CN110274895A - 多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测方法与装置 - Google Patents

Abstract

本发明属于化学物质检测技术领域，可用于对物质的化学成分进行高灵敏度探测鉴别。本发明使用多个探测器同时探测不同波长下的荧光寿命及光谱信息，能对微弱的自发荧光光谱及荧光寿命进行高灵敏度的探测，具有探测精度高，探测速度快的特点。同时，本发明利用针孔对收集到的荧光信号进行滤波，提高系统的分辨率；利用扫描系统实现被测物质二维或三维荧光寿命及荧光强度谱分布的测量。因此，本发明的提出为待测物质荧光寿命及荧光光谱的高灵敏度便捷测量提供了可行途径，将在生物学、医学、材料科学等研究领域及临床医学诊断方面具有重要应用。

Description

多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测方法与装置

技术领域

本发明属于化学物质检测技术领域，可用于对物质的化学成分进行高灵敏度探测鉴别，将在生物学、医学、材料科学等研究领域及临床医学诊断方面具有重要应用。

背景技术

在生物、物理、化学和材料等学科领域，光谱检测和分析由于其具有非常高的灵敏度、分子特异性和非接触测量特性已经成为基础研究的一项基本的测量手段。其中，荧光光谱检测是利用物质在紫外光照射下产生荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析方法。特别是对大多数有机化合物来说，其产生的荧光通常具有很强的特异性，指向性。因此荧光光谱检测尤其适合运用于这些荧光特异性强的有机化合物的成分分析。在工业界，荧光光谱检测可用于各种污染物的成分检测、工业原料成分检测、石油原油成分检测等等。在食品安全领域，荧光光谱检测可用于对食品的霉变细菌、农药残留量等信息进行检测和监控。在医学领域，荧光光谱技术和荧光显微成像技术为肿瘤和癌症的实时成像和检测提供了新的方向，并且有望发展成为适用于临床诊断的医疗技术。由此可见，荧光光谱检测技术是一种非常实用而且有前景的光学检测手段。

通常，荧光测量技术包括荧光光谱测量和荧光寿命测量两种方式。荧光光谱测量技术是通过对从待检样品发出荧光的光谱分布检测来实现的，即固定激发波长，探测出样品的发射光强与入射光波长的关系曲线。荧光光谱技术经常跟荧光探针相结合，应用在DNA测序、高分子材料科学、生物荧光成像等领域。与此相对，荧光寿命检测是测量脉冲激光激发后从待检样品中激发出的荧光强度降到激发时的荧光最大强度的1/e所需要的时间。荧光物质的荧光寿命与自身的结构、所处微环境的极性、粘度等条件直接相关，因此从样品所激发出来荧光的寿命值是绝对的，不受激发光强度、荧光团的浓度和光漂白等因素的影响，且不受其他限制强度测量因素的制约。通过对样品进行荧光寿命测量还可对待测样品所处的微环境的很多生化参数如pH值、离子浓度、温度等分布进行定量测量。

然而，目前市场上的荧光检测类仪器大多采用相机来对不同波长的荧光信息进行检测，存在灵敏度不高，使用不方便等问题。特别是对待测样品的自发荧光寿命进行测量时，其每个脉冲激发出来的荧光信号极其微弱，荧光寿命也极其短暂，因此基于相机测量荧光信息的光谱检测类仪器完全无法捕捉到如此微弱且短暂的荧光信息。

发明内容

为了解决荧光寿命及光谱的高灵敏度探测难题，本发明提出了“多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测方法与装置”。本发明使用多个探测器同时探测不同波长下的荧光寿命及光谱信息，不会因为使用光束延时技术造成信噪比降低，也不会因为多波长多次探测及滤波片的旋转影响探测的时间分辨率，为高精度实时检测奠定了基础。同时，本发明利用针孔对收集到的荧光信号进行滤波，提高系统的空间分辨率；利用扫描系统实现待测样品二维或三维荧光寿命及荧光强度谱分布的测量。因此，本发明的提出为物质自发荧光的高灵敏度测量提供了可行的途径。

一方面，本发明提供一种多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测方法，其步骤为：

(a)脉冲激光器发出的脉冲激光束通过扩束镜扩束后透过分光镜，由物镜会聚后照射在待测样品上；

(b)从待测样品激发出来的荧光通过所述物镜收集后由所述分光镜反射进入分光系统，并由分光系统分成N路，对所分出来的每一路荧光用不同中心波长的窄带滤光片对其进行滤光，各窄带滤光片对应的中心波长为λ _n ，带通宽度为δλ _n ，其中，n=1, 2, …, N；

(c)使用N个光强传感器分别测量由各窄带滤光片滤得的对应波长下随时间变化的荧光光强信息，数据分析后得到对应波长下的荧光寿命及不同波长之间的相对荧光强度谱；

(d)依据待测样品在不同波长下的荧光寿命及荧光强度谱信息，鉴别待测样品的化学成分。

另一方面，本发明还提供了多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，包括脉冲激光光源，以及扩束镜、分光镜、物镜、分光系统、N个窄带滤光片、N个光强传感器，信号采集器，计算机；其中扩束镜、分光镜、物镜依次放置在脉冲激光出射的方向；分光系统放在分光镜反射的方向，分光系统将从待测样品激发出来的荧光分成N路，分别经过N个窄带滤光片滤光后由N个光强传感器探测接收；信号采集器将各光强传感器测得的荧光光强信息转化后传输给计算机，由计算机分析得到不同中心波长下荧光寿命及相对荧光强度谱。

本发明对比已有技术具有以下创新点：

1.使用多个光强传感器同时探测不同波长下的荧光寿命，并基于此鉴别待测样品化学成分，显著提高了系统的鉴别速度及鉴别准确度；

2.本发明同时探测待测样品在不同波长下的荧光寿命及不同波长之间的相对荧光强度谱信息，信息量大，可显著提高鉴别准确度；

3.本发明利用针孔对收集到的荧光信号进行滤波，将焦点之外的荧光信号进行了有效的屏蔽，显著提高了系统的空间分辨率；

4.利用扫描系统对待测样品或探测光束进行扫描，实现了待测样品的二维或三维荧光寿命及荧光强度谱分布的测量；

5.本发明可用于自发荧光的高灵敏度测量，利用待测样品的自发荧光来检测其化学成分，在检测过程中无需使用荧光标记物，因此检测过程非常方便。

本发明对比已有技术具有以下显著优点：

1.本发明使用多个探测器同时探测不同波长下待测样品的荧光寿命及相对荧光强度谱信息，具有探测速度快、探测精度高的优势；

2.多探测器同时测量可以消除各激光脉冲强度不稳定因素造成的测量精度受限问题。

附图说明

图1为本发明多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测方法的示意图；

图2为本发明利用针孔对探测荧光进行空间滤波的示意图；

图3为本发明多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测装置的示意图；

图4为本发明二维平移台扫描待测样品的示意图；

图5为本发明二维光束扫描系统扫描探测光束的示意图；

图6为本发明三维平移台扫描待测样品的示意图；

图7为本发明利用二向色分光镜和反射镜组成的分光系统的示意图；

图8为本发明用多光强传感器组替代N个光强传感器的示意图；

图9为本发明多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测实施例的示意图；

其中：1-脉冲激光光源、2-扩束镜、3-分光镜、4-物镜、5-待测样品、6-分光系统、7-第一滤光片、8-第二滤光片、9-第N滤光片、10-第一光强传感器、11-第二光强传感器、12-第N光强传感器、13-第一会聚透镜、14-第二会聚透镜、15-第N会聚透镜、16-第一针孔、17-第二针孔、18-第N针孔、19-信号采集器、20-计算机、21-二维平移台、22-二维光束扫描系统、23-三维平移台、24-一号二向色分光镜、25-二号二向色分光镜、26-反射镜、27-多光强传感器组、28-第三滤光片、29-第四滤光片、30-三号二向色分光镜、31-第一光电倍增管、32-第二光电倍增管、33-第三光电倍增管、34-第四光电倍增管。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明利用从待测样品中激发出来的不同波长荧光的寿命来判断待测样品的化学成分，其基本思想是利用多个探测器对不同波长的荧光信息进行同时探测，显著提高系统的鉴别速度和精度；利用针孔对收集到的荧光信号进行滤波，提高系统的分辨率；并利用扫描系统实现待测样品二维或三维荧光寿命及荧光强度谱分布的测量。

实施例1

本实施例需要解决的问题是鉴别待测样品是正常组织还是肿瘤组织。本实施例使用四个光电倍增管作为光强传感器分别对从待测样品激发出来的400 nm，450 nm，530 nm和580nm这四个波长的荧光信号进行探测，并根据所测得的荧光寿命及不同波长之间的相对荧光强度谱信息来鉴别待测样品的成分。本实施例将使用如附图1和3所示的多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测方法及装置。如附图9所示，其具体的鉴别的步骤如下。

(a) 由脉冲激光光源1发出脉冲激光，该脉冲激光的波长为355 nm，脉冲宽度为2ns。所发出的脉冲激光经过扩束镜2扩束后透过分光镜3，由物镜4会聚后照射在待测样品5上。

(b) 脉冲激光照射到待测样品5上后激发出荧光，所激发出来的荧光经物镜4收集后由分光镜3反射进入分光系统6。进入分光系统6的荧光光束经过一号二向色分光镜24后分成两路，其中反射光束的波长范围为360 nm~430 nm，透过光束的波长范围为430 nm~700nm；从一号二向色分光镜24透过的光束经过二号二向色分光镜25后又分成两路，其中反射光束的波长范围为430 nm~480 nm，透过光束的波长范围为480 nm~700 nm；从二号二向色分光镜25透过的光束经过三号二向色分光镜30后又分成两路，其中反射光束的波长范围为480 nm~550 nm，透过光束的波长范围为550 nm~700 nm；从三号二向色分光镜30透过的光束经由反射镜26反射。

(c) 由一号二向色分光镜24反射的光束透过第一滤光片7后照射在第一光电倍增管31上；第一滤光片7的中心波长为400 nm，带通宽度为10 nm。因此由第一光电倍增管31接收的荧光的中心波长为400 nm。由二号二向色分光镜25反射的光束透过第二滤光片8后照射在第二光电倍增管32上；第二滤光片8的中心波长为450 nm，带通宽度为10 nm。因此由第二光电倍增管32接收的荧光的中心波长为450 nm。由三号二向色分光镜30反射的光束透过第三滤光片28后照射在第三光电倍增管33上；第三滤光片28的中心波长为530 nm，带通宽度为10 nm。因此由第三光电倍增管33接收的荧光的中心波长为530 nm。由反射镜26反射的光束透过第四滤光片29后照射在第四光电倍增管34上；第四滤光片29的中心波长为580nm，带通宽度为10 nm；因此由第四光电倍增管34接收的荧光的中心波长为580 nm。

(d) 将第一光电倍增管31探测得到的中心波长400 nm下随时间变化的荧光信息，第二光电倍增管32探测得到的中心波长450 nm下随时间变化的荧光信息，第三光电倍增管33探测得到的中心波长530 nm下随时间变化的荧光信息，以及第四光电倍增管34探测得到的中心波长580 nm下随时间变化的荧光信息同时通过信号采集器19采集后传输给计算机20。计算机通过对这些不同中心波长下随时间变化的荧光信号进行处理，得到各波长对应的荧光寿命以及荧光峰值强度信息。其中，中心波长400 nm对应的荧光寿命为10.5 ns，荧光峰值强度为5.6 µW；中心波长450 nm对应的荧光寿命为7.3 ns，荧光峰值强度为8.4 µW；中心波长530 nm对应的荧光寿命为13.3 ns，荧光峰值强度为4.5 µW；中心波长580 nm对应的荧光寿命为6.7 ns，荧光峰值强度为9.8 µW。进而可以得到该待测样品5在400 nm、450nm、530 nm和580 nm下的相对荧光强度谱为0.57:0.86:0.46:1。

(e) 根据正常组织在各波长下荧光的荧光寿命：波长400 nm对应的荧光寿命为9ns~13 ns之间，波长450 nm对应的荧光寿命为10 ns~14 ns之间，波长530 nm对应的荧光寿命为12 ns~15 ns之间，波长580 nm对应的荧光寿命为11 ns~14 ns之间；肿瘤组织在各波长下荧光的荧光寿命：波长400 nm对应的荧光寿命为8 ns~11 ns之间，波长450 nm对应的荧光寿命为6 ns~8 ns之间，波长530 nm对应的荧光寿命为13 ns~16 ns之间，波长580 nm对应的荧光寿命为5 ns~7 ns之间；可以得到从待测样品5激发出来的荧光寿命信息与肿瘤组织的荧光寿命完全匹配，因而可以判断该待测样品5为肿瘤组织。同时，根据正常组织在这四个波长荧光信息中峰值荧光谱为530 nm，而肿瘤组织在这四个波长荧光信息中峰值荧光谱为580 nm，也可以进一步判断该待测样品5为肿瘤组织。

如附图9所示，该实施例中的多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，包括脉冲激光光源1、扩束镜2、分光镜3、物镜4、分光系统6、第一滤光片7、第二滤光片8、第三滤光片28、第四滤光片29、第一光电倍增管31、第二光电倍增管32、第三光电倍增管33、第四光电倍增管34、信号采集器19、计算机20。在本实施例中，分光系统6采用如附图7所示的用多个二向色分光镜和反射镜的方法来进行分光，包括一号二向色分光镜24、二号二向色分光镜25、三号二向色分光镜30和反射镜26。由脉冲激光光源1发出脉冲激光，该脉冲激光经扩束镜2扩束后透过分光镜3，由物镜4会聚后照射在待测样品5上。由待测样品5激发出来的荧光经物镜4收集后由分光镜3反射进入分光系统6。进入分光系统的光束由一号二向色分光镜24、二号二向色分光镜25和三号二向色分光镜30分成不同波长带的四束。

该四束荧光经过第一滤光片7、第二滤光片8、第三滤光片28和第四滤光片29滤光后得到四束中心波长不同的窄带光束，并分别被第一光电倍增管31、第二光电倍增管32、第三光电倍增管33和第四光电倍增管34探测接收。各光电倍增管将所探测得到的光强信息通过信号采集器19传输至计算机20。计算机20通过对不同波长下随时间变化的荧光信息进行处理得到各对应波长下的荧光寿命。计算机20将测得的各波长下的待测样品的荧光寿命和不同波长之间的相对荧光强度谱信息进行分析，鉴别出待测样品5的成分。

实施例2

与实施例1不同的是，如附图2所示，为提高探测光束的分辨率，在所有光强传感器前都分别加上会聚透镜和针孔。针孔放置在会聚透镜的焦点位置处，会聚透镜将各不同波长的荧光光束会聚后通过针孔进行空间滤波。因此，各光强传感器探测到的荧光信号均为滤波后的荧光光强信息，这些滤波后的荧光准确对应着探测光束聚焦焦点激发出来的荧光信号，将焦点之外的荧光信号进行了有效的屏蔽。

实施例3

与实施例1不同的是，该实施例中，我们需要测量的是待测组织中肿瘤细胞的二维分布。如附图4所示，将待测样品5放置在二维平移台21上，由二维平移台21对待测样品5进行垂直于物镜出射光束光轴方向的二维扫描，测得待测样品5不同位置处激发出来的不同波长下的荧光寿命及相对荧光强度谱信息，进而得到待测样品二维荧光寿命及荧光强度谱分布。并基于该荧光寿命及荧光强度谱分布，得到待测组织5中肿瘤细胞的二维分布。

实施例4

与实施例3不同的是，如附图5所示，该实施例采用二维光束扫描系统22，如二维转镜光束扫描系统对从物镜出射的聚焦光束的焦点沿着垂直于所述聚焦光束光轴的方向进行二维扫描，等效于用二维平移台21对待测样品5进行扫描。

实施例5

与实施例1不同的是，该实施例中，我们需要测量的是待测组织中肿瘤细胞的三维分布。如附图6所示，将待测样品5放置在三维平移台23上，由三维平移台23对待测样品5进行三维扫描，测得待测样品5不同位置处激发出来的不同波长下的荧光寿命及相对荧光强度谱信息，进而得到待测样品三维荧光寿命及荧光强度谱分布。并基于该荧光寿命及荧光强度谱分布，得到待测组织5中肿瘤细胞的三维分布。

实施例5

与实施例1不同的是，如附图8所示，用阵列光电倍增管探测器作为多光强传感器组替代所述使用的四个光电倍增管探测器，用阵列光电倍增管探测器中不同的探测单元分别探测得到不同波长的荧光信息。

所述实施例通过一系列的措施实现了对待测样品中肿瘤细胞的鉴别，在鉴别过程中利用多个光强传感器对不同波长的荧光信息进行同时探测，显著提高鉴别速度和精度。

以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本发明的范围，本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上的改动都是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测方法，其特征在于：

(a)脉冲激光光源发出的脉冲激光束通过扩束镜扩束后透过分光镜，由物镜会聚后照射在待测样品上；

(b)从待测样品激发出来的荧光通过所述物镜收集后由所述分光镜反射进入分光系统，并由分光系统分成N路，对所分出来的每一路荧光用不同中心波长的窄带滤光片对其进行滤光，各窄带滤光片对应的中心波长为λ _n ，带通宽度为δλ _n ，其中，n=1, 2, …, N；

(c)使用N个光强传感器分别测量由各窄带滤光片滤得的对应波长下随时间变化的荧光光强信息，数据分析后得到对应波长下的荧光寿命及不同波长之间的相对荧光强度谱；

(d)依据待测样品在不同波长下的荧光寿命及荧光强度谱信息，鉴别待测样品的化学成分。

2.根据权利要求1所述的多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测方法，其特征在于：所述步骤(d)中鉴别待测样品的化学成分时：通过待测样品在不同波长下的荧光寿命对待测样品的化学成分进行鉴别。

3.根据权利要求1或2所述的多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测方法，其特征在于：在所述N个光强传感器前分别加上会聚透镜和针孔：针孔放置在会聚透镜的焦点位置处，会聚透镜将各不同波长的荧光光束会聚后通过针孔进行空间滤波，由各光强传感器分别探测滤波后的荧光光强信息。

4.多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，包括脉冲激光光源，其特征在于：所述装置包括扩束镜、分光镜、物镜、分光系统、N个窄带滤光片、N个光强传感器，信号采集器，计算机；其中扩束镜、分光镜、物镜依次放置在脉冲激光出射的方向；分光系统放在分光镜反射的方向，分光系统将从待测样品激发出来的荧光分成N路，分别经过N个窄带滤光片滤光后由N个光强传感器探测接收；信号采集器将各光强传感器测得的荧光光强信息转化后传输给计算机，由计算机分析得到不同中心波长下荧光寿命及相对荧光强度谱。

5.根据权利要求4所述的多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：在所述N个光强传感器前分别加上会聚透镜和针孔：针孔放置在会聚透镜的焦点位置处，会聚透镜将各不同波长的荧光光束会聚后通过针孔进行空间滤波，由各光强传感器分别探测滤波后的荧光光强信息。

6.根据权利要求4或5所述的多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：将待测样品放置在二维平移台上：由二维平移台对待测样品进行垂直于物镜出射光束光轴方向的二维扫描，测得待测样品不同位置处激发出来的不同波长下的荧光寿命及相对荧光强度谱信息，进而得到待测样品二维荧光寿命及荧光强度谱分布。

7.根据权利要求4或5所述的多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：在分光镜和物镜之间加入二维光束扫描系统：由二维光束扫描系统对从物镜出射的聚焦光束的焦点沿着垂直于聚焦光束光轴的方向进行二维扫描，得到待测样品不同位置处激发出来的不同波长下的荧光寿命及相对荧光强度谱信息，进而得到待测样品二维荧光寿命及荧光强度谱分布。

8.根据权利要求4或5所述的多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：将待测样品放置在三维平移台上：由三维平移台对待测样品进行三维扫描，测得待测样品不同位置处激发出来的不同波长下的荧光寿命及相对荧光强度谱信息，进而得到待测样品三维荧光寿命及荧光强度谱分布。

9.根据权利要求4或5所述的多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：所述分光系统包括（N-1）个二向色分光镜和反射镜：由所述（N-1）个二向色分光镜将收集的荧光光束进行（N-1）次分光，由所述反射镜对光进行折转，得到N路不同波长带的荧光光束。

10.根据权利要求4或5所述的多探测器分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：用多光强传感器组替代所述使用的N个光强传感器：多光强传感器组由N个光强传感器组成，用多光强传感器组中的各光强传感器分别探测得到对应的荧光强度信息。