CN112080460A - 一种干细胞外泌体的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种干细胞外泌体的提取方法，涉及网络安全应用技术领域。该干细胞外泌体的提取方法，包括以下步骤：S1、采用含血清培养基培养干细胞，培养至一定时间，然后提取干细胞，将干细胞放置在不含血清的培养基中，培养至一定时间，S2、祛除S1中不含血清培养基中的干细胞进行过滤干细胞，提取剩下部分。该干细胞外泌体的提取方法，进行过滤获取的余液在4℃温育并低速离心，并加入沉淀物聚乙二醇进行沉淀，从而使得对分离的外泌体影响小，放置无菌低温环境下进行存储，超速离心与蔗糖密度梯度相结合，实现外泌体分离，囊泡与不同密度的颗粒分开，提取含量低的外泌体，从而达到高纯度提取外泌体，且操作方便，方便工作人员进行实验与使用。

Description

一种干细胞外泌体的提取方法
技术领域
本发明涉及网络安全应用技术领域，特别的为一种干细胞外泌体的提取方法。
背景技术
种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中，有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究，外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。
但是现有的干细胞外泌体提取的方法，一般是使用差速离心，由于样本的粘度与分离的外泌体纯度有显着的相关性，因此，具有高粘度的生物样品（例如血浆和血清样本）需要更长的超速离心步骤和更高的离心速度，从而使得提取的外泌体的纯度不是很高，提取时间过长，从而影响实验结果。
发明内容
本发明提供的发明目的在于提供一种干细胞外泌体的提取方法，该解决上述背景技术中的问题。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种干细胞外泌体的提取方法，包括以下步骤：
S1、采用含血清培养基培养干细胞，培养至一定时间，然后提取干细胞，将干细胞放置在不含血清的培养基中，培养至一定时间。
S2、祛除S1中不含血清培养基中的干细胞进行过滤干细胞，提取剩下部分。
S3、将S2中获取的提取液进行离心并进行下一步沉淀，等待一定时间，将沉淀后的液体进行收集。
S4、将S3收集的液体进行密度梯度离心，将提纯的液体通过收集管进行高纯度外泌体的收集。
进一步地，在根据S1中的操作步骤中，向容器内加入所需水量的一部分，按照培养基的配方，称取各种原料，依次加入使其溶解，最后应在全部原料溶解后加水补足，将培养基倒置过来，平放在恒温箱里，18～24小时后检查，如培养基末长杂菌，即可用来培养微生物，然后进行实验，在含血清培养基中进行无菌环境培养24～36小时，在不含血清的培养基中进行无菌环境培养36～48小时麻将培养后的干细胞放置在采血袋中。
进一步地，在根据S2中的操作步骤中，根据细胞的大小不同，可通过超滤膜过滤膜具，使用0.8μm、0.45μm或0.22μm的孔径对不同大小的干细胞进行过滤，再将离心过的采血袋倒置的悬挂在分浆夹的固定挤压板上,用5ml的注射器从采血袋的热合掉的端口扎入，用于提取液体，将提取液放置无菌存放盒中。
进一步地，在根据S3中的操作步骤中，使用EP管将提取液进行浓缩处理，并将提取液与含聚合物的沉淀溶液混合，并将混合后液体的液体放置在4℃温育并低速离心，聚合物一般使用聚乙二醇。
进一步地，在根据S3中的操作步骤中，将混合沉淀的液体放置商品化试剂盒中，沉淀20～30小时，通过提取管将放置商品化试剂盒中上清液体进行去除，并将沉淀物用注射器进行收集，放置无菌低温环境下进行存储。
进一步地，在根据S4中的操作步骤中，通过注射器将沉淀物注射至离心容器中，在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围收集，实现外泌体分离。
进一步地，在根据S4中的操作步骤中，将外泌体通过收集管进行提取，并通过注射器将外泌体溶于100ul生理盐水中，通过无菌容器进行收集，此外通过注射器提取1mg外泌体溶于10ul生理盐水中，放入无菌低温环境中，用于备用。
本发明提供了一种干细胞外泌体的提取方法。具备以下有益效果：
该干细胞外泌体的提取方法，通过含血清的培养基培养后，再用不含血清的培养基培养干细胞，根据观察不同的细胞的大小，过滤膜具对干细胞进行过滤，进行过滤获取的余液在4℃温育并低速离心，并加入沉淀物聚乙二醇进行沉淀，从而使得对分离的外泌体影响小、pH中性，沉淀20～30小时，通过提取管将放置商品化试剂盒中上清液体进行去除，并将沉淀物用注射器进行收集，放置无菌低温环境下进行存储，将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，实现外泌体分离，将囊泡与不同密度的颗粒分开，能够提取含量低的外泌体，再将外泌体通过收集管进行提取，溶于100ul生理盐水中，并提取1mg外泌体溶于10ul生理盐水中，用于备用，从而达到高纯度提取外泌体，且操作方便，方便工作人员进行实验与使用。
附图说明
图1为本发明的方法流程图。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围，下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明：
实施例1，参照图1：本发明提供一种技术方案：一种干细胞外泌体的提取方法，包括以下具体实施步骤：
步骤一、采用含血清培养基培养干细胞，培养至一定时间，然后提取干细胞，将干细胞放置在不含血清的培养基中，培养至一定时间，在实验前将向容器内加入所需水量的一部分，按照培养基的配方，称取各种原料，依次加入使其溶解，最后应在全部原料溶解后加水补足，将培养基倒置过来，平放在恒温箱里，18～24小时后检查，如培养基末长杂菌，即可用来培养微生物，然后进行实验，在含血清培养基中进行无菌环境培养24～36小时，当细胞融合度在65%以上时，移除含血清的培养基，在不含血清的培养基中进行无菌环境培养36～48小时麻将培养后的干细胞放置在采血袋中，对干细胞进行培养，使细胞融合度在90%以上。
步骤二、祛除步骤一中不含血清培养基中的干细胞进行过滤干细胞，提取剩下部分，根据细胞的大小不同，可通过超滤膜过滤膜具，使用0.8μm、0.45μm或0.22μm的孔径对不同大小的干细胞进行过滤，再将离心过的采血袋倒置的悬挂在分浆夹的固定挤压板上,用5ml的注射器从采血袋的热合掉的端口扎入，用于提取液体，将提取液放置无菌存放盒中，并且根据不同细胞的大小可用于收集可用于收集大于800nm、400nm或200nm的提取液。
步骤三、将步骤二中获取的提取液进行离心并进行下一步沉淀，等待一定时间，使用EP管将提取液进行浓缩处理，并将提取液与含聚合物的沉淀溶液混合，并将混合后液体的液体放置在4℃温育并低速离心，聚合物一般使用聚乙二醇（PEG），将混合沉淀的液体放置商品化试剂盒中，沉淀20～30小时，通过提取管将放置商品化试剂盒中上清液体进行去除，并将沉淀物用注射器进行收集，放置无菌低温环境下进行存储。
步骤四、在根据步骤三中的操作步骤中，将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，通过注射器将沉淀物注射至离心容器中，在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围收集，实现外泌体分离，将外泌体通过收集管进行提取，并通过注射器将外泌体溶于100ul生理盐水中，通过无菌容器进行收集，此外通过注射器提取1mg外泌体溶于10ul生理盐水中，放入无菌低温环境中，用于备用。
本发明中，在实验前将向容器内加入所需水量的一部分，按照培养基的配方，称取各种原料，依次加入使其溶解，最后应在全部原料溶解后加水补足，将培养基倒置过来，平放在恒温箱里，18～24小时后检查，如培养基末长杂菌，即可用来培养微生物，然后进行实验，在含血清培养基中进行无菌环境培养24～36小时，当细胞融合度在65%以上时，移除含血清的培养基，在不含血清的培养基中进行无菌环境培养36～48小时麻将培养后的干细胞放置在采血袋中，对干细胞进行培养，使细胞融合度在90%以上，根据细胞的大小不同，可通过超滤膜过滤膜具，使用0.8μm、0.45μm或0.22μm的孔径对不同大小的干细胞进行过滤，再将离心过的采血袋倒置的悬挂在分浆夹的固定挤压板上,用5ml的注射器从采血袋的热合掉的端口扎入，用于提取液体，将提取液放置无菌存放盒中，并且根据不同细胞的大小可用于收集可用于收集大于800nm、400nm或200nm的提取液，使用EP管将提取液进行浓缩处理，并将提取液与含聚合物的沉淀溶液混合，并将混合后液体的液体放置在4℃温育并低速离心，聚合物一般使用聚乙二醇（PEG），将混合沉淀的液体放置商品化试剂盒中，沉淀20～30小时，通过提取管将放置商品化试剂盒中上清液体进行去除，并将沉淀物用注射器进行收集，放置无菌低温环境下进行存储，通过注射器将沉淀物注射至离心容器中，在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围收集，实现外泌体分离，将外泌体通过收集管进行提取，并通过注射器将外泌体溶于100ul生理盐水中，通过无菌容器进行收集，此外通过注射器提取1mg外泌体溶于10ul生理盐水中，放入无菌低温环境中，用于备用。
以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采用含血清培养基培养干细胞，培养至一定时间，然后提取干细胞，将干细胞放置在不含血清的培养基中，培养至一定时间；
S2、祛除S1中不含血清培养基中的干细胞进行过滤干细胞，提取剩下部分；
S3、将S2中获取的提取液进行离心并进行下一步沉淀，等待一定时间，将沉淀后的液体进行收集；
S4、将S3收集的液体进行密度梯度离心，将提纯的液体通过收集管进行高纯度外泌体的收集。
2.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，在根据S1中的操作步骤中，向容器内加入所需水量的一部分，按照培养基的配方，称取各种原料，依次加入使其溶解，最后应在全部原料溶解后加水补足，将培养基倒置过来，平放在恒温箱里，18～24小时后检查，如培养基末长杂菌，即可用来培养微生物，然后进行实验，在含血清培养基中进行无菌环境培养24～36小时，在不含血清的培养基中进行无菌环境培养36～48小时麻将培养后的干细胞放置在采血袋中。
3.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，在根据S2中的操作步骤中，根据细胞的大小不同，可通过超滤膜过滤膜具，使用0.8μm、0.45μm或0.22μm的孔径对不同大小的干细胞进行过滤，再将离心过的采血袋倒置的悬挂在分浆夹的固定挤压板上,用5ml的注射器从采血袋的热合掉的端口扎入，用于提取液体，将提取液放置无菌存放盒中。
4.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，在根据S3中的操作步骤中，使用EP管将提取液进行浓缩处理，并将提取液与含聚合物的沉淀溶液混合，并将混合后液体的液体放置在4℃温育并低速离心，聚合物一般使用聚乙二醇。
5.根据权利要求4所述的一种干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，在根据S3中的操作步骤中，将混合沉淀的液体放置商品化试剂盒中，沉淀20～30小时，通过提取管将放置商品化试剂盒中上清液体进行去除，并将沉淀物用注射器进行收集，放置无菌低温环境下进行存储。
6.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，在根据S4中的操作步骤中，通过注射器将沉淀物注射至离心容器中，在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围收集，实现外泌体分离。
7.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，在根据S4中的操作步骤中，将外泌体通过收集管进行提取，并通过注射器将外泌体溶于100ul生理盐水中，通过无菌容器进行收集，此外通过注射器提取1mg外泌体溶于10ul生理盐水中，放入无菌低温环境中，用于备用。
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