CN108507986A - 差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法与装置 - Google Patents

Abstract

本发明属于化学物质检测技术领域，涉及一种差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法与装置。本发明基本思想是将具有精密轴向分辨率的差动共焦物体表面定位技术和分立荧光光谱和荧光寿命测量技术相融合；利用差动共焦技术解决待测样品表面三维形貌的高精度测量，同时利用分立荧光光谱及荧光寿命探测技术解决待测样品表面各点的荧光光谱及荧光寿命的高灵敏度检测，进而得到三维高分辨空间物质成分分布信息。本发明首次将差动共焦测量技术和荧光物质成分探测技术相融合，保证荧光成像系统在待测样品表面每一个位置都具有相同的横向分辨率，并最终将测得的荧光光谱分布和三维形貌进行精确的对应。此技术在生物学，医学，材料科学以及临床医学诊断领域具有广泛的应用前景。

Description

差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法与装置

技术领域

本发明属于化学物质检测技术领域，不仅可以对物质的成分进行高灵敏度鉴别，还可以对物质成分的空间分布进行探测，将在生物学、医学、材料科学等研究领域及临床医学诊断方面具有重要应用。

背景技术

在生物、物理、化学和材料等学科领域，光谱检测和分析由于其具有非常高的灵敏度、分子特异性和非接触测量特性已经成为基础研究的一项基本的测量手段。其中，荧光光谱检测是利用物质在紫外光照射下产生荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析的方法。特别是对大多数有机化合物来说，其产生的荧光通常具有很强的特异性，指向性。。因此荧光光谱检测尤其适合运用于这些荧光特异性强的有机化合物的成分分析。在工业界，荧光光谱检测可用于各种污染物的成分检测、工业原料成分检测、石油原油成分检测等等。在食品安全领域，荧光光谱检测可用于对食品的霉变细菌、农药残留量等信息进行检测和监控。在医学领域，荧光光谱技术和荧光显微成像技术为肿瘤和癌症的实时成像和检测提供了新的方向，并且有望发展成为适用于临床诊断的医疗技术。由此可见，荧光光谱检测技术是一种非常实用而且有前景的光学检测手段。

通常，荧光测量技术包括荧光光谱测量和荧光寿命测量两种方式。荧光光谱测量技术是通过对从待检样品发出荧光的光谱分布检测来实现的，即固定激发波长，探测出样品的发射光强与入射光波长的关系曲线。荧光光谱技术经常跟荧光探针相结合，应用在DNA测序、高分子材料科学、生物荧光成像等领域。与此相对，荧光寿命检测是测量脉冲激光激发后从待检样品中激发出的荧光强度降到激发时的荧光最大强度的1/e所需要的时间。荧光物质的荧光寿命与自身的结构、所处微环境的极性、粘度等条件直接相关，因此从样品所激发出来荧光的寿命值是绝对的，不受激发光强度、荧光团的浓度和光漂白等因素的影响，且不受其他限制强度测量因素的制约。通过对样品进行荧光寿命测量还可对待测样品所处的微环境的很多生化参数如pH值、离子浓度、温度等分布进行定量测量。

然而，在对待测样品的表面激发荧光进行扫描成像的过程中，当待测样品表面存在起伏不平时，无法保证激发光束在待测样品表面不同位置的光斑大小一致，进而导致检测系统在不同位置处分辨率无法保持一致。尤其对于一些起伏较大的样品，甚至存在由于系统测量物镜工作距离很小造成在样品扫描过程中物镜碰撞待测样品的可能性，最终不但得不到样品表面的荧光分布成像，而且会导致系统物镜的表面受到污染。

共聚焦技术，采用针孔滤除焦点外的散射光，相对于传统显微镜具有较高的横向分辨率，并且具有独特的轴向层析能力。而差动共焦技术，则是在共焦显微测量原理的基础之上，在共焦检测光路中加入分光棱镜，光强信号被分为两路，将针孔分别放置在物镜像焦平面前后对称的位置上，通过检测透过针孔的两路光强的差值，即系统的差动共焦响应信号来反映物体偏离焦平面的距离。相比于共焦探测系统，差动共焦探测系统利用了灵敏度最大的过零点信息来定位被测样品的表面，定位精度显著提高。且差动共焦响应曲线具有双极性，可用的线性区域也很大，能根据探测到的差动共焦信号大小及其极性直接得到其表面高度信息，不需要将焦点完整地扫描过样品表面。此外，差动方式可以有效抑制光源的漂移和传感器的电子漂移，以及被测物表面反射率波动等产生的共模噪声，提高系统的信噪比和稳定性。

因此，如果能将具有精密轴向分辨率的差动共焦技术，运用在荧光扫描成像系统中，可保证荧光成像系统在待测样品表面每一个位置都保证相同的横向分辨率，并有效避免扫描过程中物镜撞击表面起伏较大的待测样品的可能性。同时，在整个扫描测量过程完成以后可同时得到待测样品高分辨的物体三维形貌信息，并且测得的荧光光谱分布可以和三维形貌进行精确的对应。这将对系统精确地分析待测样品的空间成分分布具有重大的意义，可在生物学、材料学、医学等研究领域得到广泛应用。

发明内容

为了解决具有三维空间形状待测样品的表面荧光光谱及荧光寿命测量难题，同时得到待测样品的三维形貌信息及其各位置点对应的荧光光谱信息和荧光寿命信息，本发明提出了“差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法与装置”：将差动共焦物体表面定位技术和分立荧光光谱和荧光寿命测量技术相融合；利用差动共焦技术实现待测样品表面三维形貌的高精度测量，同时利用分立荧光光谱及荧光寿命探测技术实现待测样品表面各点的荧光光谱及荧光寿命的高灵敏度检测，进而得到三维高分辨空间物质成分分布信息。

一方面，本发明提供一种差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法，其步骤为：

(a)通过第一分光镜将脉冲激光光源发出的脉冲激光和连续激光光源发出的连续激光进行合并，形成合成光束，所述脉冲激光和连续激光波长相同；所述合成光束经过扩束镜扩束后透过第二分光镜，由物镜会聚形成探测光束照射在待测样品上；定义垂直于所述探测光束光轴的两正交方向分别为x和y方向，沿探测光束光轴的方向为z方向；

(b)所述探测光束照射待测样品产生的后向散射光和从待测样品激发出来的荧光一起通过物镜收集后由第二分光镜反射；由第二分光镜反射的光束经过一号二向色分光镜后分成两路，一路为波长和探测光束波长相同的本征光束，另一路为波长不同于探测光束波长的荧光光束；所述本征光束进入差动共焦探测系统，所述荧光光束进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；

(c)打开连续激光光源，沿x和y方向移动待测样品至横向扫描起始位置(x ₁, y ₁)，然后在该位置沿z方向扫描待测样品，利用差动共焦探测系统测得随扫描位置变化的差动共焦响应信号，进而根据差动共焦响应信号的零点精确确定探测光束聚焦在待测样品的表面位置；

(d)关闭连续激光光源，根据步骤(c)的测量结果移动待测样品，使得探测光束聚焦在待测样品表面，控制脉冲激光光源发出脉冲激光，由脉冲激光在待测样品表面上激发出荧光，通过分立荧光光谱及荧光寿命探测系统，探测得到不同波长下随时间变化的荧光光强信息；并对所述信息进行数据分析后得到不同波长下的荧光寿命；

(e)沿x和y方向扫描待测样品，重复上述步骤，在每一个扫描点(x _i , y _i )位置处利用差动共焦探测系统确定待测样品在该位置处的表面信息，并利用分立荧光光谱及荧光寿命探测系统测量从该位置处样品表面激发出来的荧光在不同波长下的荧光寿命；

(f)将得到的待测样品在每一个扫描点(x _i , y _i )位置的表面高度信息和对应的荧光寿命信息进行重构，同时得到被测样品的三维形貌轮廓及其表面各点在不同波长下的荧光寿命。

另一方面，本发明还提供了差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，包括脉冲激光光源和连续激光光源，还包括第一分光镜、扩束镜、第二分光镜、物镜、一号二向色分光镜、差动共焦探测系统、分立荧光光谱及荧光寿命探测系统、三维平移台、信号采集器以及计算机；

其中，第一分光镜将脉冲激光光源发出的脉冲激光和连续激光光源发出的连续激光进行合并，形成合成光束；扩束镜、第二分光镜和物镜依次位于所述合成光束的出射方向上，扩束镜将合成光束进行扩束，物镜将合成光束会聚后形成探测光束照射在待测样品上；从待测样品上激发出来的后向反射光及荧光通过所述物镜收集后由第二分光镜反射；从所述第二分光镜反射后的光束由一号二向色分光镜分光，一路为波长和探测光束波长相同的本征光束，进入差动共焦探测系统，另一路为波长不同于探测光束波长的荧光光束，进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；

待测样品放置在三维平移台上，通过计算机控制三维平移台带动待测样品沿空间三个方向进行扫描平移；信号采集器将差动差动差动共焦探测系统探测得到的随待测样品位置变化的聚焦误差信号响应值及分立荧光光谱及荧光寿命探测系统测得的NN个不同波长下随时间变化的荧光光强信息转化后传输给计算机，由所述计算机分析得到差动共焦响应曲线和不同中心波长下荧光寿命及相对荧光强度谱。

本发明对比已有技术具有以下创新点：

1.将差动共焦三维形貌测量技术与荧光光谱和寿命成像技术结合起来，可同时得到三维待测样品的空间形貌以及其空间表面各点的荧光光谱和荧光寿命，进而得到三维高分辨空间物质成分分布信息；

2.在测量过程中，差动共焦探测系统利用了荧光检测过程中被废弃的与激发光具有相同波长的本征光，因此不会对荧光检测造成任何影响，充分合理地利用了从待测样品反射回来的各个波段的光信息；

3.使用多个光强传感器同时探测不同波长下荧光的寿命，并基于此鉴别待测样品化学成分，具有较高的鉴别速度及鉴别准确度；

4.本发明同时探测待测样品在不同波长下的荧光寿命及不同波长之间的相对荧光强度信息，信息量大；

5.本发明可用于自发荧光的高灵敏度测量，利用待测样品的自发荧光来检测其化学成分，在检测过程中无需使用荧光标记物，因此检测过程非常方便。

本发明对比已有技术具有以下显著优点：

1.可同时实现三维待测样品的空间形貌测量以及其空间表面各点的荧光光谱和荧光寿命测量，为样品的三维化学成分分析提供更加丰富的信息；

2.多传感器同时测量可以消除各激光脉冲强度不稳定因素造成的测量精度受限问题；

3.差动共焦测量具有信噪比高、稳定性好、轴向分辨率高的特性，有助于对待测样品的成分分布进行精确的定位；

4.可同时探测待测样品在不同波长下的荧光寿命及相对荧光强度谱信息，为物质成分的检测同时提供了两个不同的方法。

附图说明

图1为本发明差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法的示意图；

图2为本发明差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置的示意图；

图3为本发明差动共焦探测系统的示意图；

图4为本发明利用二向色分光镜、窄带滤光片和光强传感器组成的分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；

图5 为本发明利用二向色分光镜、窄带滤光片、会聚透镜、针孔和光强传感器组成的分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；

图6为本发明分立荧光光谱及荧光寿命探测系统中用多光强传感器组替代N个光强传感器的示意图；

图7为本发明利用二向色分光镜、带通窄带滤光片、光纤聚焦透镜、光纤延时线以及光强传感器组成的分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；

图8为本发明利用窄带滤光片转轮和光强传感器组成的分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；

图9为本发明差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测实施例的示意图；

图10为本发明共差动共焦响应曲线FES(z)的示意图；

其中：1-脉冲激光光源、2-连续激光光源、3-第一分光镜、4-扩束镜、5-第二分光镜、6-物镜、7-待测样品、8-三维平移台、9-一号二向色分光镜、10-差动共焦探测系统、11-分立荧光光谱及荧光寿命探测系统、12-信号采集器、13-计算机、14-差动共焦会聚透镜、15-差动共焦分光镜、16-焦后针孔、17-焦前针孔、18-焦后光强传感器、19-焦前光强传感器、20-二号二向色分光镜、21-三号二向色分光镜、22-N号二向色分光镜、23-一号窄带滤光片、24-二号窄带滤光片、25-（N-1）号窄带滤光片、26-N号窄带滤光片、27-一号光强传感器、28-二号光强传感器、29-（N-1）号光强传感器、30-N号光强传感器、31-一号会聚透镜、32-二号会聚透镜、33-（N-1）号会聚透镜，34-N号会聚透镜、35-一号针孔、36-二号针孔、37-第(N-1)号针孔、38-N号针孔、39-反射镜、40-多光强传感器组、41-第一光纤聚焦透镜、42-第二光纤聚焦透镜、43-第（N-1）光纤聚焦透镜、44-第N光纤聚焦透镜、45-第一光纤延时线、46-第二光纤延时线、47-第(N-1)光纤延时线、48-第N光纤延时线、49-（N+1）号光强传感器、50-滤光片转轮、51-（N+2）号光强传感器、52-四号二向色分光镜、53-三号窄带滤光片、54-四号窄带滤光片、55-第一光电倍增管、56-第二光电倍增管、57-第三光电倍增管、58-第四光电倍增管。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明的基本思想是将具有精密轴向分辨率的差动共焦物体表面定位技术和分立荧光光谱和荧光寿命测量技术相融合；利用差动共焦技术解决待测样品表面三维形貌的高精度测量，同时利用分立荧光光谱及荧光寿命探测技术解决待测样品表面各点的荧光光谱及荧光寿命的高灵敏度检测，进而得到三维高分辨空间物质成分分布信息。在样品表面的荧光信息测量过程中，本发明使用了多种不同的分立荧光探测手段，使用者可以根据具体的应用需求，选择具体的不同的荧光光谱和荧光寿命探测方法。同时，使用者还可以根据待测物质的化学特性，选择是使用荧光光谱检测，还是使用荧光寿命检测，还是两者相结合来鉴别其物质成分。

实施例1

本实施例需要解决的问题是同时扫描待测样品的三维形貌及分析肿瘤组织在待测样品中的空间分布情况，并据此判断肿瘤组织的边界信息。本实施例使用共焦探测系统来实现三维形貌的测量，利用从样品中由355 nm波长脉冲激光激发出来的400 nm，450 nm，530nm和580 nm这四个波长的荧光寿命来判断各扫描点是否为肿瘤细胞。由于样品的荧光信号非常微弱，因此本实施例使用了光电倍增管作为荧光探测的光强传感器来提高系统的荧光光强探测灵敏度。

图9为本实施例在实现差动共焦分立荧光光谱和荧光寿命探测时的具体实施装置，包括脉冲激光光源1、连续激光光源2、第一分光镜3、扩束镜4、第二分光镜5、物镜6、三维平移台8、一号二向色分光镜9、差动共焦探测系统10、分立荧光光谱及荧光寿命探测系统11、信号采集器12、计算机13。其中，脉冲激光光源1和连续激光光源2的波长均为355 nm，脉冲激光光源1的脉冲宽度为2 ns。脉冲激光光源1和连续激光光源2发出的激光通过第一分光镜3合束后依次经过扩束镜4、第二分光镜5和物镜6以后形成探测光束照射在待测样品7上。待测样品7放置于三维平移台8上，由三维平移台8对其进行扫描。光束照射待测样品7产生的后向散射光和从待测样品7中激发出来的荧光一起通过物镜6收集后由第二分光镜5反射；由第二分光镜5反射的光束经过一号二向色分光镜9后分成两路，一路为波长和探测光束波长相同的本征光束，进入差动共焦探测系统10，另一路为波长不同于探测光束波长的荧光光束，进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统11。

在本系统中，差动共焦探测系统10包括差动共焦会聚透镜14，差动共焦分光镜15，焦后针孔16，焦前针孔17，焦后光强传感器18，焦前光强传感器19。焦后针孔16和焦前针孔17关于差动共焦会聚透镜14的焦平面对称。进入差动共焦探测系统10的光束，先经过差动共焦会聚透镜14，然后被差动共焦分光镜15后分成两路，一路经过焦后针孔16，被焦后光强传感器18接收，另一路经过焦前针孔17，被焦前光强传感器19接收。分立荧光光谱及荧光寿命探测系统11包括二号二向色分光镜20，三号二向色分光镜21，四号二向色分光镜52，一号窄带滤光片23，二号窄带滤光片24，三号窄带滤光片53，四号窄带滤光片54，第一光电倍增管55，第二光电倍增管56，第三光电倍增管57，第四光电倍增管58。二号二向色分光镜20、三号二向色分光镜21和四号二向色分光镜52将进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统11的光束进行3次分光，得到4路不同波长带的荧光光束。这4路不同波长带的荧光光束分别经一号窄带滤光片23、二号窄带滤光片24、三号窄带滤光片53和四号窄带滤光片54后由第一光电倍增管55、第二光电倍增管56、第三光电倍增管57和第四光电倍增管58探测接收。各窄带滤光片对应的中心波长分别是400 nm，450 nm，530 nm和580 nm。信号采集器12用来采集差动共焦探测系统10和分立荧光光谱及荧光寿命探测系统11中各光强传感器采集得到的光强信息，并将其转化后传输给计算机13。计算机13对采集得到的光强信息进行分析后得到差动共焦响应曲线和各波长下随时间变化的荧光光强信息。定义垂直于所述探测光束光轴的两正交方向分别为x和y方向，沿探测光束光轴的方向为z方向。

其对待测样品成分鉴别的步骤是：

(a) 打开连续激光光源2，沿x和y方向移动待测样品7至横向扫描起始位置(x ₁ , y ₁)，然后在该位置沿z方向扫描待测样品7。利用差动共焦探测系统10, 测得随扫描位置变化的焦后光强响应曲线I ₁(z)和焦前光强响应曲线I ₁(z)，将焦后光强响应曲线I ₁(z)和焦前光强响应曲线I ₁(z)相减后得到差动共焦响应曲线FES(z)，如附图10所示。进而根据差动共焦响应曲线的过零点精确确定探测光束聚焦在待测样品的表面位置，记录该扫描位置(x ₁ , y ₁)处被测样品7的表面位置高度为z ₁。

(b) 关闭连续激光光源，根据步骤(a)测量结果移动待测样品7，使得探测光束聚焦在待测样品7表面，控制脉冲激光光源1发出脉冲激光，由脉冲激光在待测样品7表面上激发出荧光，所激发出来的荧光由物镜6收集后被第二分光镜5反射，然后透过一号二向色分光镜9进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统11。进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统11的荧光经过二号二向色分光镜20后分成两路，其中反射光束的波长范围为360 nm~430nm，透过光束的波长范围为430 nm~700 nm；从二号二向色分光镜20透过的光束经过三号二向色分光镜21后又分成两路，其中反射光束的波长范围为430 nm~480 nm，透过光束的波长范围为480 nm~700 nm；从三号二向色分光镜21透过的光束经过四号二向色分光镜52后又分成两路，其中反射光束的波长范围为480 nm~550 nm，透过光束的波长范围为550 nm~700nm。由二号二向色分光镜20反射的光束透一号窄带滤光片23后照射在第一光电倍增管55上。一号窄带滤光片23的中心波长为400 nm，带通宽度为10 nm。因此由第一光电倍增管55接收的荧光的中心波长为400 nm。由三号二向色分光镜21反射的光束透过二号窄带滤光片24后照射在第二光电倍增管56上。二号窄带滤光片24的中心波长为450 nm，带通宽度为10nm。因此由第二光电倍增管56接收的荧光的中心波长为450 nm。由四号二向色分光镜52反射的光束透过三号窄带滤光片54后照射在第三光电倍增管57上；三号窄带滤光片54的中心波长为530 nm，带通宽度为10 nm。因此由第三光电倍增管57接收的荧光的中心波长为530nm。四号窄带滤光片54的中心波长为580 nm，带通宽度为10 nm；因此由第四光电倍增管58接收的荧光的中心波长为580 nm。

(c) 将第一光电倍增管52探测得到的中心波长400 nm下随时间变化的荧光信息，第二光电倍增管53探测得到的中心波长450 nm下随时间变化的荧光信息，第三光电倍增管54探测得到的中心波长530 nm下随时间变化的荧光信息，以及第四光电倍增管55探测得到的中心波长580 nm下随时间变化的荧光信息同时通过信号采集器12采集后传输给计算机13。计算机13通过对这些不同中心波长下随时间变化的荧光信号进行处理，得到各波长对应的荧光寿命。其中，中心波长400 nm对应的荧光寿命为10.5 ns，中心波长450 nm对应的荧光寿命为7.3 ns，中心波长530 nm对应的荧光寿命为13.3 ns，中心波长580 nm对应的荧光寿命为6.7 ns。

(d) 根据正常组织在各波长下荧光的荧光寿命：波长400nm对应的荧光寿命为9ns~13 ns之间，波长450 nm对应的荧光寿命为10 ns~14 ns之间，波长530 nm对应的荧光寿命为12 ns~15 ns之间，波长580 nm对应的荧光寿命为11 ns~14 ns之间；肿瘤组织在各波长下荧光的荧光寿命：波长400 nm对应的荧光寿命为8 ns~11 ns之间，波长450 nm对应的荧光寿命为6 ns~8 ns之间，波长530 nm对应的荧光寿命为13 ns~16 ns之间，波长580 nm对应的荧光寿命为5 ns~7 ns之间；可以确定从待测样品7表面（x _1, y ₁ , z ₁）处激发出来的荧光寿命信息与肿瘤组织的荧光寿命完全匹配，因而可以判断在（x ₁ , y ₁ , z ₁）处为肿瘤组织。

(e) 沿x和y方向扫描待测样品，重复步骤(a)-(d)，在每一个扫描点(x _i , y _i )位置处利用差动共焦探测系统10确定待测样品7在该位置处的表面信息z _i ，利用分立荧光光谱及荧光寿命探测系统11测量从该位置处激发出来的荧光在不同波长下的荧光寿命，并基于此判断该处组织为正常组织还是肿瘤组织。

(f) 将上述信息进行得到的待测样品在每一个扫描点(x _i , y _i )位置的表面位置信息z _i 和对应的荧光寿命信息进行重构，同时得到被测样品7的三维形貌轮廓及其表面各点在不同波长下的荧光寿命，并得到表面各点为肿瘤组织还是正常组织的判断结果。进而根据这些信息，可以得到肿瘤组织在待测样品7中的空间分布情况，以及肿瘤组织的三维边界信息。

实施例2

与实施例1不同的是，本实施例利用荧光的光谱强度差异来判断待测样品7表面各点是肿瘤组织还是正常组织。 所用装置及待测样品跟实施例1相同。为提高荧光光谱测量的稳定性，本实施例采用连续激光光源2发出的光束来激发待测样品7产生荧光，其测量步骤如下：

(a) 打开连续激光光源2，沿x和y方向移动待测样品7至横向扫描起始位置(x ₁ , y ₁)，然后在该位置沿z方向扫描待测样品7。利用差动共焦探测系统10, 测得随扫描位置变化的焦后光强响应曲线I ₁(z)和焦前光强响应曲线I ₁(z)，将焦后光强响应曲线I ₁(z)和焦前光强响应曲线I ₁(z)相减后得到差动共焦响应曲线FES(z)，如附图10所示。进而根据差动共焦响应曲线的过零点精确确定探测光束聚焦在待测样品的表面位置，记录该扫描位置(x ₁ , y ₁)处被测样品7的表面位置高度为z ₁。

(b) 根据步骤(a)测量结果移动待测样品7，使得探测光束聚焦在待测样品7表面，由连续激光光源2发出的连续激光照射在待测样品7表面上激发出荧光，所激发出来的荧光由物镜6收集后被第二分光镜5反射，然后透过一号二向色分光镜9进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统11。进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统11的荧光经过二号二向色分光镜20后分成两路，其中反射光束的波长范围为360 nm~430 nm，透过光束的波长范围为430nm~700 nm；从二号二向色分光镜20透过的光束经过三号二向色分光镜21后又分成两路，其中反射光束的波长范围为430 nm~480 nm，透过光束的波长范围为480 nm~700 nm；从三号二向色分光镜21透过的光束经过四号二向色分光镜52后又分成两路，其中反射光束的波长范围为480 nm~550 nm，透过光束的波长范围为550 nm~700 nm。由二号二向色分光镜20反射的光束透过第一窄带滤光片23后照射在第一光电倍增管55上。第一窄带滤光片23的中心波长为400 nm，带通宽度为10 nm。因此由第一光电倍增管55接收的荧光的中心波长为400nm。由三号二向色分光镜21反射的光束透过第二窄带滤光片24后照射在第二光电倍增管56上。第二窄带滤光片24的中心波长为450 nm，带通宽度为10 nm。因此由第二光电倍增管56接收的荧光的中心波长为450 nm。由四号二向色分光镜52反射的光束透过第三窄带滤光片53后照射在第三光电倍增管56上；第三窄带滤光片53的中心波长为530 nm，带通宽度为10nm。因此由第三光电倍增管56接收的荧光的中心波长为530 nm。第四窄带滤光片54的中心波长为580 nm，带通宽度为10 nm；因此由第四光电倍增管58接收的荧光的中心波长为580nm。计算机13通过对这些不同中心波长下的荧光信号进行处理，得到各波长对应的荧光强度信息。其中，中心波长400 nm对应的荧光强度为5.6 µW；中心波长450 nm对应的荧光强度为8.4 µW；中心波长530 nm对应的荧光强度为4.5 µW；中心波长580nm对应的荧光强度为9.8 µW。进而可以得到该待测样品7在400 nm、450 nm、530 nm和580 nm下的相对荧光强度谱为0.57:0.86:0.46:1。

(c)根据正常组织在这四个波长荧光信息中峰值荧光谱为530 nm，而肿瘤组织在这四个波长荧光信息中峰值荧光谱为580 nm，得到待测样品7在其表面点(x ₁ ,y ₁ ,z ₁)处为肿瘤组织。

(d)沿x和y方向扫描待测样品，重复步骤(a)-(c)，在每一个扫描点(x _i , y _i )位置处利用差动共焦探测系统10确定待测样品7在该位置处的表面信息z _i ，利用分立荧光光谱及荧光寿命探测系统11测量从该位置处激发出来的荧光在不同波长下的荧光强度，并基于此判断该处组织为正常组织还是肿瘤组织。

(e)将上述信息进行得到的待测样品在每一个扫描点(x _i , y _i )位置的表面位置信息z _i 和对应的荧光寿命信息进行重构，同时得到被测样品7的三维形貌轮廓及其表面各点的分立荧光光谱，并得到表面各点为肿瘤组织还是正常组织的判断结果。进而根据这些信息，可以得到肿瘤组织在待测样品7中的空间分布情况，以及肿瘤组织的三维边界信息。

实施例3

与实施例1不同的是，如附图5所示，为提高探测光束的分辨率，在分立荧光光谱及荧光寿命探测系统11的所有光强传感器前都分别加上会聚透镜和针孔。针孔放置在会聚透镜的焦点位置处，会聚透镜将各不同波长的荧光光束会聚后通过针孔进行空间滤波。因此，各光强传感器探测到的荧光信号均为滤波后的荧光光强信息，这些滤波后的荧光准确对应着探测光束聚焦焦点激发出来的荧光信号，将焦点之外的荧光信号进行了有效的屏蔽。

实施例4

与实施例1不同的是，如附图6所示，为简化系统结构，降低系统成本，本实施例用阵列光电倍增管探测器作为多光强传感器组替代所述使用的四个光电倍增管探测器，用阵列光电倍增管探测器中不同的探测单元分别探测得到不同波长的荧光信息。

实施例5

与实施例1不同的是，如附图7所示，分立荧光光谱及荧光寿命探测系统包括3个二向色分光镜（该实施例中N = 4）、4个窄带滤光片、4个光纤聚焦透镜、4个具有不同延时时间的光纤延时线以及一个（N+1）号光强传感器49。由这3个二向色分光镜将从待测样品激发出来的荧光光束进行3次分光，得到4路不同波长带的荧光光束；这4路不同波长带的荧光光束分别经4个窄带滤光片滤光后由4个光纤聚焦透镜耦合进入4个具有不同延时时间的光纤延时线。经过光纤延时线延时后的4路荧光在光纤延时线末端合成输出，由（N+1）号光强传感器46探测接收。此时不同波长的荧光将在不同时刻到达（N+1）号光强传感器46，因此可以根据不同的时段将不同波长下的荧光信息分开。这种方式有利于简化系统结构，缩小系统体积，降低系统成本。

实施例6

与实施例1不同的是，如附图8所示，利用滤光片转轮50和（N+2）号光强传感器51组成分立荧光光谱及荧光寿命探测系统11。滤光片转轮50由4个具有不同中心波长的窄带滤光片组成（该实施例中N = 4），滤光片转轮50每转动一下，脉冲激光光源发出一个脉冲激光，从待测样品7激发出来的荧光光束透过对应中心波长下的窄带滤光片，（N+2）号光强探测器51测得相应波长下随时间变化的荧光光强信息。因而，滤光片转轮50转动4次后可以得到4个不同波长下随时间变化的荧光光强信息。利用转动滤光片转轮50的方法，可以减少使用的光强探测器的个数，因此显著降低了系统成本。

以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本发明的范围，本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上的改动都是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法，其特征在于：

(a)通过第一分光镜将脉冲激光光源发出的脉冲激光和连续激光光源发出的连续激光进行合并，形成合成光束，所述脉冲激光和连续激光波长相同；所述合成光束经过扩束镜扩束后透过第二分光镜，由物镜会聚形成探测光束照射在待测样品上；定义垂直于所述探测光束光轴的两正交方向分别为x和y方向，沿探测光束光轴的方向为z方向；

(b)所述探测光束照射待测样品产生的后向散射光和从待测样品激发出来的荧光一起通过物镜收集后由所述第二分光镜反射；由第二分光镜反射的光束经过一号二向色分光镜后分成两路，一路为波长和探测光束波长相同的本征光束，另一路为波长不同于探测光束波长的荧光光束；所述本征光束进入差动共焦探测系统，所述荧光光束进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；

(c)打开连续激光光源，沿x和y方向移动待测样品至横向扫描起始位置(x ₁, y ₁)，然后在该位置沿z方向扫描待测样品，利用差动共焦探测系统测得随扫描位置变化的差动共焦响应信号，进而根据差动共焦响应信号的零点精确确定探测光束聚焦在待测样品的表面位置；

(d)关闭连续激光光源，根据步骤(c)的测量结果移动待测样品，使得探测光束聚焦在待测样品表面，控制脉冲激光光源发出脉冲激光，由脉冲激光在待测样品表面上激发出荧光，通过分立荧光光谱及荧光寿命探测系统，探测得到不同波长下随时间变化的荧光光强信息；并对所述信息进行数据分析后得到不同波长下的荧光寿命；

(e)沿x和y方向扫描待测样品，重复上述步骤，在每一个扫描点(x _i , y _i )位置处利用差动共焦探测系统确定待测样品在该位置处的表面高度信息，并利用分立荧光光谱及荧光寿命探测系统测量从该位置处待测样品表面激发出来的荧光在不同波长下的荧光寿命；

(f)将得到的待测样品在每一个扫描点(x _i , y _i )位置的表面高度信息和对应的荧光寿命信息进行重构，同时得到被测样品的三维形貌轮廓及其表面各点在不同波长下的荧光寿命。

2.根据权利要求1所述的差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法，其特征在于：差动共焦系统采集得到的差动共焦响应曲线的线性区域的零点处对应探测光束光斑精确聚焦在探测样品表面位置，此处聚焦光斑尺寸最小，探测区域最小；差动共焦系统采集得到的差动共焦响应曲线的其他位置对应探测光束聚焦在偏离表面的位置处，差动共焦响应曲线的正负能够表征探测光束焦点偏离或靠近待测样品表面的方向；测量待测样品表面位置处不同波长下的荧光寿命时，根据差动共焦响应曲线控制探测光束在待测样品的表面光斑大小，进而根据实际测量需求控制聚焦光斑的尺寸，实现对样品探测区域大小的可控。

3.差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，包括脉冲激光光源和连续激光光源，其特征在于：包括第一分光镜、扩束镜、第二分光镜、物镜、一号二向色分光镜、差动共焦探测系统、分立荧光光谱及荧光寿命探测系统、三维平移台、信号采集器以及计算机；

其中，第一分光镜将脉冲激光光源发出的脉冲激光和连续激光光源发出的连续激光进行合并，形成合成光束；扩束镜、第二分光镜和物镜依次位于所述合成光束的出射方向上，扩束镜将合成光束进行扩束，物镜将合成光束会聚后形成探测光束照射在待测样品上；探测光束照射待测样品产生的后向散射光和从待测样品激发出来的荧光一起通过物镜收集后由第二分光镜反射；从所述第二分光镜反射后的光束由一号二向色分光镜分光，一路为波长和探测光束波长相同的本征光束，进入差动共焦探测系统，另一路为波长不同于探测光束波长的荧光光束，进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；

待测样品放置在三维平移台上，通过计算机控制三维平移台带动待测样品沿空间三个方向进行扫描平移；信号采集器将差动共焦探测系统探测得到的随待测样品位置变化的差动共焦光强响应值及分立荧光光谱及荧光寿命探测系统测得的N个不同波长下随时间变化的荧光光强信息转化后传输给计算机，由所述计算机分析得到差动共焦响应曲线和不同中心波长下荧光寿命及相对荧光强度谱。

4.根据权利要求3所述的差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：所述差动共焦探测系统包括差动共焦会聚透镜、差动共焦分光镜、焦后针孔、焦前针孔、焦后光强传感器和焦前光强传感器；光束经过差动共焦会聚透镜之后，由差动共焦分光镜分成两路，一路经过焦后针孔，被焦后光强传感器接收，另一路经过焦前针孔，被焦前光强传感器接收；焦后针孔位于差动共焦会聚透镜焦点的后面，焦前针孔位于差动共焦会聚透镜焦点的前面；焦后针孔和焦前针孔的位置相对于差动共焦会聚透镜的焦平面对称；由焦后光强传感器测得焦后光强响应曲线，由焦前光强传感器测得焦前光强响应曲线，将焦后光强响应曲线和焦前光强响应曲线相减后得到差动共焦响应曲线。

5.根据权利要求3所述的差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，所述分立荧光光谱及荧光寿命探测系统包括（N-1）个二向色分光镜、N个窄带滤光片、N个光强传感器：由所述（N-1）个二向色分光镜将从待测样品激发出来的荧光光束进行（N-1）次分光，得到N路不同波长带的荧光光束；所述N路不同波长带的荧光光束分别经N个窄带滤光片滤光后由N个光强传感器探测接收，得到N个不同波长下随时间变化的荧光光强信息；各窄带滤光片对应的中心波长为λ _n ，带通宽度为δλ _n ，其中，n=1, 2, …, N。

6.根据权利要求5所述的差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：用多光强传感器组替代所述使用的N个光强传感器：多光强传感器组由N个光强传感器组成，用多光强传感器组中的各光强传感器分别探测得到对应的荧光强度信息。

7.根据权利要求3所述的差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：所述分立荧光光谱及荧光寿命探测系统包括（N-1）个二向色分光镜、N个窄带滤光片、N个光纤聚焦透镜、N个具有不同延时时间的光纤延时线以及（N+1）号光强传感器：由所述（N-1）个二向色分光镜将从待测样品激发出来的荧光光束进行（N-1）次分光，得到N路不同波长带的荧光光束；所述N路不同波长带的荧光光束分别经N个窄带滤光片滤光后由N个光纤聚焦透镜耦合进入N个具有不同延时时间的光纤延时线；经过光纤延时线延时后的N路荧光在光纤延时线末端合成输出，由（N+1）号光强传感器探测接收；此时不同波长的荧光将在不同时刻到达（N+1）号光强传感器，因此可以根据不同的时段将不同波长下的荧光信息分开。

8.根据权利要求3所述的差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：所述分立荧光光谱及荧光寿命探测系统包括一个滤光片转轮和（N+2）号光强传感器：所述滤光片转轮上由N个具有不同中心波长的窄带滤光片组成，滤光片转轮每转动一下，脉冲激光光源发出一个脉冲激光，从待测样品激发出来的荧光光束透过对应中心波长下的窄带滤光片，（N+2）号光强传感器测得相应波长下随时间变化的荧光光强信息；滤光片转轮转动N次后可以得到N个不同波长下随时间变化的荧光光强信息。

9.根据权利要求5或8所述的差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测装置，其特征在于：在所述分立荧光光谱及荧光寿命探测系统的各光强传感器前分别加上会聚透镜和针孔：针孔放置在会聚透镜的焦点位置处，会聚透镜将各不同波长的荧光光束会聚后通过针孔进行空间滤波，所述各光强传感器探测滤波后的荧光光强信息。

10.差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法，其特征在于：

(a)通过第一分光镜将脉冲激光光源发出的脉冲激光和连续激光光源发出的连续激光进行合并，形成合成光束，所述脉冲激光和连续激光波长相同；所述合成光束经过扩束镜扩束后透过第二分光镜，由物镜会聚形成探测光束照射在待测样品上；定义垂直于所述探测光束光轴的两正交方向分别为x和y方向，沿探测光束光轴的方向为z方向；

(b)所述探测光束照射待测样品产生的后向散射光和从待测样品激发出来的荧光一起通过物镜收集后由第二分光镜反射；由第二分光镜反射的光束经过一号二向色分光镜后分成两路，一路为波长和探测光束波长相同的本征光束，另一路为波长不同于探测光束波长的荧光光束；所述本征光束进入差动共焦探测系统，所述荧光光束进入分立荧光光谱及荧光寿命探测系统；

(c)打开连续激光光源，沿x和y方向移动待测样品至横向扫描起始位置(x ₁ , y ₁)，然后在该位置沿z方向扫描待测样品，利用差动共焦探测系统测得随扫描位置变化的差动共焦响应曲线，进而根据共焦响应曲线的零点位置精确确定探测光束聚焦在待测样品的表面位置；

(d)根据步骤(c)测量结果移动待测样品，使得探测光束聚焦在待测样品表面，由连续激光在待测样品表面上激发出荧光，通过分立荧光光谱及荧光寿命探测系统，探测得到不同波长对应的荧光光强信息，并对其进行分析得到分立荧光光谱信息；

(e)沿x和y方向扫描待测样品，重复上述步骤，在每一个扫描点(x _i, y _i )位置处利用差动共焦探测系统确定待测样品在该位置处的表面高度信息，并利用分立荧光光谱及荧光寿命探测系统测得从该位置处待测样品表面激发出来的分立荧光光谱信息；

(f)将得到的待测样品在每一个扫描点(x _i , y _i )位置的表面高度信息和对应的分立荧光光谱信息进行重构，同时得到被测样品的三维形貌轮廓及其表面各点的分立荧光光谱。