CN105483082A - 采用lrs获取白细胞的方法及所获得白细胞在基础实验中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种采用LRS获取白细胞的方法及所获得白细胞在基础实验中的应用，该方法采用灭菌冲洗液、灭菌等渗液和灭菌冲洗液依序多次冲洗单采血小板白细胞滤器上的白细胞过滤装置，然后将各冲洗液回收后采用D-Hank’s液稀释并用Ficoll密度梯度离心法梯度分离，将所得白细胞粗品采用PBS缓冲液多次洗涤离心得到存活的大量白细胞。该方法在血小板单采结束后就可以处理白细胞滤器来避免白细胞减少，且操作简单省时、白细胞收集率高，为珍贵的白细胞资源回收利用又提供了一条简便的途径，此外所得的白细胞可直接替代直接自外周血分离所得的白细胞在免疫学、药理学、肿瘤学和血液学中的应用，在不影响临床供血的前提下，稳定可靠的建立了获得白细胞的新途径。

Description

采用LRS获取白细胞的方法及所获得白细胞在基础实验中的应用
技术领域
本发明涉及一种外周血白细胞的获得方法和所获得白细胞的应用，尤其涉及一种外周血单个核细胞的获得方法和所获得的外周血单个核细胞在基础实验中的应用。
背景技术
人外周血白细胞是基础实验常需的资源，尤其在免疫学、药理学、肿瘤学研究以及血液学实验研究中，健康人白细胞包括T淋巴细胞，B淋巴细胞，NK和单核细胞的需求特别大，特别是一系列基础实验如T细胞功能调节、Th细胞分化、移植排斥的混合淋巴反应等实验均需要健康人外周血白细胞；此外在一些实验动物构建和肿瘤免疫治疗中需要的白细胞特别是T细胞数量也特别巨大。原本这些实验均需要中心血站或者志愿者反复无偿献血提供全血，然而近年来临床血液供应都存在困难的情况下，通过原来的实验用血来源途径满足基础实验需求已经不现实，因此寻找一个新的方法代替传统的途径是当下之急。
最近，有研究者从全血白细胞滤器获得了大量的白细胞，并且证实这些白细胞在活力和功能方面都能应用于基础实验研究。如Meyer等发现从全血白细胞滤器获得大量外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMC)，并且经过一系列体外实验证实：所获PBMC很好的包含了各种细胞种类，并且各类细胞亚群的比例与正常人外周血相当，这些细胞可作为实验细胞的一个新的来源。而Ivanovic等证实从滤器中还可获得大量CD34+细胞，并发现这些细胞与来源于外周血的CD34+细胞在功能方面不存在显著性差异。再如Ebner等人发现，滤器中所获得的CD14+前体细胞可在体外条件下诱导分化为用于免疫治疗的树突状细胞。但是从全血白细胞滤器中获取PBMC存在一个问题，即全血采集数小时至十数小时后才进行白细胞过滤，这时再处理滤器，白细胞的获取量将减少。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种采用LRS获取白细胞的方法及所获得白细胞在基础实验中的应用，该获得白细胞的方法实验设备要求低、操作简单省时、白细胞的收集率高、纯度高，且所获得白细胞可直接替代人外周血所获得的白细胞，为白细胞的资源回收利用提供了一条简便高效的途径。
本发明的技术方案是：
一种采用LRS获取白细胞的方法，该方式是对经血小板单采术后的单采血小板白细胞滤器在百级洁净区内进行包括如下步骤所述的操作：
(1)使用D-Hank’s液冲洗单采血小板白细胞滤器上的白细胞过滤装置3～4次，去除白细胞过滤装置上附着的血渍并将每次冲洗后所得的冲洗液收集在一起；
(2)继续使用D-Hank’s液冲洗经(1)处理后的单采血小板白细胞滤器上的白细胞过滤装置2～3次，每次30～35s，去除白细胞过滤装置上粘附的物质并将每次冲洗后所得的冲洗液收集在一起；
(3)再次使用D-Hank’s液冲洗经(2)处理后的单采血小板白细胞滤器上的白细胞过滤装置2～3次，将粘附其上的白细胞冲洗脱落，并将每次冲洗后所得的冲洗液收集在一起；
(4)将(1)、(2)和(3)中收集到的冲洗后所得的冲洗液混合形成混合液并转移至无菌离心管中，采用D-Hank’s液将上述混合液进行稀释，其中混合液与D-Hank’s液的质量比为1:18～20；然后采用Ficoll密度梯度离心法按照1:2进行梯度分离，其中离心速率为1800～1900rpm，离心温度为37～37.5℃，离心时间为30～35min，离心过程结束后得到离心液体；
(5)用吸管吸取(4)中得到的离心液体的中间白膜层，得到白细胞粗品，然后采用PBS缓冲液对该白细胞粗品进行洗涤，并采用常温下1200～1300rpm的转速离心5～6min后，弃去上清液，得到沉淀物；将该沉淀物再次使用PBS缓冲液进行洗涤离心后，得到的最终沉淀物为存活的白细胞。
其进一步的技术方案是：
其中D-Hank’s液可以采用本领域常规组成比例进行配制，也可以按照下述方法进行配制：8g氯化钾(KCl)、3.04g磷酸二氢钠(Na2HPO4·12H2O)、1.2g磷酸二氢钾(KH2PO4)、20.0g葡萄糖和0.1N氢氧化钠(NaOH)加入瓶中，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入5.6％NaHCO3调pH至7.2～7.6，最后定容到1L，高温灭菌。
其中PBS缓冲液可以采用本领域常规组成比例进行配制，也可以按照下述方法进行配制：将2.0g磷酸二氢钾(KH2PO4)、1.42g磷酸二氢钠(NaH2PO4)、8g氯化钠(NaCl)和0.2g氯化钾(KCl)加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L，高温灭菌。
本发明还公开了一种含有上述所述方法获得的存活的白细胞的试剂盒。
本发明还公开了通过上述所述方法获得的白细胞在免疫学、药理学、肿瘤学和血液学中的应用。
其进一步包括：
采用单采血小板白细胞滤器获取的白细胞在过继免疫治疗细胞中的应用。
采用单采血小板白细胞滤器获取的白细胞的过继免疫治疗细胞在共刺激分子的表达中的应用。
采用单采血小板白细胞滤器获取的白细胞在T细胞增殖和经扩增后细胞因子分泌检测中的应用。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：本发明公开了一种单采血小板白细胞滤器获取白细胞的方法，该方法使用灭菌冲洗液和灭菌等渗液冲洗单采血小板白细胞滤器上的白细胞过滤装置，其无需使用灭菌高渗液对装置进行浸没静置处理，只需用等渗溶液清洗并收集白细胞，然后分离收集获得存活白细胞。本发明方法在血小板单采结束后就可以处理白细胞滤器，避免白细胞的减少，且操作简单，实验设备要求低，操作时间短，且白细胞收集率高，为珍贵的白细胞资源回收利用又提供了一条简便的途径，此外所得的白细胞可直接替代直接自外周血分离所得的白细胞在免疫学、药理学、肿瘤学和血液学中的应用，在不影响临床供血的前提下，可靠并稳定的建立了获得白细胞的新途径。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是采用溶血法对初始状态的细胞亚群分型分析图；
图2是PBMC体外分离纯化CD3+T细胞的纯度结果分析图；
图3是体外扩增的PBMC形态的电镜图；
图4是采用台盼蓝染色法测出的过继免疫细胞增殖速率动态比较图；
图5是采用CCK8检测出的过继免疫细胞增殖速率动态图；
图6是采用CFSE荧光标记检测出的过继免疫细胞增殖速率比较图；
图7是培养第10天的过继免疫细胞中CD3+CD4+T和CD3+CD8+T细胞群体的变化情况分析图；
图8是培养第10天的过继免疫细胞的正性共刺激分子分布比例的比较分析图；
图9是培养第10天的过继免疫细胞的负性共刺激分子分布比例的比较分析图；
图10是培养第10天的过继免疫细胞的正负性共刺激分子在CD4+和CD8+细胞中的比例分布分析图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明中具体实施例的实验结果均采用graphpad5.0统计软件，计量资料以x±s表示，计数资料以比率(P)表示，X2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。本发明具体实施例中所使用的主要试剂有：抗人CD3单克隆抗体(OKT-3)、IL-2为市售；CD4-FITC、CD8-PE、CD8-PE-CY5，CD3-PE-CY7，CD3-PE-CY5，CD19-FITC，CD28-PE，PD-1-PE-CY5.5，CD4-PE-CY5，CD25-PE，CD14-FITC，CD4-PE-Cy7，CD25-PE-CY5，CD3-PE，CD8-PE，CD19-PE和PD-L1-PE荧光抗体均为市售；PBS、cck-8、CFSE、1640培养基、胎牛血清、淋巴细胞分离液(ficoll，比重1.077g/ml)、OKT-3、CFSE、CD3+磁珠分选试剂、CytometricBeadArray(CBA)试剂盒均为市售产品，此外下述具体实施例中所采用的未特别提及的试剂、操作工具和仪器等均为本领域常规试剂、操作工具和仪器，不再赘述。
PBMC的分离提取：无菌抽取单采血小板白细胞滤器中的血，以下简称为滤器血，以PBS1:20稀释；取同一个体的正常肝素抗凝外周血，以下简称为外周血，以PBS1:2稀释；将上述经稀释后的滤器血和外周血分别采用常规Ficoll分离，获得PBMC，PBS洗涤2遍后计数，用含10％FBS的RPMI-1640调整细胞密度至1x106/ml后备用，分别为全血PBMC细胞和滤器血PBMC细胞。
具体实施例1：溶血法对初始细胞分型的检测
全血PBMC细胞用50μl/test，滤器血PBMC细胞用5μl/test，分别加入CD3、CD8、CD4、CD19、CD28、PD-1抗体；同时分别设置IgG同型对照管，4℃避光反应20-30min。每管分别加入红细胞裂解液150μl和20μl，充分震荡后置于40℃水浴锅3min，加2ml磷酸盐缓冲液(PBS)终止反应，1600r/min离心5min，弃去上清液，然后加入PBS500ul/test制成细胞悬液，采用流式细胞仪进行检测。
初始状态的细胞亚群分型分析结果为：经流式细胞仪分析检测，两组细胞的CD3+T淋巴细胞约占淋巴细胞总数的50-70％，其中CD4+T淋巴细胞约占40％，CD8+T淋巴细胞约占20％，参见图1，CD19+B淋巴细胞约占淋巴细胞总数的10％，符合正常人外周血各群淋巴细胞的比例范围。共性共刺激分子CD28+约占CD4+和CD8+T淋巴细胞的80％，而负性共刺激分子PD-1占CD4+T淋巴细胞约占20～30％,CD8+T淋巴细胞约占10～20％，符合正常人外周血的共刺激分子比例范围。
具体实施例2：PBMC体外分离纯化CD3±T细胞
用80μlPBS/1x107cells重悬细胞，然后20ulCD3磁珠/1x107cells混匀，至于2-8℃的冰箱内孵育15min。孵育结束后按照1-2mLPBS/1x107cells进行细胞洗涤，并室温300g离心10min，弃去上清液后，采用500ulPBS/1x108cells再次重悬。从柱顶端加入1ml的PBS润洗2次，使缓冲液完全流过分选柱，将细胞悬液转移到预处理后的分选柱上，收集流出的未标记细胞。再用1ml的PBS清洗3次，然后卸下分选柱，至于收集管上。加入5ml洗脱缓冲液(PBS+1％FBS)，向下推挤柱塞，同时收集洗脱流出物，此流出物即为磁珠标记细胞。取适量并采用流式细胞仪检测纯度。RPMI1640完全培养悬浮细胞，并用计数板细胞计数。
CD3是T淋巴细胞的表面标志，在静置和活化T淋巴细胞上都表达。本实验利用CD3-PerCP-CY5.5抗体标记从全血细胞和滤器血细胞中新鲜分离获得的T淋巴细胞，纯度较高，均达到95％以上，参见图2，且滤器血组的纯度较外周血组略高。
具体实施例3：体外扩增的PBMC的形态学观察
将PBMC细胞用RMPI1640完全培养基(含10％小牛血清)配成细胞悬液，然后转入和24孔板(1.0×106/孔)里，然后于细胞培养液中加入相应细胞因子：抗CD3mAb(50ng/ml)、IL-2(300U/ml))然后将孔板放到37℃、5％CO2、饱和湿度95％的CO2培养箱内培养。之后视细胞状态每隔2-3天即每3天补一次含细胞因子IL-2(300U/ml)的培养基，培养10-14天，每天观察，拍照记录，留取培养细胞上清置于-20℃备用。
体外培养细胞形态观察发现，滤器血组和外周血组细胞均出现明显的集落样增殖且两者在形态上无明显的差异，都表现为胞核、胞体增大，胞浆增多，浆中出现空泡、颗粒等特征，参见图3。
具体实施例4：过继免疫细胞增殖速率的动态比较
在具体实施例3的基础上，使用24孔板体外培养过继免疫治疗细胞，起始接种量为1×106/孔，在培养的第3、6、9、12天分别使用台盼蓝染色法对培养的过继免疫治疗细胞进行活力计数。其中台盼蓝染色计数方法为，在细胞培养的第3、6、9、12天收集适量细胞，台盼蓝染液(10μl)以1:1均匀混合，在三分钟以内分别对活细胞和死细胞进行计数，显微镜下观察死细胞的胞浆均被染成蓝色，而活细胞拒染，胞浆则呈无色透明状。最后按照公式：(细胞悬液的细胞数)/ml＝(四个大格子细胞数/4)×稀释倍数×104统计活细胞数量和死细胞数量。结果发现：两组细胞增殖速度相似，参见图4。
在具体实施例3基础上，使用96孔板体外培养过继免疫治疗细胞，起始接种量为1×105/孔，在培养的第3、6、9、12天分别加入CCK-8并反应2h，用酶标仪OD＝450进行检测。其中CCK8检测细胞增殖方法为，将细胞以1×105/200μl的浓度种于96孔板，用相应抗体和细胞因子的培养基，在37℃、5％CO2、饱和湿度95％的CO2培养箱内培养在细胞培养，在第3、6、9、12天时每孔加入20μlCCK8孵育2h后在酶联仪检测。从检测结果的读数显示，两组细胞增殖速度几乎无差别，参见图5。
在具体实施例3基础上，在培养第10天收集用CFSE荧光标记过的过继免疫治疗细胞，检测其CD3+T，CD4+T，CD8+T增殖情况。其中用CFSE标记检测人外周血T细胞体外扩增的方法是，取适量分离好的人外周血单个核细胞(PBMC)于适量CFSE的工作液中，轻轻混匀，然后于37℃水浴10min，离心后去上清，加入5ml10％小牛血清的1640溶液，再离心后去上清，重复此操作1次，再加入合适的培养基制成细胞悬液，铺板(24孔板，每孔1×106)，同上加入相应的细胞因子于37℃、5％CO2、饱和湿度95％的CO2培养箱内培养，并每天观察细胞形态，并拍照记录。结果显示，三种细胞增殖速度相当，且没有统计学差异，参见图6。
具体实施例5：扩增后T淋巴细胞亚群分析
在具体实施例3的基础上，在培养的第10天收集培养的过继免疫治疗细胞，检测其两组CD3+CD4+T和CD3+CD8+T细胞群体的变化情况。结果显示，两组的细胞CD3+CD4+T细胞比例为30％到40％；两组的CD3+CD8+T细胞比例为50％到80％；且统计学无差异，参见图7。
具体实施例6：扩增后两组共刺激分子的检测
在具体实施例3的基础上，在培养的第10天收集培养的过继免疫治疗细胞，检测其共刺激分子变化情况。其具体操作过程为：在第0天和第10天分别收集细胞，加入适量的FITC、PE、PE-Cy5、PE-Cy7荧光素标记的抗体，分组如下：CD3—CD4；CD3—CD8；CD3—CD56—CD19；CD3—CD4—CD28—PD-1。震荡混匀，4℃避光孵育20-30min，加入1mlPBS洗涤、震荡、1200rpm离心5min后弃掉上清液，加入500μlPBS，然后上流式细胞仪机器检测，数据文件使用Flowjo软件分析。结果显示，两组的细胞的正性共刺激分子CD28在CD4+细胞比例为50％-70％；在CD8+细胞的比例为40％-50％，统计学无差异，参见图8。而两组细胞的负性共刺激分子PD-1在CD4+细胞比例为20％-30％；占CD8+细胞的比例为10％-20％，统计学无差异，参见图9。其中两组细胞CD28+PD-1+在CD4+细胞的20％-30％；约占CD8+细胞10％，参见图10。
具体实施例7：淋巴细胞经扩增后细胞因子分泌的检测
实验按照CBA检测试剂盒说明进行，分别将50μL的细胞培养上清和标准品加入50μLcapturebead中，再加入50μLPE标记的检测抗体，避光孵育2h，加入1mlPBS洗涤、震荡、1200rpm离心5min后弃掉上清液，加入500μlPBS，然后上流式细胞仪机器检测，数据文件使用CBAsoftware1.1(BDBiosciences)进行分析。经CBA检测试剂盒对Th1/Th2/Th17相关的细胞因子检测，结果显示，两组细胞经扩增后分泌的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、IFN-γ均无差别。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种采用LRS获取白细胞的方法，其特征在于：对经血小板单采术后的单采血小板白细胞滤器在百级洁净区内进行包括如下步骤所述的操作：
(1)使用D-Hank’s液冲洗单采血小板白细胞滤器上的白细胞过滤装置3～4次，去除白细胞过滤装置上附着的血渍并将每次冲洗后所得的冲洗液收集在一起；
(2)继续使用D-Hank’s液冲洗经(1)处理后的单采血小板白细胞滤器上的白细胞过滤装置2～3次，每次30～35s，去除白细胞过滤装置上粘附的物质并将每次冲洗后所得的冲洗液收集在一起；
(3)再次使用D-Hank’s液冲洗经(2)处理后的单采血小板白细胞滤器上的白细胞过滤装置2～3次，将粘附其上的白细胞冲洗脱落，并将每次冲洗后所得的冲洗液收集在一起；
(4)将(1)、(2)和(3)中收集到的冲洗后所得的冲洗液混合形成混合液并转移至无菌离心管中，采用D-Hank’s液将上述混合液进行稀释，其中混合液与D-Hank’s液的质量比为1:18～20；然后采用Ficoll密度梯度离心法按照1:2进行梯度分离，其中离心速率为1800～1900rpm，离心温度为37～37.5℃，离心时间为30～35min，离心过程结束后得到离心液体；
(5)用吸管吸取(4)中得到的离心液体的中间白膜层，得到白细胞粗品，然后采用PBS缓冲液对该白细胞粗品进行洗涤，并采用常温下1200～1300rpm的转速离心5～6min后，弃去上清液，得到沉淀物；将该沉淀物再次使用PBS缓冲液进行洗涤离心后，得到的最终沉淀物为存活的白细胞。
2.含有权利要求1所述方法获得的存活的白细胞的试剂盒。
3.通过权利要求1所述的方法获得的白细胞在免疫学、药理学、肿瘤学和血液学中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：采用单采血小板白细胞滤器获取的白细胞在过继免疫治疗细胞中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：采用单采血小板白细胞滤器获取的白细胞的过继免疫治疗细胞在共刺激分子的表达中的应用。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：采用单采血小板白细胞滤器获取的白细胞在T细胞增殖和经扩增后细胞因子分泌检测中的应用。
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