JPS62500803A - 螢光結像系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 蛍光結像系 本発明は蛍光対象物を照射するだめの光源、ｈ記の照射の結果として対象物から 放射される蛍光放射を分離するだめのフィルター及び同フィルターを介して伝達 される放射を検知するための検知手段を含み、対象物と検知手段との間に結像光 学系が設けられており検知手段の近くに結像面か位置し、同面の上に対象物か結 像される蛍光結像系に係る。

この一般的な範鴫に入る系は、現在の技術水準において既知である。このような 系の例はしばしば調査作業に用いられる蛍光！ｉｉ微鏡検鏡検査系む。これ等の 装置は被検査物の中の蛍光物質によって生じる像を提供し、これ等の物質は天然 に存在する物質か又は蛍光染料である。

多くの固体又は液体物質は紫外線によって、照射された場合に蛍光放射を放射し 、同放射は低い構造面の広い波長帯域にあり、従って分光に基づく識別が困難で ある。しかしながら従来の蛍光分析例えば蛍光顕微鏡検査においては、光学系の 中に選択された波長の帯域のフィルターが通常組込まれている。状況がやや複雑 な場合には、被検見本の中に存在する多くの異なる化合物からの放射によって観 察がしばしば妨害される。

本発明の目的は所望の結像蛍光放射と妨害蛍光放射との間であるスペクトルが重 なりあう場合においても不適切な蛍光放射を取り除く事により有効性の高い蛍光 による再現か得られる蛍光結像系を提供するにある。

上記の目的は本発明において当初に記載されたビーム分割系が設けられており、 同系により光学系を介して導かれる蛍光放射を少なくとも３つの部分に分割し、 同部分のそれぞれか対象物の個々の像を形成し、結像面の中て相互に移動し結像 手段の中でそれぞれの検知領域に入り、ビームの種々の部分が、異なる周波数の 漏波帯域のそれぞれのフィルターを介して案内され、複数の波長範囲のそれぞれ に対して、複数の像点の形の対象物の像か生じ、上記の探知手段かそれぞれの像 点に対して、それぞれの信号を発生するように対象物の同一点に対応するそれぞ れの像点に対する信号に算数演算及び（又は）論理演算を行なうために設けられ た手段によりウェイトがつけられた信号値を表現して、上記の対象物の異なる点 に対するウェイトがつけられた信号値から対象物の像を発生する蛍光結像系を提 供する事により達せられる。

この結像系は色収差があってはならない。従って特に好まれる実施態様において はビーム分割系か、光学系の中に組込まれかついくつかの部分に分１１，１され た鏡を含み、Ｌ記の部分が相互に角度を有していて検知面の異なる部分に対象物 を結像させる。平面鏡及び球面鏡か両者共用いられ更に既知の構成の他のビーム 分割系も用いられる。用いられるフィルターは良好な帯域漏波曲線を生じるフィ ルター構造てなければならず、この点に関して干渉フィルターか用いられた場合 に特に有利である。

通常の蛍光結像と本発明による蛍光結像との間の違いを理解するためには、第２ 図ａに示されたスペクトルを考察する事が適切である。　癌細胞は、ヘマトポル フィリン誘導体（ＨＰＤ）を保持する能力を有する。この物質の特徴的な蛍光ス ペクトルは６１０〜７００ｎｒｎの範囲にあり、同範囲は図においてＡ及びＣの 記号がつけられた尖頭値に対応する。しかしながら細胞の中の他の物質が更に強 力に蛍光を発生し、第２図ａのＢにおいて示されているように、より幅の広い帯 域のスペクトルを生じる。破線で示された曲線の部分は、ＨＰＤから来る帯域の 構造Ａ及びＣがその上に重畳する不適切な蛍光放射の傾斜を有するパックグラウ ンドを示す０本発明により非常に広い範囲で、従来の蛍光顕微鏡検査におけるよ うに適切な放射に適合されたフィルターを１個しか用いない場合に像のコントラ ストを破壊するこの不適切な妨害源を取り除く事が出来る。

以下未発１１を添付の図面につき詳細に説明する。

第１図は本発明の原理により構成された蛍光結像系の模式図である。第２図ａは ＨＰＤによって処理された癌細胞のプレパラートから放射された蛍光放射のスペ クトルを示す。

第２図すは簡単には分離されない２つの蛍光スペクトルの図である。

第１１Ａは本発明による蛍光結像系の原理的構成を示す。紫外線を放射するため に用いられる光源はパルス窒素レーザー１か又はパルス光源又は連続光源１′で ある。特に好まれる実施態様においては１０〜１００Ｈｚのくり返し周波数の５ ｎｓパルスの：ｌ：１７ｎｍの光を放射するパルスＮ２レーザーが用いられる。

ＰＲＡモデルＬＮ２５０かこのようなレーザーの一例である。

非常に高い出力が望まれる場合にはＸｅＣｌレーザーか用いられる。Ｌａｍｂｄ ａ　Ｐｈｙｓｉｃ　Ｍｏｄｅｌ　ｌ０２Ｅがこのようなレーザーの一例である。

ある場合にはフィルターが設けられたパルス又は連続水銀又はクセノンランプ（ オリエル、オスラン）で充分である。対象物はある形式のコリメーター装置によ り照射されるので被検対象物は適当に照明される。これは石英シリンダーレンズ ２（エスコ製品）により達成される。この目的のために、紫外線の放射を完全に 反射するが、可視スペクトルの中にあり、赤外線の領域に近い蛍光放射に対して 非常に透明である。ダイクロイックＵＶ鏡３（バルツアーズ）が用いられる。こ の反射鏡は内視鏡、顕ａ鏡又は望遠鏡の形の光学系５の絞り全体をカバーするに 充分な大きさを有していなければならない。光学系５は４に対象物面を有する。

この系のもっとも簡単な変形においては、対象物かこの対象物面にｔかれる。対 象物面は表面にアルミが蒸着された球面鏡によって検知装置１１の上に結像する 。このような鏡は、　Ｂｅｒｎａｒｄ１１ａｌｌｅ社より入手出来る。このよう な鏡は色収差を除去ｌノである。この鏡は４つの部分に分割されており、それぞ れの部分は個別に調節されて鏡の４つの部分自体は相互に異なる４つの場入、入 ２人３人、の中に対象物面４を再現する。図示された実施態様においては検知装 ａｌｌは例えば５１２　ｘ５１２の感光探知安泰を内蔵するＲｅｔｉｃｏｉｉ社 のマトリックスダイオ−■・検査装置である。その代りに例えばビディコンチュ ーブが用いられる。通常イメージインテンシファイヤ（ＶＡＲＯ）が検知装置の 前におかれ、パルス光源から来るパルスに同期して励起され゛にの際より明るく 、よりシャープな像を生じる一方、周囲の光をおさえ、かつ信号／雑ｆｆ比を改 善する。検知装この前に方形の４つのフィルターか惹かれ、それぞれのフィルタ ーは、それぞれの波長の帯域の光を通過させる。これ等のフィルターは特に干渉 フィルターであるが２場合によりカラーフィルターも用いられる。、］−汁フイ ルターは０ｒｉｅ１社、又はＣｏｒｉｏｎ社から入手出来る。

検知装置の中て集積されたのち検知信号はコンピューターシステム１２に送られ 、同システムの中て信号は処理される。信号は充分に長い吟間に亘って蓄積され て良い信号・−雑音比が得られる。例えばレンズ系の中における歪みのために必 要な場合にζオ最初に座標の修正が行なわれる。

このようにして、それぞれの結像点に対して検知装置ｌｌから異なる４つの信号 か得られ、これ等の信号は以下に記載するように、算数的に処理され、その結果 はスクリーン１３の上で観察されるか又は記録器１４によって永久に記録される 。コンピューターシステム１２はターミナル１５を含み、同ターミナルにより像 の処理がコントロールされる。

第１図よりわかるように、本発明のもっとも重要な特徴は光学系５及び中間結像 面４から来る蛍光放射を多数の像に分割し、同像かフィルターされたそれぞれの 蛍光波長の帯域で対象物を２次元的に再現することにある。

以下結像系の使用法を第２図ａにつき記載するが、同図はＩＩＰＤ分イーを選択 的に保持する癌腫瘍の典型的な蛍光スペクトルを示す。この物質の特徴は６１１ ）へ−７ＱＯｎｍのスベク１ヘル領域にある。細胞自体から放射されバックグラ ウンドを構成する蛍光Ｂは図に示されているよりもはるかに強い。コントラスト の函数Ｆｃは てここにおいたＡ’、Ｄ及びＢは図に示されている強度で、Ｋは常数である。Ａ ’、Ｄ及びＢの信号レベルはそれぞれ、５３０　、６００及び４８０ｎｍに中心 がおかれた干渉フィルターによって検知される。常数には、Ｂ及びＤにおける信 号レベルによって決定されるハックグラウンドの傾斜曲線から算出される。この 処理によって赤＋１ＰＤ尖頭値を上昇させてバックグラウンドから取除＜・１￥ が可能である。Ｃ号Ｂによって分割する°１ｆにより無次元の量が得られる。こ れは有利な事である。

即ち無次元の量は、表面の様相から生じる幾何学的な要素に影響されないので分 子構成中の変化しか示されない。照明の不規則性（空間的及び時間的変化）もそ の影響は非常に小さくなる。更に実験的に確立されているように、青（Ｂ）蛍光 は腫瘍細胞の中で減少する蛍光を有すると言う事実により、コントラストが更に 非常に強められて、上記の式の中て腫の正確な位置において、分子ｉｌか減少す ると同時に分子か増大する。場合によっては１例えば腫瘍か血によって、著しく よごれている場合には、吸収による減衰によって蛍光が非常に減少する。しかし ながら比Ａ／Ｂは実質的に腫瘍の存在を知らせる。この事は、全赤蛍光しか測定 しない従来の方法により得られる不正確な結果に対して非常に対照的である。あ る正常な細胞（例えばねずみの皮膚）においては、ＩＩＰＤと混同され得る約６ ３０ｎｍにおける通常の赤蛍光の尖頭値か禁止される。しかしながらこれ等の場 合において比Ａ／Ｂ　（第２図ａ参照）は肝ＤＤの比の特徴から異なる。この系 における信号Ｃに対する第４の像を用いる事によりコンピューターシステムの中 で比又は商Ａ／Ｂを形成し、この比を他の３つのチャンネルから得られたＦｅデ ーターを受入れるか又は拒絶するための基準として用いるπか出来る。この点に 関し適当な判別関値な設定する殊により癌細胞の典型的な特徴を有する細胞のそ れ等の部分だけをディスプレイする４１が出来る。同じ形式のコントラスト関数 （ｘ−ｙ）７ｚが、適当にシャープな尖頭値が存在する、他の場合に用いられる 。これに関する１つの例はクロロフィルａが６８５ｎｍにおいてシャープな尖頭 値を示す植物界にかかわる。

ＨＰＤによる癌細胞の検知は、本発明が用いられる特に興味のある一例である。

即ち本発明は強力な蛍光バックグラウンドが存在する場合においても、肺、胆の う、食道、胃などの中の他の方法てはすぐには診断出来ない悪性腫瘍の早期発見 に用いられる。通常の内視鏡技術か本発明とＪ（に用いられる。腫瘍の寸法が推 定されかつ手術後の検査が行なわれて充分な細胞が取除かれた事か確認される。

赤蛍光による従来の結像法に比較して、本発明により得られるコントラストの著 ｌ）い高上による利点はＩＩＰＤの所要都がより少ない事である。

この際得られる利点は１．ル者の光過敏性か低下する４■である。現在用いられ る技術によれば、患者は検査後１ケ月は強い日光を避けねばならない０本発明を 用いた場合には許容線量か減少されるのて、この安全限界が根本的に下降して、 この方法を全固体群の中のある危険な群を監視、するために用いる事が出来る。

更に有望な・バは、従来の技術では観察出来なかった癌細胞の蛍光放射の中の小 さな変化が、将来腫瘍の検知に用いられて異物を体内に静脈注射する必要がなく なる舊である。

本発明は工業的にも用いる事が出来る。例えば本発明は金属板に塗装する前に同 板の表面の清浄さを検査するために、実験的に使用され、これらの検査により汚 れた板を自動的に系から分類し、更に洗浄するために戻す事が出来る０本発明は 更に他の分野にも用いる事が出来る０例えば蛍光分類法が法廷技術に用いられ指 紋の検出、偽造物の鑑定などに用いられる。これ等の方法は本発明により更に効 果的となり、すぐには指紋が再現されない材料又は従来不回部と思われていた材 料の上の非常に薄い指紋を見る事が出来る。

腐食防止グリース、オイル及び塗装の下地及び接着性な有する下地のような、類 似の物質の塗装か類似の方法て監視される。この点に関し適当な視野を提供する ために光学系は適当な視角を右する望遠鏡を含む。本発明は更に印刷回路及び類 似の物の検査にも用いられる。高度の検査態様の場合には観察されたコント・ラ スト像がコンピューターのメモリーに前もって記Ｑ８れた標準像と比較されその 比較により検査された対象物を受入れるべきか、又は取隨〈べきか決定される。

解像度が充分に高い場合には、像チャンネルのいずれかが、例えば反射光による 従来の結像に用いられた蛍光及び通常の光線による混合ｌノだ測定に用いられる 。処理制御のある操作においては、例えば化学的処理を監視するためには、非結 像点測定で充分でこの際同しビーム分割技術及びフィルター技術で作動する簡単 な１点系の使用が回部となるが検知装ごとして光倍増装置が用いられる。

多くの貴重な鉱物、特にタングステン灰重石は蛍光を発する。本発明によるコン トラスト増大型とにより岩石の見本の特定の鉱物結晶を検査する苔が出来る。例 えば望遠鏡アダプターが設けられ、４■両に架装された装置が岩壁又は石切場及 びスカイライン建設現場における類似のものを検査するために用いられる。

この装置が嗜遠鏡に用いられる場合には、例えば水の表面上の油のもれ又は藻の 繁殖を調べるために、航空調査が行なわれる。この場合には特に線形探知アレー が用いられ、同アレーには４つのフィルターがｌ夕罐に並べられ、装置を運んで いる航空機の移動がほぼ５ＬＡＲ−システム（Ｓｉｄｅ　ＬｏｏｋｉｎｇＡｉｒ ｂｏｒｎｅ　Ｒａｄａｒ）で行なわれる方法と同じ方法で像の連続的な線を発生 するために用いられる。この際、励起光源が同時に面上の線を照明し、これによ り蛍光の線を発生させる。多色同時検知により、急速な移動に伴ういろいろな問 題が除かれ、さもなければ装置はこの急速な移動の影響を受け、従来のスキャン ニング技術を用いた場合にいろいろな問題を生じる。地球−■二の水界の状態も ローダミンＢのような蛍光染料を用いるバにより調査する事か出来る。この方法 は早魅、疫病及び虫害による植物界の歪の研究にも用いられる。

上述のように多くの蛍光スペクトルは、低い特徴的な構造面しか有していないの で、従来の技術を用いた場合には、物質を分別することが困難である。第２図す は実質的に無構造のスペクトルの２つの例を示す。図示されたスペクトルは非常 に類似しているが、傾斜の小さな変化を判別する目的のために用いられる。この 場合適当に選択された波長の２つの微分を形成しく上記により多くの有害な妨害 を有しない無次元の州を構成する）微分比を計算する事が出来る。この際の適当 なコントラスト函数は このようなコントラスト函数はその結果として第２図すにおける破線曲線に対し て、実線のスペクトル帯域曲線の部分を強調する。実線曲線は破線曲線に対し° ＣＡとＢの間で傾斜がより大きく、ＣとＤの間でより平である。実際上、任意の 所望の周波数及び更に実際−■−任意の所望の帯域幅の干渉フィルターは、メー カーより容易に入手出来ると言う事実に鑑み１本発明は非常に自由にかつ多くの 分野で用いられる。

本発明は、更に既知の偽色法と共に用いられる。即ち任意に選択された別個の顔 料又は染料によってビデオモニターの上に異なる像点における波長の差、及び各 像点に対する検知又は推定された種々の変数の強度又は値の差の両方を再現する ’ＪＧが出来る。

ＦＩＧ、　２ａ ＦＩＧ、２ｂ −ｍ２ｂ−ａｅ＃ａｈｅｓ　ｉｎ、　Ｐ　ＣＴ　／　Ｓε８５１００４０１１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １蛍光対象物を照射するための光源（１）、上記の照射の結果として対象物から 放射される蛍光放射を分離するためのフィルター及び同フィルターを介して伝達 される放射を検知するための検知手段を含み、対象物と検知手段との間に結像光 学系（５、６）が設けられており，検知手段の近くに結像面（１１）が位置し、 同結像面の上に対象物が結像される蛍光結像系において、ビーム分割系（７−１ ０）が設けられており、同系により光学系を介して導かれる蛍光放射を少なくと も３つの部分に分割し、同部分のそれぞれが対象物の個々の像を形成し、結像面 の中を相互に移動し結像手段の中のそれぞれの検知領域に入り、ビームの種々の 部分が異なる周波数の漏波帯域のそれぞれのフィルター（１１１−１１４）を介 して案内され、複数の波長範囲のそれぞれに対して、複数の像点の形で対角物の 像が生じ、上記の検知手段がそれぞれの像点に対して、それぞれの信号を発出す るように、対象物の同一点に対応するそれぞれの像点に対する信号に、算数決算 及び（又は）論理演算を行なうために設けられた手段（１２）によりウエイトが っけられた信号値を表現して、上記の対象物の異なる点に対するウエイトがっけ られた信号値から対象物の像を形成する事を特徴とする蛍光結像系。 ２ビーム分割系が、光学系の中に組み込まれ、かついくつかの部分（７，８，９ 、１０）に分割された鏡（６）を含み、上記の部分が相互に角度を有していて、 検知面（１１）の異なる部分に対象物を結像させることを特徴とする請求の範囲 第１項に記載の蛍光結像系。 ３フィルターが干渉フィルターであることを特徴とする請求の範囲第１項又は第 ２項に記載の蛍光結像系。 ４ウエイトが付けられた信号値が無次元で、従って信号強度の絶対値と関係を有 しないことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載の蛍光 結像系。 ５算数演算及び（又は）論理演算が交換出来、評価、記憶データーとの比較およ び認議のためにデーター制御されるように設けられていることを特徴とする請求 の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の蛍光結像系。 ６分割された鏡が、凹面鏡で、同鏡の部分も凹面であることを特徴とする請求の 範囲第２項に記載の蛍光結像系。 ７対象物面（４）に対象物を結合させる顕鏡、望遠鏡又は内視鏡のような光学的 結像系（５）が、ビーム分割系の前に設けられていることを特徴とする請求の範 囲第１項に記載の蛍光結像系。 ８第２のビーム分割系（３）を介して光源が光学的結像系（５）を介して対象物 を照射するように設けられていることを特徴とする請求の範囲第７項に記載の蛍 光結像系。 ９上記の像点が、対象物を一次元で結像する線上の点を含み、二次元の像がスキ ャンニングによって得られるように設けられていることを特徴とする請求の範囲 第１項又は第２項に記載の蛍光結像系。 １０光源がパルスレーザーでかっ各レーザーパルスで検知手段（１１）を励起す るための手段が設けられていることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第９項 のいずれかに記載の蛍光結像系。