰物质可能是对于使用颗粒尺寸作为区分因素的单荧光激发波长系统的一个显著的挑战，因为微观球体、薄片和微生物在尺寸、形状、荧光发射光谱和强度方面可能是相似的。具体地，来自干扰物质的荧光发射光谱分布会干扰目标分析物的荧光发射光谱分布。例如，图2是响应于特定荧光激发波长的各种目标分析物和干扰物质的荧光发射光谱分布的图示。如图2中所示，干扰物质“聚苯乙烯微球体”被描绘出的荧光发射光谱分布明显与目标分析物“酪氨酸”和“色氨酸”被描绘出的荧光发射光谱分布重叠，并且可能干扰对目标分析物“酪氨酸”和“色氨酸”被描绘出的荧光发射光谱分布的检测。类似地，干扰物质“聚合物”的各种被描绘出的荧光发射光谱分布明显与目标分析物“NADH”被描绘出的荧光发射光谱分布重叠，并且可能干扰对目标分析物“NADH”被描绘出的荧光发射光谱分布的检测。在图2中，目标分析物“核黄素”被描绘出的荧光发射光谱分布是唯一一个没有明显与干扰物质的荧光发射光谱分布重叠的荧光发射光谱分布。

上述系统全部使用连续的单波长激发源。这些系统首先通过米氏散射检测一颗粒，随后尝试辨别来自所述颗粒的自身荧光是否独特得足以将所述颗粒分类为目标分析物。这些系统会受到干扰物质颗粒的混淆，所述干扰物质颗粒的尺寸和荧光与目标分析物过于相似以至于不能将它们与目标分析物区分开。这产生了假阳性结果，该结果则反过来又会产生不可靠的数据和进行不必要的工厂调查，此类工厂调查可能是成本非常高昂的。工业界仍在寻求一种比目前所用的上述系统更可靠、准确、灵敏的在线水生物负荷监测的解决方案。

在一些情况下，多波长荧光激发可以比单波长激发提供在目标分析物之间更大的区分能力。例如，图3是响应于两个不同荧光激发波长——266纳米(nm)和351nm——的两种目标分析物的荧光发射光谱分布的图示。在266nm的荧光激发波长下，难以区分两种目标分析物“真菌孢子”和“枯草芽孢杆菌黑色变种(B.subtilis var.niger)”的荧光发射光谱分布。在351nm的荧光激发波长下，区分两种目标分析物的荧光发射光谱分布要容易得多，这是因为目标分析物“枯草芽孢杆菌黑色变种”的荧光发射光谱分布的峰值总体上比目标分析物“真菌孢子”的荧光发射光谱分布的峰值移动到了更长的波长处。可供选择地或另外地，多波长荧光激发——其也可以称为多光谱分析——还能够区分生物物种、亚种和潜在的个体菌株，以供在工厂调查中进一步使用。多光谱分析也可以适用于其他监测应用，诸如监测活性成分、酶、赋形剂等的浓度。

诸如上述利用连续的激发源的系统可能被固有背景噪声所混淆，并且因此可能需要增加激发功率以将目标信号与噪声区分开。如果干扰物质具有与目标分析物类似的发射特性，则这可能对灵敏度造成问题。例如，图4是由于两个不同荧光激发波长(图4中的“激发波长#1”和“激发波长#2”)的目标分析物和干扰物质的荧光发射光谱分布401到404的图示。荧光发射光谱分布401和402分别表示目标分析物对激发波长#1和激发波长#2的荧光光谱响应。荧光发射光谱分布403和404分别表示干扰物质对激发波长#1和激发波长#2的荧光光谱响应。如图4中所示，在目标分析物的荧光发射光谱分布401和402与干扰物质的荧光发射光谱分布403和404之间存在明显的重叠，并且在这个示例中可能没有足够的分辨率在任一荧光激发波长下有效地区分目标分析物和干扰物质。因此，即使在使用多光谱分析的系统中，干扰物质也可能产生假阳性。可供选择地或另外地，降低激发功率可能导致灵敏度不可接受。在本文所述的一些实施方式中，脉冲激发信号和先进光学器件的使用可以显著改善感兴趣的应用的信噪比。

时间分辨荧光光谱学是一种用于研究荧光目标分析物的发射动态的技术，例如在荧光团的电子激发与由于激发态产生发射光子的电子辐射衰变之间的时间分布。这种分布的时间范围称为目标分析物的荧光寿命。

荧光寿命可能是用于区分目标分析物和干扰物质的明显属性。例如，据报告生物荧光团的荧光寿命通常小于4纳秒，而干扰荧光团的荧光寿命据报告通常为5到20纳秒或更长。在图5中描绘了这种差异，图5是目标分析物和干扰物质对于340nm荧光激发波长和613nm荧光发射波长的荧光寿命曲线的图示。从图5可以看出，目标分析物的荧光寿命曲线(在图5中标记为“短寿命荧光”)在时间上比干扰物质的荧光寿命曲线(在图5中标记为“长寿命荧光”)短得多。使用时间曲线来区分在不同目标分析物之间的和/或目标分析物与干扰物质之间的差异可以在下文中称为多时间分析(multitemporal profiling)。

因此，本文所述的实施方式实现了多光谱分析和多时间分析两者，统称为多变量方法或多变量分析。本文所述的一些实施方式构成了对样本内的复杂荧光分布的更完整(多变量)的描述。可以通过将离散多光谱分布和时间衰减曲线的多个重复结果拟合到光谱关系的数据库中来获得这种描述。在这些和其他的实施方式中，由于例如目标分析物的浓度相对较低，因此检测到的信号的信号强度可能相对较弱。本文所述的实施方式可以通过使用高速的多重复分析来产生足够的信号质量，从而提高信号质量，如下面更详细描述的。

一些实施方式可以包括多路复用检测器组件和高速信号处理电子器件，以针对多个样本询问循环中的每一个样本询问循环来最大化或提高特定于检测通道的信噪比。多路复用检测器组件和高速信号处理电子器件可促进快速分析循环，以促进在短分析时间段内进行重复分析，并使信噪比最大化或至少增强信噪比。另外，可以从样本中获取数据而不需要实施激发事件来获取系统的基线或背景噪声，其可以用于补偿不是询问事件的主动部分的、系统固有的偏差或噪声。

一些实施方式可以输送样本的瞬时或实时(或接近瞬时或接近实时)的光谱分析，并且在亚毫秒循环中执行分析的多次重复以提高统计学置信度。因此，本文所述的一些监测系统可以具有用于在线、近线(at-line)和实验室水生物负荷监测应用所需的灵敏度、准确度、特异性、精度以及鲁棒性。可供选择地或另外地，本文所述的监测系统可以包括“调整”系统以检测和量化特定目标分析物，诸如活性成分和无菌监测应用的能力。对系统进行调整可以包括在特定系统矩阵(specific system matrix)中评估目标分析物的纯样本以产生识别标记或指纹(fingerprint)。对系统进行调整还可以包括利用统计程序将来自系统的观测数据转换为如在主成分分析中的或基于相似特征向量的多变量分析中的相关或不相关的变量。可供选择地或另外地，可以利用人工智能学习算法来确定光谱关系，和/或评估一个或多个目标分析物和/或干扰物质的特征响应标记或指纹的检测信号。

在本文所述的一些实施方式中，目标分析物和干扰物质的荧光衰减速率的差异可以是一种在感兴趣的工业应用中有价值的区分手段。一些实施方式可以检测这种差异并且将时间分析添加到多个激发波长(或激发通道)和特定发射检测波长子带(或检测通道)的多光谱维度。一些实施方式可以在少于500纳秒(ns)内完成该多变量分析循环，允许当目标位于样本分析区内时完成和比较多个重复分析(例如>10个)。

现在将参考附图来描述本发明的一些示例性实施方式的各个方面。附图是对这些示例性实施方式的图解和示意图，并且既不是对本发明的限制，也不必按比例绘制。

图6示出了根据本文所述的至少一个实施方式布置的示例性过程监测器600。可以实现过程监测器600来用于在线水生物负荷监测(例如监测水中的生物负荷)和/或用于监测其他流体、气体或类似物中的其他目标分析物。目标分析物的示例包括微生物、活性成分、酶、赋形剂或其他目标分析物。

过程监测器600可以包括控制器602、多个荧光激发源604，以及一个或多个检测器606。控制器602可以可通信地耦接到荧光激发源604、检测器606和/或一个或多个驱动器电路、放大器电路或其他部件以控制过程监测器600的操作。控制器602可以包括处理器、微处理器、微控制器、数字信号处理器(DSP)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)或其他合适的控制器。

每一个荧光激发源604可以配置为以不同的荧光激发波长发射荧光激发信号608。每一个荧光激发源604可以包括发光二极管(LED)、激光二极管(诸如垂直空腔表面发射激光器(VCSEL)或边缘发射半导体激光器)，或者被配置为以期望的荧光激发波长发射荧光激发信号608并具有相对较短的下降时间的其他合适的荧光激发源。相对较短的下降时间可以包括小于几纳秒的下降时间、小于或等于大约1.5ns的下降时间、亚纳秒级的下降时间或者甚至更短的下降时间。在至少一个实施方式中，荧光激发源604中的一个可以以405nm或其他合适的波长发射，而所述激发源604中的另一个可以以635nm或其他合适的波长发射。在图6中仅示出了两个激发源604，但是作为备选方案，过程系统600可以包括以不同的荧光激发波长发射的三个、四个、五个或甚至更多个激发源604。

控制器602可以配置为以高频率循环所述荧光激发源604，从而例如以有限的脉冲宽度顺序地发射相应的荧光激发信号608，而不是像在上面所述的一些其他系统中那样使用单个连续波信号。高频可能包括大于0.1兆赫(MHz)的频率。控制器602可以将荧光激发信号608的脉冲宽度控制在1ns到50ns之间或者在一些其他合适的范围内。控制器602可以将荧光激发信号608的强度控制为足以引发来自目标分析物的荧光发射。

在一些实施方式中，控制器602可以控制荧光激发源604顺序地发射荧光激发信号608并且没有时间重叠。例如，可以控制荧光激发源604，使得在任何给定的时间只发射不超过一个荧光激发信号。如果颗粒612是预期的目标分析物之一，则一个或多个荧光激发信号608可以处于一个或多个预期的目标分析物的共振频率(或相应的波长)以引发来自颗粒612的增强的荧光响应。在一些实施方式中，可以控制荧光激发源604以振荡或循环的方式发射荧光激发信号608从而引发来自预期的目标分析物的、增强的特定荧光共振响应。

可供选择地或另外地，通过检测器606的检测可以在黑暗中进行，例如在检测期间没有任何荧光激发源604发射荧光激发信号608。因此，控制器602可以控制荧光激发源604顺序地发射荧光激发信号608而没有时间重叠，并且在一个脉冲结束和下一个脉冲开始之间有时间间歇，以允许在黑暗中进行检测。

荧光激发源604可将荧光激发信号发射到过程监测器600的样本区610中。样本区610可以包括在荧光激发源604和检测器606之间的流动池的一部分。被监测的物质(以任何相的形式存在，例如固体、液体、气体)的一部分或“样本”可以存在于样本区610内，并且可以包括一种或多种目标分析物和/或颗粒612(在下文中称为“颗粒612”或“多个颗粒612”)，它们响应于一个或多个荧光激发信号608而发出荧光。为了简化以下的讨论，参考了颗粒的检测和/或荧光，尽管该讨论也适用于目标分析物的检测和/或荧光。

每一个检测器606可以包括光电二极管(诸如正-本征-负(PIN)二极管或雪崩光电二极管(APD))、光电倍增管(PMT)、硅光电倍增管(SiPMT)或其他合适的检测器，以便检测响应于荧光激发信号608由颗粒612发射的荧光发射信号614。在一些实施方式中，过程监测器600被设计为最小化或至少减少向检测器606传输的荧光激发信号608，以最小化或至少减少通过检测器606检测到的背景信号，例如荧光发射信号614以外的信号，诸如荧光激发信号608。例如，检测器606和/或收集荧光发射信号614并将其引导到所述检测器606的光学器件可被定位在光路之外，荧光激发信号608将在没有与颗粒612进行相互作用的情况下以其它方式穿过样本区610。

过程监测器600的光学检测系统——其包括检测器606和/或收集荧光发射信号614并将其引导到所述检测器606的光学器件——可以被配置为分别检测颗粒612的荧光发射光谱分布的多个光谱子带。不同的光谱子带可以称为检测通道。在一些实施方式中，不同的检测器606可以检测在每一个子带内的由颗粒612发射的荧光的不同光谱子带和/或荧光寿命曲线。可供选择地或另外地，单个检测器606可以例如通过使用两个或更多个光学延迟线(例如不同长度的光纤或光路)和/或其他光学延迟装置来检测两个或更多个子带和/或荧光寿命曲线，以便在单个检测器606处在时间上分离各个子带分量的到达和检测。在这些和其他实施方式中，光学检测系统可以包括一个或多个光学带通滤光器(例如二向色滤光器)、光纤、光路、光导(LG)、光管、分束器、棱镜、马赛克滤光器、多变量光学元件(MOE)、光子晶体(PC)光纤、LG或PC波导或PC光纤、PC光学器件、透镜和/或其他合适的光学装置。下面参考图9-15描述包括了一个或多个前述部件的过程监测器600的各种示例性配置。

由过程监测器600的一个或多个检测器606检测的检测通道的总数可以相对较小，诸如在一个实施方式中用于监测水净化过程中的水生物负荷的检测通道为三个。在这个示例中，过程监测器600实际上是三通道光谱仪，因为它在三个不同的子带或检测通道上进行检测。用于区分的三通道光谱仪的分辨率可能受到一定限制，可以通过添加如本文所述的荧光寿命曲线来改善这一缺点。如果在样本区610中存在较大体积(例如1升)的、含有目标分析物和干扰物质这两者的水，则三通道光谱仪仍将受到能否有效地量化并区分目标分析物与干扰物质的挑战。这样，在一些实施方式中，当检测通道的数量相对较小时，样本区610的体积可以相对较小。在本示例中，样本区610的体积可以为大约1微升或其他合适的体积，以最小化在样本区610中目标分析物和干扰物质中的任一个大量存在或两者都大量存在的概率。这可能导致在样本区610中存在少量的目标分析物和/或干扰物质，从而可能使得难以产生足够的信号质量。本文所述的实施方式可以通过使用高速的多重复分析来产生足够的信号质量，从而提高信号质量。例如，在这种情况下，样本区610中1微升的流体样本可以被多次(例如1000-2000次)分析，因为颗粒612穿过样本区610以产生等效的高细节信号。

图7是根据本文所述的至少一个实施方式布置的、分析一种例如在图6的样本区610内的流体样本的方法700的流程图。方法700可以由图6的过程监测器600或本文所述的其他过程监测器实现。可供选择地或另外地，方法700可以被应用于分析另一物质的气体样本或固体样本，包括流动粉末、传送线路上的药丸、糊剂或以任何相存在的其他物质。在一些实施方式中，可以由例如图6的控制器602或另外一种用于执行存储在非暂时性的计算机可读介质(例如计算机存储器或存储装置)上的计算机可读指令(例如代码或软件)的处理器来控制方法700的执行，以便控制过程监测器600来执行方法700。

组合参考图6和图7，方法700可以包括：在方框702，过程监测器600对样本区610中的流体样本执行一个或多个样本询问循环以便产生一个或多个重复分析结果。每一个询问循环的执行可以包括方框704、706和/或708中的一个或多个。在下面的讨论中，假设执行多个询问循环以产生多个重复分析结果。在其他实施方式中，执行单个询问循环以产生单个重复分析结果。

在方框704，可以用不同荧光激发波长的两个或更多个荧光激发信号608照射样本区610中的流体样本。照射可以包括用两个或更多个荧光激发信号608顺序地照射样本区610中的流体样本而没有时间重叠。在其他实施方式中，照射可以包括用不同荧光激发波长的至少两个荧光激发信号同时照射样本区610中的流体样本。可供选择地或另外地，两个或更多个荧光激发信号608可以在每一个询问循环中脉冲化，并且一个荧光激发信号608的脉冲结束与另一个荧光激发信号608的脉冲开始之间可以存在时间间歇以允许在黑暗中进行检测。检测可以连续进行，或者可以在每一个脉冲结束的同时或大约同时开始检测，或者甚至在每一个脉冲结束之后开始检测，并且可以在下一个脉冲开始的同时或大约同时结束检测，或者甚至在下一个脉冲开始之前结束检测。

在方框706，可以在由每一个荧光激发信号608照射之后从不同的荧光发射信号614中检测流体样本的不同荧光发射光谱分布。例如，在由荧光激发信号608中的一个荧光激发信号照射之后，颗粒612可以发射相应的荧光发射信号614，并且可以由检测器606中的一个检测器检测其相应的荧光发射光谱分布。在由荧光激发信号608中的另一个荧光激发信号照射之后，颗粒612可以发射另一个荧光发射信号614，并且可以由检测器606中的另一个检测器检测(或者在只存在单个检测器606的情况下由同一检测器606检测)其相应的荧光发射光谱分布。结果可能是产生了两个或更多个荧光发射光谱分布，每一个荧光发射光谱分布都是响应于被荧光激发信号608中的相应一个荧光激发信号照射或者响应于被荧光激发信号608中的至少两个荧光激发信号同时照射而产生的。在方框706，对每一个荧光发射光谱分布的检测可以包括，对于每一个荧光发射光谱分布，分别检测相应的荧光发射光谱分布的多个光谱子带。

在方框708，可以在由每一个荧光激发信号608照射之后从不同的荧光发射信号614中检测流体样本的不同荧光寿命曲线。例如，在由荧光激发信号608中的一个荧光激发信号照射之后，颗粒612可以发射相应的荧光发射信号614，并且可以由检测器606中的一个检测器检测其相应的荧光寿命曲线。在由所述荧光激发信号608中的另一个荧光激发信号照射之后，颗粒612可以发射另一个荧光发射信号614，并且可以由所述检测器606中的另一个检测器检测(或者在只存在单个检测器606的情况下由同一检测器606检测)其相应的荧光寿命曲线。结果可能是产生了两个或更多个荧光寿命曲线，每一个荧光寿命曲线都是响应于被荧光激发信号608中的相应一个荧光激发信号照射颗粒612或者响应于被荧光激发信号608中的至少两个荧光激发信号同时照射而产生的。

在方框702——包括方框704、706和708——执行的每一个样本询问循环可以产生相应的重复分析结果。每一个重复分析结果可以包括对于相应的样本询问循环产生的两个或更多个荧光发射光谱分布和两个或更多个荧光寿命曲线。

在方框710，可以执行重复分析结果与预定光谱关系的比较。将重复分析结果与预定光谱关系进行比较可以包括将从重复分析结果导出的平均或复合信号与预定光谱关系进行比较。可供选择地或另外地，将重复分析结果与预定光谱关系进行比较可以包括将重复分析结果(例如平均或复合信号)拟合到预定光谱关系，以便将存在于流体样本中的一个或多个颗粒612识别为目标分析物。

预定光谱关系可以存储在数据库中，和/或可以由过程监测器600访问或由通信地耦接到过程监测器600的计算机装置访问。预定光谱关系可以产生一个或多个目标分析物和/或干扰物质的特征响应标记或指纹，并且可以被称为特征响应标记发射分布。可供选择地或另外地，可以利用人工智能学习算法来确定光谱关系和/或评估一个或多个目标分析物和/或干扰物质的特征响应标记或指纹的检测信号。可以将多变量(例如多光谱和多时间)荧光分布(例如重复分析结果)与预定光谱关系进行比较或拟合，以便通过例如将重复分析结果或者平均或复合信号的属性/特性与各个子带和/或时间段中的特征响应标记发射分布的相应属性/特性进行比较，从而将流体样本中存在的一个或多个颗粒612识别为目标分析物。例如，如果重复分析结果的平均或复合荧光发射光谱分布和/或平均或复合荧光寿命曲线匹配(例如，在发射波长和强度之间的光谱分布形状/对应性方面匹配和/或在衰减时间和强度之间的寿命曲线形状/对应性方面匹配)了被包括在特征响应标记发射分布中的目标分析物的荧光发射光谱分布和/或寿命曲线，则目标分析物可被识别为存在于流体样本中。

在方框712，可以基于将被确定为存在的一个或多个目标分析物或干扰物质的特征响应标记发射分布的强度与来自询问样本的重复分析结果中的强度进行比较的结果来确定流体样本的目标分析物浓度。目标分析物浓度的确定可以包括确定生物负荷浓度。确定目标分析物浓度的比较可以被包括在方框710的比较中或作为方框710的比较的一部分。在这些和其他实施方式中，特征响应标记发射分布可以指明目标分析物或干扰物质的单个颗粒(或其他已知数量的颗粒)的多变量响应。在流体样本中更高浓度的目标分析物或干扰物质可以引起与特征响应标记发射分布的一部分相匹配(在形状和/或其他属性方面匹配)但具有更大强度的荧光发射光谱分布和/或荧光寿命曲线。作为在流体样本中存在的目标分析物的颗粒的量或浓度的函数，重复分析结果的强度(或由其导出的平均或复合信号)可以线性地改变或根据与特征响应标记发射分布中的强度相比的一些其他已知关系而改变。因此，通过将特征响应标记发射分布的强度与重复分析结果的强度进行比较，可由此确定目标分析物的颗粒的数量或浓度。在一些实施方式中，所确定的浓度可以随时间的流逝而“累计”，以将其与更大的体积(比流体样本中存在的体积大)或时间值相关。可供选择地或另外地，方法700可以进一步包括确定流体样本中特定类型的目标分析物的生物负荷浓度。

本领域的技术人员将理解，对于本文公开的这个过程和方法以及其他过程和方法，可以以不同的顺序实现在所述过程和方法中执行的功能。此外，所列出的步骤和操作仅作为示例提供，并且所述步骤和操作中的一些可以是可选的、是可组合成较少的步骤和操作的或者是可扩展成附加的步骤和操作，而不偏离所公开的实施方式的本质。

参考图8更详细地描述方法700的各个方面，图8示出了根据本文所述的至少一个实施方式布置的各种图示802、804、806。图示802包括图4的荧光发射光谱分布401和402，如果目标分析物的一个或多个颗粒存在于流体样本中，它们可响应于以“激发波长#1”和“激发波长#2”的两个荧光激发信号对流体样本进行照射而在一个图7的样本询问循环中产生。

图示804包括目标分析物的荧光寿命曲线808和干扰物质的荧光寿命曲线810。目标分析物的荧光寿命曲线808或干扰物质的荧光寿命曲线810中的至少一个可以在一个样本询问循环中响应于通过“激发波长#1”和“激发波长#2”的两个荧光激发信号中的一个荧光激发信号对流体样本进行照射而产生。可以在样本询问循环期间响应于通过所述两个荧光激发信号中的另一个荧光激发信号对流体样本进行照射而产生针对目标分析物或干扰物质中的至少一个的单独的荧光寿命曲线808或810。在询问循环期间在流体样本中目标分析物和干扰物质两者的颗粒都存在的情况下，检测到的荧光寿命曲线可以是荧光寿命曲线808和810的组合。

图示806包括分别针对目标分析物和干扰物质的荧光发射光谱和寿命联合曲线(下文中称为“曲线”或“多个曲线”)812和814。图示806是三维图形，其中第一轴816对应于强度，第二轴818对应于以纳秒为单位的时间，并且第三轴820对应于以nm为单位的发射波长。沿着第二轴818，对于目标分析物的荧光发射光谱和寿命联合曲线812，初始时间值(例如在第二轴818的最左侧)为0并且向右增加。沿着第二轴818的时间值在干扰物质的荧光发射光谱和寿命联合曲线814的最左侧重置为0并且向右增加。

曲线812和814是预定光谱关系的示例，每一个曲线产生用于目标分析物和干扰物质中的相应的一个的多变量标记或指纹。在图7的方法700的方框702期间产生的各个重复分析结果——包括在每一个询问循环期间产生的两个或更多个荧光发射光谱分布(例如401和402)以及两个或更多个荧光寿命曲线(例如808和/或810)——可以与曲线812和814或它们的特征进行比较以确定流体样本的生物负荷。

图9-15示出了根据本文所述的至少一个实施方式布置的图6的过程监测器600和/或其一些部分的各种示例性实现。通常，过程监测器600可以至少在逻辑上被划分为激发收集系统和检测系统。

在图9的实施方式中，过程监测器600的激发收集系统包括将荧光激发信号902和904发射到流动池的样本区906中的两个荧光激发源(图9和其他图中的“激发源1”和“激发源2”)。可以至少部分地用反射器包围样本区906，以将荧光发射信号聚焦到检测系统的收集透镜(图9和其他附图中标记为“收集透镜”)中。反射器可以透射荧光激发信号并且反射荧光发射信号。如图9中所示，图9的实施方式可以通过将荧光激发信号902和904引导出检测路径而使进入检测系统中的荧光激发信号902和904的传输最小化。

图9或其他图中的收集透镜可以具有光入射表面和光出射表面两者。光入射表面可以是凸面、凹面、非球面、平面或其他合适的形状。类似地，光出射表面可以是凸面、凹面、非球面、平面或其他合适的形状。在这些和其他实施方式中，收集透镜可以具有净正光学倍率。因此，收集透镜的光入射表面或光出射表面中的至少一个可以是凸面或非球面或具有正光学倍率的其他形状，而所述光入射表面或光出射表面中的另一个可以是凸面、凹面、非球面、平面或者具有与正光学倍率相加仍是净正的任何光学倍率的其他形状。

在准直透镜之后的激发滤光器可滤除除了预期的荧光发射信号光谱之外的波长的光。第一二向色滤光器(例如分束器)(图9中的“二向色滤光器1”)可以是将一个子带重新定向到第一检测器(图9中的“检测器带1”)并允许其他波长通过的带通滤光器。第二二向色滤光器(图9中的“二向色滤光器2”)可以是将另一个子带重新定向到第二检测器(图9中的“检测器带2”)并允许其他波长通过的另一个带通滤光器。

在图10-15中，本文其他位置使用的类似名称和/或参考数字表示类似部件。在图10的示例中，如图10中所示，过程监测器600可以利用光管方法(light pipemethodologie)来可控地引导荧光激发信号穿过系统流动池。在图9-15中，在激发滤光器(其中存在一个激发滤光器)之后的输出可以耦接到光导或光纤束，然后分成两条或更多条去到检测器的支路，其中在光导和检测器之间有单独的滤光器，或者每条单独支路有滤光器，或者光导的每条支路可以具有固有过滤特性，诸如由聚合物(低成本)或玻璃制成的、在光导材料中具有吸收染料的模制光导。

在图11的示例中，过程监测器600利用光管方法来可控地引导荧光激发信号以与图10中所示的方式不同的方式穿过系统流动池。

图12-15示出了可以被包括在过程监测器600中的检测器系统的各种配置。在这些和其他实施方式中，二向色滤光器可以被立方体分束器或者被松散的或粘附在一起的立方体分束器阵列所替代。可供选择地，可以使用具有滤光器功能的棱镜组件，可以应用诸如具有合适滤光器功能的K棱镜或菲利普(Phillips)棱镜配置或者X立方体配置。这些棱镜也可以按类似方式以阵列扩展。检测器可以经由贴近聚焦(例如对接耦合)、透镜或光纤从棱镜接收荧光发射信号。

在图12中，可以利用光纤方法来可控地延迟到达单个检测器的所需的子带。例如，光纤1202、1204、1206可以具有不同的长度。与光纤1202相比，较长的光纤1204、1206可以在从激发收集系统(参见例如图10)发射并到达图12的检测器的荧光发射信号(或其子带)中引入不同且已知的延迟。通过在子带中引入延迟，可以使用单个检测器来检测多个子带。

图13示出了利用光纤方法可控地延迟到达单个检测器的所需的子带的检测器系统的另一配置。图14示出了利用光纤方法可控地延迟到达使用(诸如马赛克滤光器的)滤光器技术的检测器阵列的所需的子带的检测器系统的配置。图15示出了没有光学延迟并且具有使用(诸如马赛克滤光器的)滤光器技术的检测器阵列的检测器系统的配置。

关于本文中大体上使用的任何复数和/或单数术语，本领域的技术人员可以根据上下文和/或应用适当地将复数转化为单数和/或将单数转化为复数。为了清楚起见，本文可以明确地阐述各种单数/复数置换。

可以在不脱离其精神或本质特征的情况下以其他特定形式来实施本发明。所述的实施方式在所有方面仅被认为是说明性的而非限制性的。因此，本发明的范围由所附权利要求书指明而不是由前面的描述所指明。在权利要求书的等同的含义和范围内的所有变化都将包括在它们的范围内。

Claims (19)

1.一种分析样本的方法，所述方法包括：

在所述样本上执行多个样本询问循环以产生多个重复分析结果，其中通过以下步骤执行所述多个样本询问循环中的每一个样本询问循环：

用不同荧光激发波长的两个或更多个荧光激发信号照射所述样本；

检测所述样本对于所述两个或更多个荧光激发信号中的每一个荧光激发信号的荧光发射光谱分布，以产生所述样本的两个或更多个荧光发射光谱分布；以及

检测所述样本对于所述两个或更多个荧光激发信号中的每一个荧光激发信号的荧光寿命曲线，以产生所述样本的两个或更多个荧光寿命曲线；

其中，所述多个重复分析结果中的每一个重复分析结果包括对于所述多个样本询问循环中的相应一个样本询问循环产生的两个或更多个荧光发射光谱分布和两个或更多个荧光寿命曲线；

执行所述多个重复分析结果与多个预定光谱关系的比较；以及

基于所述多个重复分析结果与所述多个预定光谱关系的比较确定所述样本的目标分析物浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个样本询问循环中的每一个样本询问循环中的照射包括用所述两个或更多个荧光激发信号顺序地照射所述样本而没有时间重叠。

3.根据权利要求1所述的方法，其中确定所述样本的目标分析物浓度包括确定在所述样本中的一种或多种目标分析物的生物负荷浓度。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种目标分析物包括生物物质、活性成分或惰性颗粒中的至少一种。

5.根据权利要求3所述的方法，进一步包括确定在所述样本中的所述一种或多种目标分析物中的特定一种目标分析物的量。

6.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述样本的荧光发射光谱分布包括分别检测所述荧光发射光谱分布的多个光谱子带。

7.根据权利要求6所述的方法，其中检测所述样本的荧光寿命曲线包括检测在所述多个光谱子带中的每一个光谱子带内的、所述样本的荧光发射时间响应和强度。

8.一种分析样本的方法，所述方法包括：

在所述样本上执行样本询问循环以产生重复分析结果，其中通过以下步骤执行所述样本询问循环：

用不同荧光激发波长的两个或更多个荧光激发信号照射所述样本；

检测所述样本对于所述两个或更多个荧光激发信号中的每一个荧光激发信号的荧光发射光谱分布，以产生所述样本的两个或更多个荧光发射光谱分布；以及

检测所述样本对于所述两个或更多个荧光激发信号中的每一个荧光激发信号的荧光寿命曲线，以产生所述样本的两个或更多个荧光寿命曲线；

其中，所述重复分析结果包括对于所述样本询问循环产生的两个或更多个荧光发射光谱分布和两个或更多个荧光寿命曲线；

执行所述重复分析结果与多个预定光谱关系的比较；以及

基于所述重复分析结果与所述多个预定光谱关系的比较确定所述样本的目标分析物浓度。

9.根据权利要求1所述的方法，其中照射包括用所述两个或更多个荧光激发信号顺序地照射所述样本而没有时间重叠。

10.根据权利要求1所述的方法，其中确定所述样本的目标分析物浓度包括确定在所述样本中的一种或多种目标分析物的生物负荷浓度。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种目标分析物包括生物物质、活性成分或惰性颗粒中的至少一种。

12.根据权利要求10所述的方法，进一步包括确定在所述样本中的所述一种或多种目标分析物中的特定一种目标分析物的量。

13.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述样本的荧光发射光谱分布包括分别检测所述荧光发射光谱分布的多个光谱子带。

14.根据权利要求13所述的方法，其中检测所述样本的荧光寿命曲线包括检测在所述多个光谱子带中的每一个光谱子带内的、所述样本的荧光发射时间响应和强度。

15.一种用于分析样本的过程监测器，所述过程监测器包括：

样本区，在所述样本区中存在所述样本；

两个或更多个荧光激发源，所述两个或更多个荧光激发源光学地耦接到所述样本区；

一个或多个检测器，所述一个或多个检测器光学地耦接到在由所述两个或更多个荧光激发源发射的两个或更多个荧光激发信号中的每一个荧光激发信号的光路之外的所述样本区；以及

控制器，所述控制器通信地耦接到所述两个或更多个荧光激发源中的每一个荧光激发源和所述一个或多个检测器，并且被配置为控制所述过程监测器执行以下操作，所述过程监测器包括所述两个或更多个荧光激发源和所述一个或多个检测器：

在所述样本上执行多个样本询问循环以产生多个重复分析结果，其中通过以下步骤来执行所述多个样本询问循环中的每一个样本询问循环：

使用所述两个或更多个荧光激发源以不同荧光激发波长的所述两个或更多个荧光激发信号照射所述样本；

使用所述一个或多个检测器检测所述样本对于所述两个或更多个荧光激发信号中的每一个荧光激发信号的荧光发射光谱分布，以产生所述样本的两个或更多个荧光发射光谱分布；以及

使用所述一个或多个检测器检测所述样本对于所述两个或更多个荧光激发信号中的每一个荧光激发信号的荧光寿命曲线，以产生所述样本的两个或更多个荧光寿命曲线；

其中，所述多个重复分析结果中的每一个重复分析结果包括对于所述多个样本询问循环中的相应一个样本询问循环产生的两个或更多个荧光发射光谱分布和两个或更多个荧光寿命曲线；

执行所述多个重复分析结果与多个预定光谱关系的比较；以及

基于所述多个重复分析结果与所述多个预定光谱关系的比较确定所述样本的目标分析物浓度。

16.根据权利要求15所述的过程监测器，进一步包括设置在所述样本区与所述一个或多个检测器之间的激发滤光器，其中所述激发滤光器被配置为抑制所述两个或更多个荧光激发信号中的至少一个荧光激发信号的光波长。

17.根据权利要求15所述的过程监测器，其中所述一个或多个检测器包括至少两个子带检测器，所述过程监测器进一步包括：

第一带通滤光器，所述第一带通滤光器被光学地定位在所述样本区与所述至少两个子带检测器中的第一个子带检测器之间，所述第一带通滤光器被配置为将第一检测通道引导到所述至少两个子带检测器中的所述第一个子带检测器并且将其他波长引导到其他位置；以及

第二带通滤光器，所述第二带通滤光器被光学地定位在所述样本区与所述至少两个子带检测器中的第二个子带检测器之间，所述第二带通滤光器被配置为将不与所述第一检测通道重叠的第二检测通道引导到所述至少两个子带检测器中的所述第二个子带检测器并且将其他波长引导到其他位置。

18.根据权利要求15所述的过程监测器，其中所述一个或多个检测器包括单个检测器，所述过程监测器进一步包括：

第一光路，所述第一光路在所述样本区和所述单个检测器之间并具有第一延迟；以及

第二光路，所述第二光路在所述样本区和所述单个检测器之间并具有长于所述第一延迟的第二延迟，

其中所述单个检测器被配置为在每一个样本询问循环通过以下步骤检测对于所述两个或更多个荧光激发信号中的每一个荧光激发信号的荧光发射光谱分布和荧光寿命曲线两者：

当从所述第一光路接收到时，检测对于所述两个或更多个荧光激发信号中的第一个荧光激发信号的荧光发射光谱分布和荧光寿命曲线；以及

随后当从所述第二光路接收到时，在稍后时刻检测对于所述两个或更多个荧光激发信号中的第二个荧光激发信号的荧光发射光谱分布和荧光寿命曲线。

19.根据权利要求18所述的过程监测器，进一步包括：

第一带通滤光器，所述第一带通滤光器被光学地定位在所述第一光路与所述单个检测器之间，所述第一带通滤光器被配置为将第一检测通道传递到所述单个检测器并抑制其他波长，所述第一检测通道包括对于所述两个或更多个荧光激发信号中的所述第一个荧光激发信号的荧光发射光谱分布；以及

第二带通滤光器，所述第二带通滤光器被光学地定位在所述第二光路与所述单个检测器之间，所述第二带通滤光器被配置为将第二检测通道传递到所述单个检测器并抑制其他波长，所述第二检测通道包括对于所述两个或更多个荧光激发信号中的所述第二个荧光激发信号的荧光发射光谱分布。