CN111896340A - 一种可用于流式细胞检测的简便pbmc分离方法 - Google Patents
一种可用于流式细胞检测的简便pbmc分离方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111896340A CN111896340A CN202010588683.2A CN202010588683A CN111896340A CN 111896340 A CN111896340 A CN 111896340A CN 202010588683 A CN202010588683 A CN 202010588683A CN 111896340 A CN111896340 A CN 111896340A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pbmc
- cells
- flow cytometry
- whole blood
- volume ratio
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 92
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 72
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 46
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 46
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 claims description 19
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 claims description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 13
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical group OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 9
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 5
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 38
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 25
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 20
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 5
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 5
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 2
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004405 cytokine-induced killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000002794 lymphocyte assay Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/42—Low-temperature sample treatment, e.g. cryofixation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N2015/1488—Methods for deciding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种可用于流式细胞检测的简便PBMC分离方法，它包括如下步骤：1)取全血，加分离液混合，静置；2)取步骤1)所得上清液，2～8℃保存1‑2天，即得PBMC悬液；或：取步骤1)所得上清液，离心，取下层细胞，加保存液重悬，‑150℃冻存180～360天，即得冻存PBMC。本发明分离PBMC的方法，与常用方法相比大大节省了血样处理时间，简化了操作步骤，减少了对离心机等仪器的依赖，可用于病房，诊所及事故发生地血样的及时处理，并用于流式细胞检测CD4和CD8，具有实际推广应用价值。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种可用于流式细胞检测的简便PBMC分离方法。
背景技术
PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)即外周血单个核细胞，指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。人体免疫细胞，如CIK细胞、DC细胞、NK细胞、DC-T细胞，均由PBMC诱导分化而来，若要获得上述免疫细胞，需要先自外周血中分离PBMC。
外周血含有血小板、PBMC、红细胞和多核白细胞等多种细胞，PBMC的密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090kg/m3左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090kg/m3，血小板为1.030～1.035kg/m3。为此利用一种密度介于1.075～1.092kg/m3之间而近于等渗的溶液(分层液)做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，便可将各种血细胞加以分离。常用的PBMC分离方法有Ficoll分离法和Percoll分离法两种。Percoll分离法操作流程较长，手续较为繁琐；相比之下Ficoll分离法较为常用，但是，Ficoll分离法存在Ficoll分离液用量大，分层不明显等缺点，专利CN 105255829A对Ficoll分离法进行了改进，但仍然存在步骤繁琐，处理时间长的缺点。
细胞流式检测是利用细胞表面特异性的抗原，把不同细胞分开并进行定量统计的方法，对细胞的活性要求较高，因此一般都采用Percoll或Ficoll基础的密度梯度离心法获得PBMC进行下游操作。小量实验时可使用低渗透压裂解红细胞的方法(裂红法)代替，但是样本量大时裂红法需要试剂量大，难以控制裂红时间，往往造成裂红不充分，或目的细胞死亡。
无论Percoll和Ficoll分离法，都需要对血液样本进行密度梯度离心，在离心后吸取特定的细胞层，对仪器和技术人员依赖较大。在基层医院收集样本时，往往没有实验条件进行此类操作。而如果不进行分离，红细胞很快会裂解并导致其他细胞的死亡。
羟基淀粉沉淀法(HES法)虽然也用于分离细胞，但是该方法分离的细胞中混有一定量的红细胞，且羟基淀粉黏附在细胞上，会影响后续的流式分析/分选，因此目前还没有用羟基淀粉沉淀法分离细胞做流式分析。
因此，发明一种简单，有效，对实验条件和人员技术水平要求较低的，且可以用于后续流式分析/分选重要免疫细胞的分离方法非常必要。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种可用于流式细胞检测的简便PBMC分离方法，它包括如下步骤：
1)取全血，加分离液混合，静置，
2)取步骤1)所得上清液，2～8℃保存1-2天，即得PBMC悬液；或：
取步骤1)所得上清液，离心，取下层细胞，加保存液重悬，-150℃冻存180～360天，即得冻存PBMC。
进一步地，所述全血与分离液的体积比为3～6：1，优先体积比为5：1。
更进一步地，所述分离液是羟乙基淀粉溶液。
更进一步地，所述羟乙基淀粉溶液中羟乙基淀粉分子量为45～70万，优选48万；和/或，所述羟乙基淀粉溶液浓度为4～8％，优选6％。
进一步地，所述全血为混有抗凝剂的全血；所述抗凝剂与全血的质量体积比为1.2～2.4mg：1mL，优选1.8mg：1mL。
更进一步地，所述抗凝剂是EDTA。
进一步地，所述静置温度20～30℃，时间25～45min，优先温度25℃，时间35min。
进一步地，所述离心的转速100～300×g，温度为2～8℃，时间3～8min，优选离心转速200×g，温度为4℃，时间5min。
进一步地，所述保存液重悬后每1ml含1x106细胞。
更进一步地，所述保存液是胎牛血清和二甲基亚砜组成的混合溶液；所述胎牛血清与二甲基亚砜的体积比为9：1。
进一步地，所述流式细胞检测的是免疫细胞表面抗原CD家族，优选检测免疫细胞CD8和/或CD4。
本发明分离PBMC的方法，与常用方法相比大大节省了血样处理时间，简化了操作步骤，减少了对离心机等仪器的依赖。
经试验证明，通过本发明方法分离得到的PBMC，其存活率，CD4+T细胞和CD8+T细胞比例与目前常用方法无显著差异，保证了PBMC的质量。本发明方法得到的PBMC虽然仍混有一定数目的红细胞，导致淋巴细胞百分比与其他方法相比有所减少，但重要免疫细胞CD4+T细胞比例与其他方法没有显著差异，对后续流式细胞CD4的检测结果不造成影响。由此可见，本发明分离PBMC的方法，可用于病房，诊所及事故发生地血样的及时处理，并用于流式细胞检测重要免疫细胞CD4、CD8，具有实际推广应用价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1实验例1中PBMC存活率流式细胞术分析图(第一行：Ficoll法PBMC平均存活率94.5％，第二行：HBS+Ficoll法PBMC平均存活率94.2％，第三行：HBS法PBMC平均存活率95％)
图2实验例1中PBMC流式细胞术分析CD4+T和CD8+T细胞比例图
图3实验例2中PBMC存活率流式细胞术分析图(第一行：Ficoll法PBMC平均存活率88.6％，第二行：HBS+Ficoll法PBMC平均存活率79.4％，第三行：HBS法PBMC平均存活率78.1％)
图4实验例2中PBMC流式细胞术分析CD4+T和CD8+T细胞比例图
图5实验例3中流式细胞术分析Ficoll法和本发明方法分离的PBMC(第一行：Ficoll法，第二行：本发明方法)
具体实施方式
实施例1、本发明分离PBMC的方法
取加入抗凝剂(EDTA，其与全血质量体积比为1.8mg/mL)的全血(六个样本)，与6％羟乙基淀粉溶液(羟乙基淀粉分子量48万)以体积比5：1混合，25℃静置30min，吸取上清，4℃保存1-2天，即得PBMC悬液，在1～2天内用于流式细胞检测。
实施例2、本发明分离PBMC的方法
取加入抗凝剂(EDTA，其与全血质量体积比为1.8mg/mL))的全血(六个样本)，与6％羟乙基淀粉溶液(羟乙基淀粉分子量48万)以体积比5：1混合，室温静置30min，吸取上清，在转速200g，温度4℃条件下，离心5分钟，取下层细胞，以每1ml重悬1x106细胞的量加入冻存液(90％胎牛血清(FBS)+10％二甲基亚砜(DMSO)组成的冻存液)，-150℃冻存180～360天，即得冻存的PBMC，180～360天内用于流式细胞检测。
以下通过试验例来说明本发明的有益效果。
实验例1
将同一血液样本各分3份，分别采用Ficoll法，本发明短期保存的分离方法(羟乙基淀粉沉降法，HBS)，本发明短期保存的分离方法与Ficoll法相结合的方法分离PBMC，每一种方法分离6份血液样本，对所得PBMC存活率，CD4+T细胞和CD8+T细胞比例进行分析检测。
1、分离方法
1)Ficoll离心法
取加入抗凝剂(EDTA，其与全血质量体积比为1.8mg/mL)的全血，与等体积RPMI1640基础培养基混匀后加入含有Ficoll液的离心管中(稀释后血样与Ficoll液体积比为2：1)，室温800g离心15min(离心机升降速率均为最低)后，取白膜层细胞，用PBS洗两遍后得PBMC。
2)本发明方法
按实施例1分离PBMC。
3)本发明方法与Ficoll法相结合方法。
取加入抗凝剂(EDTA，其与全血质量体积比为1.8mg/mL)的全血，与6％羟乙基淀粉溶液(羟乙基淀粉分子量48万)以体积比5：1混合，室温静置30min，吸取上清，将上清加入含有Ficoll液的离心管中(上清与Ficoll液体积比为2：1)，室温800g离心15min(离心机升降速率均为最低)后，取白膜层细胞，用PBS洗两遍后得PBMC。
2检测方法
1)PBMC存活率
取分离得到的PBMC(1x106)用1mL PBS重悬，加入1μLFVS780，室温避光染色15min后，用流式细胞术进行细胞存活率鉴定，APC-cy7通道阳性为死细胞，阴性为活细胞。
2)CD4+T细胞和CD8+T细胞比例
取分离得到的PBMC(1x106)，用100μL FACS buffer(含1％FBS的PBS溶液)重悬，分别加入抗体CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC，室温避光染色20min，PBS洗一遍后，用FACS buffer重悬，再用流式细胞仪进行检测。
3、结果
三种分离方法得到的PBMC检测结果见图1～2，从图1～2可见：Ficoll离心法得到的PBMC存活率94.5％，CD4+T细胞和CD8+T细胞比例1.67；本发明方法得到的PBMC存活率94.2％，CD4+T细胞和CD8+T细胞比例1.66，本发明方法与Ficoll法相结合得到的PBMC存活率95％，CD4+T细胞和CD8+T细胞比例1.58，从上述结果可见，三种方法所得PBMC存活率没有显著性差异，CD4+T细胞和CD8+T细胞比例也没有显著性差异。
实验例2
将同一血液样本分3份，分别采用Ficoll法，本发明长期保存的分离方法(羟乙基淀粉沉降法，HBS)，本发明长期保存的分离方法与Ficoll法相结合的方法分离PBMC，每一种方法分离6份血液样本，对所得PBMC在-150℃冻存半年后，检测PBMC存活率，CD4+T细胞和CD8+T细胞比例进行分析检测。
1、分离方法
1)Ficoll离心法
取加入抗凝剂(EDTA，其与全血质量体积比为1.8mg/mL)的全血，与等体积RPMI1640基础培养基混匀后加入含有Ficoll液的离心管中(稀释后血样与Ficoll液体积比为2：1)，室温800g离心15min(离心机升降速率均为最低)后，取白膜层细胞，用PBS洗两遍后得PBMC。
2)本发明方法
按实施例2分离PBMC
3)本发明方法与Ficoll法相结合方法
取加入抗凝剂(EDTA，其与全血质量体积比为1.8mg/mL)的全血，与6％羟乙基淀粉溶液(羟乙基淀粉分子量48万)以体积比5：1混合，室温静置30min，吸取上清，将上清加入含有Ficoll液的离心管中(上清与Ficoll液体积比为2：1)，室温800g离心15min(离心机升降速率均为最低)后，取白膜层细胞，用PBS洗两遍后得PBMC。
2检测方法
1)PBMC存活率
取分离得到的PBMC(1x106)用1mL PBS重悬，加入1μLFVS780，室温避光染色15min后，用流式细胞术进行细胞存活率鉴定，APC-cy7通道阳性为死细胞，阴性为活细胞。
2)CD4+T细胞和CD8+T细胞比例
取分离得到的PBMC(1x106)，用100μL FACS buffer(含1％FBS的PBS溶液)重悬，分别加入抗体CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC，室温避光染色20min，PBS洗一遍后，用FACS buffer重悬，再用流式细胞仪进行检测。
3、结果
三种分离方法得到的PBMC检测结果见图3～4，从图3～4可见：Ficoll离心法得到的PBMC存活率88.6％，CD4+T细胞和CD8+T细胞比例2.09；本发明方法得到的PBMC存活率79.4％，CD4+T细胞和CD8+T细胞比例1.85，本发明方法与Ficoll法相结合得到的PBMC存活率78.1％，CD4+T细胞和CD8+T细胞比例1.96，从上述结果可见，三种方法所得PBMC存活率没有显著性差异，CD4+T细胞和CD8+T细胞比例也没有显著性差异。
实验例3
将同一血液样本分2份，分别采用Ficoll法，本发明短期保存的分离方法(羟乙基淀粉沉降法，HBS)的分离PBMC，每一种方法分离1份血液样本，对所得PBMC中淋巴细胞比例，CD4+T细胞和IFN-γ、GM-CSF细胞因子比例进行分析检测。
1、分离方法
1)Ficoll离心法
取加入抗凝剂(EDTA，其与全血质量体积比为1.8mg/mL)的全血，与等体积RPMI1640基础培养基混匀后加入含有Ficoll液的离心管中(稀释后血样与Ficoll液体积比为2：1)，室温800g离心15min(离心机升降速率均为最低)后，取白膜层细胞，用PBS洗两遍后得PBMC。
2)本发明方法
按实施例1分离PBMC。
2、检测方法
1)PBMC中淋巴细胞比例
取分离得到的PBMC(1x106)用流式细胞术进行淋巴细胞比例分析，根据FSC-A和SSC-A进行细胞形态分析，框选出淋巴细胞。
2)CD4+T细胞和分泌IFN-γ、GM-CSF细胞比例
取分离得到的PBMC(1x106)，用100μL FACS buffer(含1％FBS的PBS溶液)重悬，分别加入抗体CD4-PerCP-Cy5.5，室温避光染色20min，去上清后加入固定液和破膜液，室温避光20min，去上清后分别加入IFN-γ-APC、GM-CSF-PE，PBS洗一遍后，用FACS buffer重悬，再用流式细胞仪进行检测。
3、结果
两种分离方法得到的PBMC检测结果见图5，从图5可见：Ficoll离心法得到的PBMC中淋巴细胞比例为50.7％，CD4+T细胞比例26.9％，GM-CSF和IFN-γ单阳和双阳比例分别为12.2％、10.2％、9.1％；本发明方法得到的PBMC中淋巴细胞比例为19.1％，CD4+T细胞比例26.4％，GM-CSF和IFN-γ单阳和双阳比例分别为9.15％、12.2％、3.28％；从上述结果可见，使用本发明方法得到的淋巴细胞比例较低，两种方法所得PBMC中CD4+T细胞比例没有显著性差异，两种方法所得PBMC中分泌GM-CSF和IFN-γ的细胞比例有显著差异。
综上，通过本发明方法分离得到的PBMC存活率，CD4+T细胞和CD8+T细胞比例与目前常用方法无显著差异，保证了PBMC的质量,虽然分离得到的PBMC仍混有一定数目的红细胞，导致淋巴细胞百分比与其他方法相比有所减少，但重要免疫细胞CD4+T细胞比例与其他方法没有显著差异，对后续流式细胞CD4的检测结果不造成影响。本发明方法可用于病房，诊所及事故发生地血样的及时处理，并用于流式细胞CD4检测，具有实际推广应用价值。
Claims (10)
1.一种可用于流式细胞检测的简便PBMC分离方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1)取全血，加分离液混合，静置，
2)取步骤1)所得上清液，2～8℃保存1-2天，即得PBMC悬液；或：
取步骤1)所得上清液，离心，取下层细胞，加保存液重悬，-150℃冻存180～360天，即得冻存PBMC。
2.根据权利要求1所述PBMC分离方法，其特征在于：所述全血与分离液的体积比为3～6：1，优先体积比为5：1。
3.根据权利要求1或2所述PBMC分离方法，其特征在于：所述分离液是羟乙基淀粉溶液。
4.根据权利要求3所述PBMC分离方法，其特征在于：所述羟乙基淀粉溶液中羟乙基淀粉分子量为45～70万，优选48万；和/或，所述羟乙基淀粉溶液浓度为4～8％，g/ml，优选6％，g/ml。
5.根据权利要求1或2所述PBMC分离方法，其特征在于：所述全血为混有抗凝剂的全血；所述抗凝剂与全血的质量体积比为1.2～2.4mg：1mL，优选1.8mg：1mL。
6.根据权利要求5所述PBMC分离方法，其特征在于：所述抗凝剂是EDTA。
7.根据权利要求1所述PBMC分离方法，其特征在于：所述静置温度20～30℃，时间25～45min，优先温度25℃，时间35min。
8.根据权利要求1所述PBMC分离方法，其特征在于：所述离心的转速100～300×g，温度为2～8℃，时间3～8min，优选离心转速200×g，温度为4℃，时间5min；所述保存液重悬后每1ml含1x106细胞。
9.根据权利要求1或8所述PBMC分离方法，其特征在于：所述保存液是胎牛血清和二甲基亚砜组成的混合溶液；所述胎牛血清与二甲基亚砜的体积比为9：1。
10.根据权利要求1～9任意一项所述PBMC分离方法，其特征在于：所述流式细胞检测的是免疫细胞表面抗原CD家族，优选检测免疫细胞CD8和/或CD4。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010588683.2A CN111896340A (zh) | 2020-06-24 | 2020-06-24 | 一种可用于流式细胞检测的简便pbmc分离方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010588683.2A CN111896340A (zh) | 2020-06-24 | 2020-06-24 | 一种可用于流式细胞检测的简便pbmc分离方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111896340A true CN111896340A (zh) | 2020-11-06 |
Family
ID=73207867
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010588683.2A Pending CN111896340A (zh) | 2020-06-24 | 2020-06-24 | 一种可用于流式细胞检测的简便pbmc分离方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111896340A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113945715A (zh) * | 2021-08-30 | 2022-01-18 | 四川大学华西医院 | 供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法及应用 |
Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101560495A (zh) * | 2008-04-14 | 2009-10-21 | 深圳市北科生物科技有限公司 | 一种分离单个核细胞的方法和装置 |
| CN101638637A (zh) * | 2009-09-04 | 2010-02-03 | 唐明淇 | 人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法 |
| CN101922048A (zh) * | 2010-08-06 | 2010-12-22 | 青岛奥克生物开发有限公司 | 一种脐带间充质干细胞公共库的建库方法 |
| CN102250839A (zh) * | 2011-06-16 | 2011-11-23 | 崔慧斐 | 一种通用型细胞处理试剂盒及其应用方法 |
| CN102747034A (zh) * | 2011-04-19 | 2012-10-24 | 北京同盛颐和生物科技有限公司 | 一种用于体外分离纯化有核细胞的方法和试剂盒 |
| CN104480070A (zh) * | 2014-11-28 | 2015-04-01 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种人外周血单个核细胞的分离方法 |
| CN104694473A (zh) * | 2015-02-15 | 2015-06-10 | 江苏博雅再生医学科技有限公司 | 从成人外周血中自动化提取免疫细胞的方法 |
| CN104711221A (zh) * | 2015-02-15 | 2015-06-17 | 第五空间健康管理江苏有限公司 | 从成人外周血中自动化分离免疫细胞并提取prp的方法 |
| CN105255831A (zh) * | 2015-11-16 | 2016-01-20 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种巨核祖细胞的分离方法 |
| CN106701674A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-05-24 | 上海新肌生物科技有限公司 | 一种提高移植性脂肪细胞或者填充式脂肪细胞成活率的复活因子的提纯和萃取工艺 |
| CN107904175A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-04-13 | 广州沙艾生物科技有限公司 | 用于免疫细胞的诱导扩增的培养箱 |
| CN108849854A (zh) * | 2018-07-13 | 2018-11-23 | 深圳市润科生物科技有限公司 | 一种外周血单个核细胞冻存方法 |
| CN110144323A (zh) * | 2019-05-29 | 2019-08-20 | 江苏省北科生物科技有限公司 | 一种外周血免疫细胞的静置分离方法 |
-
2020
- 2020-06-24 CN CN202010588683.2A patent/CN111896340A/zh active Pending
Patent Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101560495A (zh) * | 2008-04-14 | 2009-10-21 | 深圳市北科生物科技有限公司 | 一种分离单个核细胞的方法和装置 |
| CN101638637A (zh) * | 2009-09-04 | 2010-02-03 | 唐明淇 | 人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法 |
| CN101922048A (zh) * | 2010-08-06 | 2010-12-22 | 青岛奥克生物开发有限公司 | 一种脐带间充质干细胞公共库的建库方法 |
| CN102747034A (zh) * | 2011-04-19 | 2012-10-24 | 北京同盛颐和生物科技有限公司 | 一种用于体外分离纯化有核细胞的方法和试剂盒 |
| CN102250839A (zh) * | 2011-06-16 | 2011-11-23 | 崔慧斐 | 一种通用型细胞处理试剂盒及其应用方法 |
| CN104480070A (zh) * | 2014-11-28 | 2015-04-01 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种人外周血单个核细胞的分离方法 |
| CN104694473A (zh) * | 2015-02-15 | 2015-06-10 | 江苏博雅再生医学科技有限公司 | 从成人外周血中自动化提取免疫细胞的方法 |
| CN104711221A (zh) * | 2015-02-15 | 2015-06-17 | 第五空间健康管理江苏有限公司 | 从成人外周血中自动化分离免疫细胞并提取prp的方法 |
| CN105255831A (zh) * | 2015-11-16 | 2016-01-20 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种巨核祖细胞的分离方法 |
| CN106701674A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-05-24 | 上海新肌生物科技有限公司 | 一种提高移植性脂肪细胞或者填充式脂肪细胞成活率的复活因子的提纯和萃取工艺 |
| CN107904175A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-04-13 | 广州沙艾生物科技有限公司 | 用于免疫细胞的诱导扩增的培养箱 |
| CN108849854A (zh) * | 2018-07-13 | 2018-11-23 | 深圳市润科生物科技有限公司 | 一种外周血单个核细胞冻存方法 |
| CN110144323A (zh) * | 2019-05-29 | 2019-08-20 | 江苏省北科生物科技有限公司 | 一种外周血免疫细胞的静置分离方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 兰炯采等: "人脐血移植的裸鼠模型 ", 《中国实验血液学杂志》 * |
| 李敏等: "脐血单个核细胞分离方法的比较及形态学改变 ", 《新疆医科大学学报》 * |
| 迟占有等: "羟乙基淀粉沉降法分离脐血过程的深入分析及条件优化 ", 《中国输血杂志》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113945715A (zh) * | 2021-08-30 | 2022-01-18 | 四川大学华西医院 | 供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法及应用 |
| CN113945715B (zh) * | 2021-08-30 | 2023-04-21 | 四川大学华西医院 | 供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Harris et al. | Tissue typing using a routine one‐step lymphocyte separation procedure | |
| US8507237B2 (en) | Device and method for concentrating and detecting pathogenic microbes from blood products and/or their derivatives | |
| Figdor et al. | Isolation of functionally different human monocytes by counterflow centrifugation elutriation | |
| CN108508196B (zh) | 一种检测人调节性t细胞亚型的试剂盒及检测方法 | |
| CN113777327B (zh) | 用于白血病/淋巴瘤免疫分型初筛的抗体组合物及其应用 | |
| CN111527395B (zh) | 一种免疫细胞中淋巴细胞的流式细胞仪检测方法 | |
| US20220018745A1 (en) | A method for preparing lymphocyte sample for flow cytometry analysis | |
| US4508821A (en) | Detection of white cell associated bacteria with a fluorescent dye | |
| Andreasen et al. | Separation of avian heterophils from blood using Ficoll-Hypaque discontinuous gradients | |
| CN111896340A (zh) | 一种可用于流式细胞检测的简便pbmc分离方法 | |
| Jean et al. | Combination of cellular population data and CytoDiff™ analyses for the diagnosis of lymphocytosis | |
| CN105483082A (zh) | 采用lrs获取白细胞的方法及所获得白细胞在基础实验中的应用 | |
| Bruderek et al. | Immunophenotyping of circulating myeloid-derived suppressor cells (MDSC) in the peripheral blood of cancer patients | |
| Bryant et al. | The biologic significance of rare peripheral blasts after hematopoietic cell transplantation is predicted by multidimensional flow cytometry | |
| Lewis et al. | T and B cell analogues from peripheral blood of immune channel catfish, Ictalurus punctatus | |
| JP2002207035A (ja) | 腫瘍化細胞計数方法 | |
| Thornthwaite et al. | Dual immunofluorescent analysis of human peripheral blood lymphocytes | |
| Yamamura et al. | Possible automatic cell classification of bone marrow aspirate using the CELL‐DYN 4000® automatic blood cell analyzer | |
| CN109781975B (zh) | 富集循环稀有细胞的试剂及方法 | |
| Gane et al. | Expression of CD11b (Leu15) Antigen on CD3+, CD8+, CD16+ Peripheral Lymphocytes, Estimation of CD3+ 8+ 11b+ and CD3+ 4‐8‐11b‐T‐Cell Subsets using a Single Laser Flow Cytometer | |
| Wada et al. | Method of separation and concentration of fetal nucleated red blood cells in maternal blood and its application to fetal diagnosis | |
| Arvilommi | A method for simultaneous determination of rosette formation and phagocytosis by cells | |
| CN116593700B (zh) | 一种用于鉴定抗mda5阳性皮肌炎患者的分子标记物 | |
| Sovalat et al. | Identification of CD34-positive cells by multiparameter flow cytometry | |
| Timilsena et al. | Accuracy of lymphocyte counts from UniCel DxH 800 in β-thalassemia/HbE patients having various numbers of nucleated red blood cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201106 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |