CN111454902A - 血液分离富集白细胞、干细胞和/或病原体的方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种血液分离富集白细胞、干细胞和/或病原体的方法及装置，涉及细胞采集提取分离检测诊断领域；所述方法包括如下步骤：通过去白细胞过滤器对血液进行过滤，去白细胞过滤器将血液过滤完成后，去白细胞过滤器的子袋与去白细胞过滤器的滤器进行分离；去白细胞过滤器的滤器与去白细胞过滤器的子袋分离后的离断处与含有冲洗液的PVC血袋和含有平衡液的PVC血袋进行无菌接驳；无菌接驳后，去白细胞过滤器的滤器通过含有冲洗液的PVC血袋和含有平衡液的PVC血袋进行反向冲洗，最终分离并富集得到白细胞、干细胞和/或病原体。相比现有技术，本发明不仅能够在血液中高效的提取血液中的白细胞、干细胞和/或病原体，还能够减少污染，降低成本。

Description

血液分离富集白细胞、干细胞和/或病原体的方法及装置

技术领域

本发明涉及细胞采集提取分离检测诊断技术领域，具体而言，涉及一种血液分离富集白细胞、干细胞和/或病原体的方法及装置。

背景技术

外周血(脐血)中的白细胞包括分叶核和单个核细胞，分离富集不同种类的外周血白细胞及脐血干细胞是免疫学研究的最常用基础细胞原材料，标准化数量及质量的细胞获取是保证科研及临床应用的关键环节。正常人的外周血白细胞多数由志愿者捐献，或无偿献血者捐献，离心将血浆与红细胞之间的白膜层(以白细胞、血小板为主)，通过手工分离获得。有些血站采集血液时使用连接有去白细胞滤器的两联或多联血袋血袋，即采集血液后过滤，完成过滤后将去白细胞滤器连同母袋一般情况丢弃按医疗废物处理。去白细胞滤器中的白细胞是可以回收加以利用。但是实验室手工获取的方法效率不高，也有一体化产品设计，使用含有白蛋白的大量回冲液，合成组装、生产包装灭菌工艺复杂且成本高等限制了方法的实际应用。自体白细胞存储技术使用自身捐献的血液，脐血采集都是为了获得白细胞中的单个核细胞(PBMC)，目前应用单一采血袋，分装试管，应用Ficoll分离液，实验室手工分离提取。此外，对于大多数外来病原体感染的机体都有血行转移可能，病原体会短时间或长时间存在外周血中，从一定量的外周血中分离富集病原体也是明确诊断的关键。

现有技术中外周血(脐血)中白细胞、干细胞及病原体等提取效率不高，活性易损、操作烦琐、费工费料、容易污染等诸多不足。目前有采用离心法手工进行分离提取的，但对技术人员要求高，终产品体积大，费工费时费成本。也有采用的是白膜分离技术，但回收效率不足50％。

发明内容

本发明解决的问题是，现有技术回收效率低，活性易损、操作烦琐、费工费料、容易污染中的一个或一个以上的问题。

为解决上述问题，本发明提供一种血液分离富集白细胞、干细胞和/或病原体的方法，包括如下步骤：通过去白细胞过滤器对血液进行过滤，所述去白细胞过滤器将所述血液过滤完成后，所述去白细胞过滤器的子袋与所述去白细胞过滤器的滤器进行分离；

所述去白细胞过滤器的滤器与所述去白细胞过滤器的子袋分离后的离断处与含有冲洗液的PVC血袋和含有平衡液的PVC血袋进行无菌接驳；

无菌接驳后，所述去白细胞过滤器的滤器通过所述含有冲洗液的PVC血袋和所述含有平衡液的PVC血袋进行反向冲洗，最终分离并富集得到白细胞、干细胞和/或病原体；

所述含有冲洗液的PVC血袋中的冲洗液的组分包括，甘氨酸、葡萄糖、EDTA和纯化水；所述含有平衡液的PVC血袋中的平衡液的组分包括，氯化钠和/或磷酸氢二钠和纯化水。

进一步地，所述冲洗液的各组分的质量百分比为：EDTA0.1％-1.0％，甘氨0.5％-3％，葡萄糖0.2％-1.5％；余量为纯化水。

进一步地，所述平衡液的各组分的质量百分比为：氯化钠1.25-4.5％和/或磷酸氢二钠0.4-1.2％，余量为纯化水。

进一步地，在所述通过去白细胞过滤器对血液进行过滤前，还包括如下步骤：使用所述去白细胞过滤器进行血液采集；所述去白细胞过滤器采集所述血液完毕后，静置第一时间。

进一步地，所述去白细胞过滤器将所述血液过滤完成后，所述去白细胞过滤器的子袋与所述去白细胞过滤器的滤器进行分离，包括：所述去白细胞过滤器的子袋与所述去白细胞过滤器的滤器以及所述去白细胞过滤器的母袋进行热合分离。

进一步地，所述去白细胞过滤器的滤器通过所述含有冲洗液的PVC血袋和所述含有平衡液的PVC血袋进行反向冲洗，最终分离并富集得到白细胞、干细胞和/或病原体，包括：

步骤S1：所述去白细胞过滤器的滤器通过所述含有冲洗液的PVC血袋中的一半量的所述冲洗液进行加压回冲，将所述去白细胞过滤器的滤器上的白细胞、干细胞和/或病原体回冲至所述去白细胞过滤器的母袋；

步骤S2：所述去白细胞过滤器的滤器再通过所述含有平衡液的PVC血袋中的全部量的所述平衡液进行加压回冲将所述去白细胞过滤器的滤器上的白细胞、干细胞和/或病原体回冲至所述去白细胞过滤器的母袋；

步骤S3：所述去白细胞过滤器的滤器最后通过将所述含有冲洗液的PVC血袋中剩余一半量的所述冲洗液进行加压回冲，并将所述去白细胞过滤器的滤器上残余的所述白细胞、干细胞和/或病原体回冲至所述去白细胞过滤器的母袋；

步骤S4：停止对所述去白细胞过滤器的滤器冲洗后，将上述所有部件进行离心；

步骤S5：离心后，所述去白细胞过滤器的母袋留有第一留存量的上清液后，所述含有冲洗液的PVC血袋将余下所有上清液进行回装；所述含有冲洗液的PVC血袋回装余下所有上清液完毕后，至所述去白细胞过滤器的母袋被轻轻震荡，所述去白细胞过滤器的母袋的底部及周边附着的白细胞、干细胞和/或病原体混匀并悬浮于所述第一留存量的上清液中；从而得到富集的白细胞、干细胞和/或病原体；将得到富集的白细胞、干细胞和/或病原体成分混匀后，通过所述去白细胞过滤器的滤器流回至所述含有平衡液的PVC血袋中。

在所述步骤S1之前，所述去白细胞过滤器的滤器通过所述含有冲洗液的PVC血袋和所述含有平衡液的PVC血袋进行反向冲洗，最终分离并富集得到白细胞、干细胞和/或病原体，还包括：

所述含有冲洗液的PVC血袋少量挤出所述冲洗液，直至将所述去白细胞过滤器的滤器完全浸润；

和/或，在所述步骤S2之前，所述去白细胞过滤器的滤器通过所述含有冲洗液的PVC血袋和所述含有平衡液的PVC血袋进行反向冲洗，最终分离并富集得到白细胞、干细胞和/或病原体，还包括：

所述含有平衡液的PVC血袋少量挤出所述平衡液，直至将所述去白细胞过滤器的滤器完全浸润。

本发明所述的血液分离富集白细胞、干细胞和/或病原体的方法相对于现有技术的优势在于，本发明不仅能够在血液中不仅能够高效的提取血液中的白细胞、干细胞和/或病原体，还能够减少污染，对技术人员要求低，降低成本。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种血液分离富集白细胞、干细胞和/或病原体的装置，包括，用于连接上述任意一项所述的方法中的含有冲洗液的PVC血袋、含有平衡液的PVC血袋和去白细胞过滤器连接。

进一步地，包括，与所述去白细胞过滤器的滤器与所述去白细胞过滤器的子袋的离断处接驳的管路，所述管路另一端连接有一三通结构，所述三通结构的其余两端通过两个转移管分别连接有所述含有冲洗液的PVC血袋和所述含有平衡液的PVC血袋。

进一步地，两个所述转移管上设置有止流夹；所述含有冲洗液的PVC血袋与所述转移管之间还设有折通管。

本发明所述的血液分离富集白细胞、干细胞和/或病原体的装置相对于现有技术的其他优势与所述的血液分离富集白细胞、干细胞和/或病原体的方法相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。

附图说明

图1为本实施例中的血液分离富集白细胞、干细胞和/或病原体的装置的结构图。

附图标记说明：

1-三通结构；2-转移管；3-止流夹；4-折通管；5-含有平衡液的PVC血袋；6-含有冲洗液的PVC血袋。

具体实施方式

目前，多数实验室采用的是白膜分离技术，效率低，费时费工，白细胞的回收效率不足50％，白膜分离技术中白膜层也是机体菌血症的条件下细菌所富集的地方，主要是因为中性粒细胞吸附结合细菌等病原体的作用，理论上通过富集白细胞可以获取的患者外周血细菌。一般采集外周血量越大，细菌培养的阳性率越高，但是患者丢失过多血液，消耗更多价格较高的进口培养瓶。

以下通过具体的实施例来进一步阐释、说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。术语“第一”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品或通过其他合法合规渠道获得。

实施例一

本实施例提供了一种血液分离富集白细胞、干细胞和/或病原体的方法，

包括如下步骤：通过去白细胞过滤器对血液进行过滤，去白细胞过滤器将血液过滤完成后，去白细胞过滤器的子袋与去白细胞过滤器的滤器进行分离；去白细胞过滤器的滤器与去白细胞过滤器的子袋的分离后的离断处与含有冲洗液的PVC血袋6和含有平衡液的PVC血袋5进行无菌接驳；无菌接驳后，去白细胞过滤器的滤器通过含有冲洗液的PVC血袋6和含有平衡液的PVC血袋5进行反向冲洗(反向指与过滤血液组份时液流相反的方向。)，最终分离并富集白细胞、干细胞和/或病原体。

需要说明的是，本实施例能够通过外周血进行分离富集白细胞或病原体，以及还可以通过脐血中分离富集干细胞。

还需要说明的是，本实施例采用的去白细胞过滤器可采用现有技术中的一次性白细胞采血袋，较佳地，本实施例中的去白细胞过滤器的滤器可采用聚酯过滤膜，聚酯过滤膜能够去除血液中的白细胞率达99.99％以上。优选地，

相比现有技术，本发明不仅能够在血液中不仅能够高效的提取血液中的白细胞、干细胞和/或病原体，还能够减少污染，对技术人员要求低，降低成本。

本实施例中的一种血液分离富集白细胞、干细胞和/或病原体的方法，更为具体的步骤为：

使用去白细胞过滤器进行血液采集；去白细胞过滤器采集血液完毕后，静置第一时间；较佳地，第一时间为2-4h；第一时间可根据采集血液的采血量进行调整；本实施例对于静置时间不做限制，凡是能够将采集到的血液常温静置，达到在本申请所起到的作用即可。

第一时间后，白细胞过滤器开始对血液进行过滤；通过去白细胞过滤器将血液进行过滤，较佳地，将装有全血的去白细胞过滤器的母袋悬挂于高处，去白细胞过滤器的子袋在下方，过滤血液，过滤时间，7-30min。优选地，过滤时间可根据采血量进行调整，但是能够将所血液进行过滤完成即可。

去白细胞过滤器将血液过滤完成后，去白细胞过滤器的子袋与去白细胞过滤器的滤器以及去白细胞过滤器的母袋进行热合分离。

去白细胞过滤器的滤器与去白细胞过滤器的子袋的分离后的离断处通过无菌接驳机与含有冲洗液的PVC血袋6和含有平衡液的PVC血袋5进行无菌接驳；无菌接驳后，去白细胞过滤器的母袋通过含有冲洗液的PVC血袋6和含有平衡液的PVC血袋5进行反向冲洗，最终分离并富集白细胞、干细胞和/或病原体；具体包括：

含有冲洗液的PVC血袋少量挤出冲洗液，直至冲洗液将去白细胞过滤器的滤器完全浸润；较佳地，先打开冲洗液转移管，挤出少许冲洗液完全浸润滤器15-60s，优选30s；超过2min会造成回收白细胞、干细胞和/或病原体成分的损伤。

S1：去白细胞过滤器的滤器通过含有冲洗液的PVC血袋6中的一半量的冲洗液进行加压回冲，将去白细胞过滤器的滤器上的白细胞、干细胞和/或病原体回冲至去白细胞过滤器的母袋；

本发明冲洗过程中的加压可以双手用力挤压，正常男性成人最大握力6成、女性使全力即可，骤挤骤停方式交替。

含有平衡液的PVC血袋少量挤出平衡液，直至平衡液将去白细胞过滤器的滤器完全浸润。较佳地，先打开平衡液转移管，挤出少许平衡液完全浸润滤器15-60s，优选30s；超过2min会造成回收白细胞、干细胞和/或病原体成分的损伤。

S2：去白细胞过滤器的滤器在通过含有平衡液的PVC血袋中的全部量的平衡液进行加压回冲，将去白细胞过滤器的滤器上的白细胞、干细胞和/或病原体回冲至去白细胞过滤器的母袋；

S3：白细胞过滤器的滤器最后通过将含有冲洗液的PVC血袋6中剩余一半量的冲洗液进行加压回冲，并将去白细胞过滤器的滤器上残余的所述白细胞、干细胞和/或病原体回冲至所述去白细胞过滤器的母袋；

冲洗液的组分包括：甘氨酸，葡萄糖，EDTA和纯化水；平衡液的组分包括，氯化钠和/或磷酸氢二钠和纯化水。冲洗液的用来和平衡液的用量实际根据过滤血液的量进行确定。例如：过滤200-400ml血液，可使用100-200ml的冲洗液和25-75ml的平衡液。

冲洗液的组分的质量百分比为：EDTA0.1％-1.0％，甘氨酸0.5％-3％，葡萄糖0.2％-1.5％，余量为纯化水；优选地，冲洗液的组分的质量百分比为：EDTA0.4％，甘氨酸1.37％，葡萄糖0.85％，余量为纯化水。

冲洗液为低渗溶液，低渗是指渗透压低于血浆渗透压。优选渗透压低于270mmol/L。冲洗液由于低渗，削减血细胞与聚酯纤维的电荷吸附作用，使血细胞从滤器纤维层中脱离出来。

平衡液是含有氯化钠的高渗溶液。高渗是指渗透压高于血浆渗透压。优选渗透压高于480mmol/L。

平衡液的组分的质量百分比为：氯化钠1.25-4.5％。平衡液还可以含有磷酸氢二钠，优选地，平衡液的组分的质量百分比为：氯化钠1.25-4.5％，磷酸氢二钠0.4-1.2％。

平衡液高渗使滤器纤维回缩，使滤器内聚酯层叠原来致密的缝隙加大，结构松散，在液体压力冲击下使缝隙中血细胞游离出来。低渗冲洗液和高渗平衡液在收集袋中混合，使回收的细胞成分回到等渗状态，更容易保持细胞活性。

冲洗液和平衡液均为水溶液，优选为无菌水溶液。本发明的冲洗液，能使电荷吸附在过滤装置上的分叶核细胞解离，使血小板与分叶核白细胞解离，将分叶核白细胞先解离冲出滤器。平衡液能改变滤器中聚酯纤维间间距，解离单个核细胞，提高回收率，亦可改良回收白细胞、干细胞和/或病原体冲洗液成分配方以保证其活性。

S4：停止对去白细胞过滤器的滤器冲洗后，将上述所有部件进行离心；较佳地，将接驳后的所有部件放入离心机中进行离心(离心力3000g，离心时间：10-15min)。

S5：离心后，去白细胞过滤器的母袋留有第一留存量的上清液后，含有冲洗液的PVC血袋6将余下所有上清液进行回装；含有冲洗液的PVC血袋6回装余下所有上清液完毕后后，去白细胞过滤器的母袋被轻轻震荡，去白细胞过滤器的母袋的底部及周边附着的白细胞、干细胞和/或病原体混匀并悬浮于第一留存量的上清液中；从而得到富集的白细胞、干细胞和/或病原体；将得到富集的白细胞、干细胞和/或病原体成分混匀后，通过去白细胞过滤器的滤器流回至含有平衡液的PVC血袋中。第一留存量根据所需要富集的白细胞或干细胞或病原体的类别进行留存。

如果采集的是外周血，过滤至子袋的血液可回输给接受者或用于血站的血液供应，如采集的是脐血，过滤后的脐血废弃或做它用。

如果采集的是外周血，富集后的外周血的白细胞可以直接加入冻存液-80℃保存或即时用于临床；富集后外周血的病原体，将交微生物学实验室按血标本培养操作。

如果采集的是脐血，富集的脐血中的干细胞可以直接加入冻存液-80℃保存或即时用于临床；富集的干细胞的病原体可以直接加入冻存液-80℃保存或实验室研究或感染诊断。

需要说明的是，本发明中使用“冲洗液”和“平衡液”的名称仅为方便描述发明内容，并不构成对发明内容的限制，具有与本发明“冲洗液”和“平衡液”相同组成的溶液，均包括在本发明“冲洗液”和“平衡液”的范围内，无论是否采用“冲洗液”和“平衡液”的名称。

优选地，本发明的方法还可以从血站废弃的外周血或脐血过滤后去白细胞滤器回收细胞，不涉及进入人体；效率高、简便易行，并可以在密闭状态下操作，无外界污染。而且过滤至去白细胞过滤器的子袋的外周血还可回输给接受者或用于血站的血液供应，过滤后的脐血废弃或做它用。

本发明方法方便高效，实施例中白细胞产品回收效率可达到99％以上，细胞活性90％以上，红细胞混杂少于5％，相比现有技术具有明显优势。

下表为现有技术富集到的白细胞或干细胞与本发明的进行实验结果对比：

实施例二

冲洗液、平衡液的制备；

冲洗液：药品级EDTA、甘氨酸、葡萄糖称重，放入纯化水中搅拌均匀即可。

平衡液：药品级氯化钠、磷酸氢二钠(需要时)称重，放入纯化水中搅拌均匀即可。

冲洗液和平衡液可以罐装于PVC血袋中，并热合灌装口。

冲洗液和平衡液的灭菌：可采用湿热灭菌的方式灭菌，产品在药液灌装完毕后直接进行湿热灭菌(115℃，30min)，灭菌完成后进行产品包装表面的清洗，烘干(60℃，45min)。下一步进行灯检，贴签，抽真空包装。包装完毕后进行类似巴氏灭菌工艺灭菌(80℃，60min)。上述为本实施例中冲洗液和平衡液较佳的制备方法，针对于冲洗液和平衡液的制备也可通过常规方法制备。

实施例三

如图1所示，本实施例提供了一种血液分离富集白细胞、干细胞和/或病原体的装置，包括用于连接实施例1的方法中的含有冲洗液PVC血袋、含有平衡液的PVC血袋和去白细胞过滤器连接。所述装置还包括：与去白细胞过滤器的滤器与去白细胞过滤器的子袋的离断处接驳的管路，较佳地，管理可采用PVC材质的管路，PVC材质的管路不溶于水、酒精、汽油，气体、水汽渗漏性低，具有一定的抗化学腐蚀性；管路另一端连接有一三通结构1，三通结构1的其余两端通过两个转移管2分别连接有含有冲洗液的PVC血袋6和含有平衡液的PVC血袋5两个转移管2上设置有止流夹3；含有冲洗液的PVC血袋6与转移管2之间还设有折通管4。

本发明的装置在将去白细胞过滤器的子袋与去白细胞过滤器的滤器以及去白细胞过滤器的母袋进行热合分离后进行使用。本发明的装置易操作使用，使用人员要求低，装置体积小，价格低廉。

实施例四

从外周血中分离富集白细胞

使用去白细胞过滤器进行血液采集；采集接受者200-400ml外周血，去白细胞过滤器采集血液完毕后，常温静置2.5h，将装有全血的去白细胞过滤器的母袋悬挂于高处，去白细胞过滤器的子袋在下方，过滤血液，过滤时间15-30min。

去白细胞过滤器将血液过滤完成后，去白细胞过滤器的子袋与去白细胞过滤器的滤器以及去白细胞过滤器的母袋进行热合分离。

去白细胞过滤器的滤器与去白细胞过滤器的子袋分离后的离断处通过无菌接驳机与含有冲洗液的PVC血袋6和含有平衡液的PVC血袋5进行无菌接驳；无菌接驳后，先打开含有冲洗液的PVC血袋6一侧的转移管，含有冲洗液的PVC血袋少量挤出冲洗液，冲洗液完全浸润去白细胞过滤器的滤器60s后；去白细胞过滤器的滤器通过含有冲洗液的PVC血袋6中的一半量的冲洗液进行加压回冲，将去白细胞过滤器的滤器上的白细胞回冲至去白细胞过滤器的母袋；打开含有平衡液的PVC血袋5一侧的转移管，含有平衡液的PVC血袋少量挤出平衡液，平衡液完全浸润去白细胞过滤器的滤器15s，去白细胞过滤器的滤器在通过含有平衡液的PVC血袋中的全部量的平衡液进行加压回冲，去白细胞过滤器的滤器上的白细胞回冲至去白细胞过滤器的母袋；白细胞过滤器的滤器最后通过含有冲洗液的PVC血袋6中剩余一半量的冲洗液进行加压回冲，并将去白细胞过滤器的滤器上残余的白细胞回冲至去白细胞过滤器的母袋；停止对去白细胞过滤器的滤器冲洗后，关闭所有去白细胞过滤器的母袋与接驳含有冲洗液的PVC血袋6和含有平衡液的PVC血袋5的止流夹，将所有部件放入离心机中进行离心(离心力3000g，离心时间：10-15min)。

离心取出后，用分浆夹，打开去白细胞过滤器的滤器旁路和含有冲洗液的PVC血袋6近端止流夹(即打开含有冲洗液的PVC血袋6一侧的转移管)，旁路去白细胞过滤器的母袋留下约30-50ml上清液后，含有冲洗液的PVC血袋6将余下所有清液经去白细胞过滤器的滤器旁路回装。去白细胞过滤器的母袋被轻轻震荡，去白细胞过滤器的母袋的底部及周边附着的白细胞混匀悬浮于30-50ml的上清液中；

关闭含有冲洗液的PVC血袋6近端止流夹，打开含有平衡液的PVC血袋5近端止流夹，从而得到富集的白细胞；将得到富集的白细胞成分混匀后，通过去白细胞过滤器的滤器流回至含有平衡液的PVC血袋中。

其中，冲洗液的组分包括：甘氨酸，葡萄糖，EDTA和纯化水；冲洗液200ml，冲洗液的组分的质量百分比为：EDTA0.1％-1.0％，甘氨酸0.5％-3％，葡萄糖0.2％-1.5％，余量为纯化水；

平衡液组分包括：氯化钠和/或磷酸氢二钠；平衡液50ml，平衡液的组分的质量百分比为：氯化钠1.25-4.5％和/或磷酸氢二钠0.4-1.2％。

结果表明：全自动血细胞计数仪取样测定，白细胞回收率99％以上，PBMC回收率99％以上，MTT试剂盒检测前后对比，细胞活性90％以上。

实施例五

从脐血中分离富干细胞

使用去白细胞过滤器进行血液采集；采集接受者50-100ml脐血，去白细胞过滤器采集血液完毕后，常温静置2h，将装有全血的去白细胞过滤器的母袋悬挂于高处，去白细胞过滤器的子袋在下方，过滤血液，过滤时间，7-15min。

去白细胞过滤器将血液过滤完成后，去白细胞过滤器的子袋与去白细胞过滤器的滤器以及去白细胞过滤器的母袋进行热合分离。

去白细胞过滤器的滤器与去白细胞过滤器的子袋分离后的离断处通过无菌接驳机与含有冲洗液的PVC血袋6和含有平衡液的PVC血袋5进行无菌接驳；无菌接驳后，先打开含有冲洗液的PVC血袋6一侧的转移管，含有冲洗液的PVC血袋少量挤出冲洗液，冲洗液完全浸润去白细胞过滤器的滤器30s后；去白细胞过滤器的滤器通过含有冲洗液的PVC血袋6中的一半量的冲洗液进行加压回冲，将去白细胞过滤器的滤器上的干细胞回冲至去白细胞过滤器的母袋；打开含有平衡液的PVC血袋5一侧的转移管，含有平衡液的PVC血袋少量挤出平衡液，平衡液完全浸润去白细胞过滤器的滤器30s，去白细胞过滤器的滤器在通过含有平衡液的PVC血袋中的全部量的平衡液进行加压回冲，去白细胞过滤器的滤器上的干细胞回冲至去白细胞过滤器的母袋；白细胞过滤器的滤器最后通过含有冲洗液的PVC血袋6中剩余一半量的冲洗液进行加压回冲，并将去白细胞过滤器的滤器上残余的干细胞回冲至去白细胞过滤器的母袋；停止对去白细胞过滤器的滤器上冲洗后，关闭所有去白细胞过滤器的母袋与接驳含有冲洗液的PVC血袋6和含有平衡液的PVC血袋5的止流夹，将所有部件放入离心机中进行离心(离心力3000g，离心时间：10-15min)。

离心取出后，用分浆夹，打开去白细胞过滤器的滤器旁路和含有冲洗液的PVC血袋6近端止流夹(即打开含有冲洗液的PVC血袋6一侧的转移管)，旁路去白细胞过滤器的母袋留下约15-25ml上清液后，含有冲洗液的PVC血袋6将余下所有上清液经去白细胞过滤器的滤器旁路回装。去白细胞过滤器的母袋被轻轻震荡，去白细胞过滤器的母袋的底部及周边附着的干细胞混匀悬浮于15-25ml的上清液中；

关闭含有冲洗液的PVC血袋6近端止流夹，打开含有平衡液的PVC血袋5近端止流夹，从而得到富集的干细胞；将得到富集的干细胞成分混匀后，通过去白细胞过滤器的滤器流回至含有平衡液的PVC血袋中。

其中，冲洗液的组分包括：甘氨酸，葡萄糖，EDTA和纯化水；冲洗液100ml冲洗液的组分的质量百分比为：EDTA0.1％-1.0％，甘氨酸0.5％-3％，葡萄糖0.2％-1.5％，余量为纯化水；

平衡液的组分包括：氯化钠和/或磷酸氢二钠；平衡液25ml，平衡液的组分的质量百分比为：氯化钠1.25-4.5％和/或磷酸氢二钠0.4-1.2％。

实施例六

从外周血中分离富集细菌等病原体

使用去白细胞过滤器进行血液采集；采集接受者200-400ml外周血，去白细胞过滤器采集血液完毕后，常温静置3h，将装有全血的去白细胞过滤器的母袋悬挂于高处，去白细胞过滤器的子袋在下方，过滤血液，过滤时间，15-30min。

去白细胞过滤器将血液过滤完成后，去白细胞过滤器的子袋与去白细胞过滤器的滤器以及去白细胞过滤器的母袋进行热合分离。

去白细胞过滤器的滤器与去白细胞过滤器的子袋分离后的离断处通过无菌接驳机与含有冲洗液的PVC血袋6和含有平衡液的PVC血袋5进行无菌接驳；无菌接驳后，先打开含有冲洗液的PVC血袋6一侧的转移管，有冲洗液的PVC血袋少量挤出冲洗液，冲洗液完全浸润去白细胞过滤器的滤器15s后，去白细胞过滤器的滤器通过含有冲洗液的PVC血袋6中的一半量的冲洗液进行加压回冲，将去白细胞过滤器的滤器上的细菌等病原体回冲至去白细胞过滤器的母袋；打开含有平衡液的PVC血袋5一侧的转移管，含有平衡液的PVC血袋少量挤出平衡液，平衡液完全浸润去白细胞过滤器的滤器15s，去白细胞过滤器的滤器在通过含有平衡液的PVC血袋中的全部量的平衡液进行加压回冲，去白细胞过滤器的滤器上的细菌等病原体回冲至去白细胞过滤器的母袋；白细胞过滤器的滤器最后通过含有冲洗液的PVC血袋6中剩余一半量的冲洗液进行加压回冲，并将对去白细胞过滤器的滤器上残余的白细胞和细菌等病原体回冲至去白细胞过滤器的母袋；停止对对去白细胞过滤器的滤器上冲洗后，关闭所有去白细胞过滤器的母袋与接驳含有冲洗液的PVC血袋6和含有平衡液的PVC血袋5的止流夹，将所有部件放入离心机中进行离心(离心力3000g，离心时间：10-15min)。

离心取出后，用分浆夹，打开去白细胞过滤器的滤器旁路和含有冲洗液的PVC血袋6近端止流夹(即打开含有冲洗液的PVC血袋6一侧的转移管)，去白细胞过滤器的母袋留下约10或20ml上清液后，含有冲洗液的PVC血袋6将余下所有上清液经去白细胞过滤器的滤器旁路回装。去白细胞过滤器的母袋被轻轻震荡，去白细胞过滤器的母袋的底部及周边附着的细菌等病原体混匀悬浮于10或20ml的上清液中；

关闭含有冲洗液的PVC血袋6近端止流夹，打开含有平衡液的PVC血袋5近端止流夹，从而得到富集的细菌等病原体；将得到富集的细菌等病原体成分混匀后，通过去白细胞过滤器的滤器流回至含有平衡液的PVC血袋中。

如上清液10ml就一次性放入细菌培养瓶中，如上清液20ml就分别放入两个培养瓶中，送检。

其中，冲洗液的组分包括：甘氨酸，葡萄糖，EDTA和纯化水；冲洗液200ml，冲洗液的组分的质量百分比为：EDTA0.1％-1.0％，甘氨酸0.5％-3％，葡萄糖0.2％-1.5％，余量为纯化水；

平衡液的组分包括：氯化钠和/或磷酸氢二钠；平衡液50ml，平衡液的组分的质量百分比为：氯化钠1.25-4.5％和/或磷酸氢二钠0.4-1.2％。

结果表明：送检阳性率80％以上。细菌培养的阳性率与采血时间，患者病情密切相关。实验室人为添加大肠杆菌10CFU，阳性率100％，5个10CFU，阳性率82％。

实施例七

从外周血中分离富集白细胞

本实施例与实施例四的区别之处在于：冲洗液150ml，冲洗液的组分的质量百分比分别为：EDTA0.1％，甘氨酸2％，磷酸二氢钾溶液0.2％，1.0％葡萄糖，余量为纯化水；平衡液75ml，平衡液的组分的质量百分比为：氯化钠1.25％，余量为纯化水。

结果表明：全自动血细胞计数仪取样测定，白细胞回收率83％左右，PBMC回收率92％以上，MTT试剂盒检测前后对比，细胞活性90％以上。

实施例八

从外周血中分离富集白细胞

本实施例与实施例四的区别之处在于：冲洗液200ml，冲洗液的组分的质量百分比分别为：EDTA0.8％，甘氨酸0.5％，葡萄糖1.5％，余量为纯化水。平衡液25ml，平衡液的组分的质量百分比分别为：氯化钠4.5％，磷酸氢二钠溶液0.4％，余量为纯化水。全

结果表明：自动血细胞计数仪取样测定，白细胞回收率97％左右，PBMC回收率98％以上，MTT试剂盒检测前后对比，细胞活性85％以上。

实施例九

从外周血中分离富集白细胞

本实施例与实施例四的区别之处在于：冲洗液100ml，冲洗液的组分的质量百分比分别为：EDTA1.0％，甘氨酸3％，葡萄糖0.2％，余量为纯化水。平衡液25ml，平衡液的组分的质量百分比分别为：氯化钠3％，磷酸氢二钠溶液1％，余量为纯化水。

结果表明：全自动血细胞计数仪取样测定，白细胞回收率95％左右，PBMC回收率95％以上，MTT试剂盒检测前后对比，细胞活性85％以上。

实施例十

从外周血中分离富集白细胞

本实施例与实施例四的区别之处在于：冲洗液200ml，冲洗液的组分的质量百分比分别为：EDTA0.3％，甘氨酸1.6％，葡萄糖0.7％，余量为纯化水。平衡液50ml，平衡液的组分的质量百分比分别为：氯化钠2.0％，磷酸氢二钠溶液1.2％，余量为纯化水。

结果表明：全自动血细胞计数仪取样测定，白细胞回收率90％左右，PBMC回收率90％以上，MTT试剂盒检测前后对比，细胞活性95％以上。

实施例十一

从外周血中分离富集白细胞

本实施例与实施例四的区别之处在于：冲洗液150ml，冲洗液的组分的质量百分比分别为：EDTA0.5％，甘氨酸1.0％，葡萄糖0.9％，余量为纯化水。平衡液75ml，平衡液的组分的质量百分比分别为：氯化钠1.8％、磷酸氢二钠溶液1.2％，余量为纯化水。

结果表明：全自动血细胞计数仪取样测定，白细胞回收率95％左右，PBMC回收率90％以上，MTT试剂盒检测前后对比，细胞活性90％以上。

虽然本发明公开披露如上，但本发明公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员在不脱离本发明公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种血液分离富集白细胞、干细胞和/或病原体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

通过去白细胞过滤器对血液进行过滤，所述去白细胞过滤器将所述血液过滤完成后，所述去白细胞过滤器的子袋与所述去白细胞过滤器的滤器进行分离；

所述去白细胞过滤器的滤器与所述去白细胞过滤器的子袋分离后的离断处与含有冲洗液的PVC血袋(6)和含有平衡液的PVC血袋(5)进行无菌接驳；

无菌接驳后，所述去白细胞过滤器的滤器通过所述含有冲洗液的PVC血袋(6)和所述含有平衡液的PVC血袋(5)进行反向冲洗，最终分离并富集得到白细胞、干细胞和/或病原体；

所述含有冲洗液的PVC血袋中的冲洗液的组分包括，甘氨酸、葡萄糖、EDTA和纯化水；所述含有平衡液的PVC血袋中的平衡液的组分包括，氯化钠和/或磷酸氢二钠和纯化水。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冲洗液的各组分的质量百分比为：EDTA0.1％-1.0％，甘氨0.5％-3％，葡萄糖0.2％-1.5％；余量为纯化水。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述平衡液的各组分的质量百分比为：氯化钠1.25-4.5％和/或磷酸氢二钠0.4-1.2％，余量为纯化水。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，在所述通过去白细胞过滤器对血液进行过滤前，还包括如下步骤：

使用所述去白细胞过滤器进行血液采集；所述去白细胞过滤器采集所述血液完毕后，静置第一时间。

5.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，所述去白细胞过滤器将所述血液过滤完成后，所述去白细胞过滤器的子袋与所述去白细胞过滤器的滤器进行分离，包括：

所述去白细胞过滤器的子袋与所述去白细胞过滤器的滤器以及所述去白细胞过滤器的母袋进行热合分离。

6.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，所述去白细胞过滤器的滤器通过所述含有冲洗液的PVC血袋(6)和所述含有平衡液的PVC血袋(5)进行反向冲洗，最终分离并富集得到白细胞、干细胞和/或病原体，包括：

步骤S1：所述去白细胞过滤器的滤器通过所述含有冲洗液的PVC血袋(6)中的一半量的所述冲洗液进行加压回冲，将所述去白细胞过滤器的滤器上的白细胞、干细胞和/或病原体回冲至所述去白细胞过滤器的母袋；

步骤S2：所述去白细胞过滤器的滤器再通过所述含有平衡液的PVC血袋(5)中的全部量的所述平衡液进行加压回冲将所述去白细胞过滤器的滤器上的白细胞、干细胞和/或病原体回冲至所述去白细胞过滤器的母袋；

步骤S3：所述去白细胞过滤器的滤器最后通过将所述含有冲洗液的PVC血袋(6)中剩余一半量的所述冲洗液进行加压回冲，并将所述去白细胞过滤器的滤器上残余的所述白细胞、干细胞和/或病原体回冲至所述去白细胞过滤器的母袋；

步骤S4：停止对所述去白细胞过滤器的滤器冲洗后，将上述所有部件进行离心；

步骤S5：离心后，所述去白细胞过滤器的母袋留有第一留存量的上清液后，所述含有冲洗液的PVC血袋(6)将余下所有上清液进行回装；所述含有冲洗液的PVC血袋(6)回装余下所有上清液完毕后，所述去白细胞过滤器的母袋被轻轻震荡，所述去白细胞过滤器的母袋的底部及周边附着的白细胞、干细胞和/或病原体混匀并悬浮于所述第一留存量的上清液中；从而得到富集的白细胞、干细胞和/或病原体；将得到富集的白细胞、干细胞和/或病原体成分混匀后，通过所述去白细胞过滤器的滤器流回至所述含有平衡液的PVC血袋中。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述步骤S1之前，所述去白细胞过滤器的滤器通过所述含有冲洗液的PVC血袋(6)和所述含有平衡液的PVC血袋(5)进行反向冲洗，最终分离并富集得到白细胞、干细胞和/或病原体，还包括：

所述含有冲洗液的PVC血袋(6)少量挤出所述冲洗液，直至将所述去白细胞过滤器的滤器完全浸润；

和/或，在所述步骤S2之前，所述去白细胞过滤器的滤器通过所述含有冲洗液的PVC血袋(6)和所述含有平衡液的PVC血袋(5)进行反向冲洗，最终分离并富集得到白细胞、干细胞和/或病原体，还包括：

所述含有平衡液的PVC血袋(5)少量挤出所述平衡液，直至将所述去白细胞过滤器的滤器完全浸润。

8.一种血液分离富集白细胞、干细胞和/或病原体的装置，其特征在于，用于连接如权利要求1-7任意一项所述的方法中的含有冲洗液的PVC血袋(6)、含有平衡液的PVC血袋(5)和去白细胞过滤器连接。

9.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，包括，与所述去白细胞过滤器的滤器和所述去白细胞过滤器的子袋的离断处接驳的管路，所述管路另一端连接有一三通结构(1)，所述三通结构(1)的其余两端通过两个转移管(2)分别连接有所述含有冲洗液的PVC血袋(6)和所述含有平衡液的PVC血袋(5)。

10.根据权利要求9所述的装置，其特征在于，两个所述转移管(2)上设置有止流夹(3)；所述含有冲洗液的PVC血袋(6)与所述转移管(2)之间还设有折通管(4)。

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