CN113166724A - 从iPSC及其衍生物制备用于任何临床用途的外泌体的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种用于制备源自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体的方法，其包括：(i)在培养基中培养iPSC或iPSC衍生细胞；(ii)当细胞达到至少80％融合时获得包含第一上清液和贴壁细胞的细胞培养物，收集第一上清液，用含有胰蛋白酶或胰蛋白酶替代物的培养基处理贴壁细胞；(iii)收集经处理的细胞并将其添加到第一上清液以获得混合物；(iv)通过对混合物热激并离心获得第二上清液和细胞沉淀；和(v)将第二上清液过滤至少一次以获得外泌体。本申请还提供通过上述方法制备的外泌体以及外泌体的用途。本申请的方法适合于规模化生产且经济有效，通过该方法制备的外泌体适合于任何特定的治疗应用。

Description

从iPSC及其衍生物制备用于任何临床用途的外泌体的方法
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，特别涉及从iPSC或iPSC衍生的细胞制备外泌体的方法以及外泌体的用途。
背景技术
间充质干细胞(MSC)是最广泛地用作用于治疗人类疾病的细胞治疗的细胞类型之一。近来，对于MSC的治疗潜力已提出若干机制，包括涉及蛋白/多肽和激素的旁分泌因子，和包装各种分子的外泌体/微泡的转移。间充质干细胞(MSC)的治疗潜力可能很大程度上由包含旁分泌因子的囊泡介导。
已经识别了若干细胞来源的胞外囊泡(EV)通过生物活性脂质、蛋白和RNA的传递作为胞间通讯中的必要信使。EV根据它们的生物起源通常分为3个亚组：(a)外泌体，直径40-150nm，当多泡体与细胞膜融合时，外泌体释放到胞外；(b)微泡，直径150-1000nm，其源于质膜的直接出芽；和最后(c)凋亡小体，其显示宽的尺寸分布(50-2000nm)。外泌体是生物体液中的必要信使并参与若干病理和生理过程。
现今，使用人MSC的诊所和临床试验有几百个，其中极少(如果有)关注这些细胞的体外多能能力，这些细胞归巢到损伤或疾病位点，并分泌免疫调节和营养(再生)的生物活性因子。使用外泌体的一个益处是避开MSC的副作用。外泌体是能够穿透血脑屏障并防止与MSC移植相关的可能的肺栓塞的纳米颗粒。外泌体的知识对于阐明这些囊泡功能的临床应用是很重要的。因此，相信从MSC分离的外泌体将在无细胞疗法应用中具有强潜力。
发明内容
本申请提供了一种用于制备源自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体的方法，包括：
(i)在培养基中培养iPSC或iPSC衍生细胞；
(ii)当细胞达到至少80％融合时获得包含第一上清液和贴壁细胞的细胞培养物，收集第一上清液，用含有胰蛋白酶或胰蛋白酶替代物的培养基处理贴壁细胞；
(iii)收集经处理的细胞并将其添加到第一上清液以获得混合物；
(iv)通过对混合物热激并离心获得第二上清液和细胞沉淀；和
(v)将第二上清液过滤至少一次以获得外泌体。
在一个实施方案中，iPSC或iPSC衍生细胞可以是人类细胞。
在一个实施方案中，iPSC可以由mRNA制备。
在一个实施方案中，iPSC或iPSC衍生细胞可以源自人类自体细胞，例如，神经元细胞、肝细胞、β细胞、诱导的间充质干细胞、肾细胞、血小板、心肌细胞、红细胞等。
在一个实施方案中，iPSC衍生细胞可以包括但不限于造血干细胞(HSC)、血祖细胞、视网膜色素上皮细胞(RPE)、软骨细胞、间充质干细胞(MSC)、胚状体、CD34细胞、造血内皮细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞或其任意混合物。
在一个实施方案中，iPSC衍生细胞可以是间充质干细胞。
在一个实施方案中，可以制备iPSC或由iPSC分化的细胞(即iPSC衍生细胞)以产生期望的外泌体。例如，外泌体可以由自体iPSC产生。外泌体还可以由MSC、HSC、RPE、软骨细胞或其他iPSC衍生细胞产生。在一个替代的实施方案中，同种异体iPSC(和/或其衍生细胞)和/或源自同种异体iPSC的外泌体可以制备和储存用于一大群个体。同种异体iPSC(和/或其衍生细胞)和/或源自iPSC的外泌体可以提前制备以在人们需要它们的时候是准备好的。例如，iPSC和/或iPSC衍生细胞和/或源自iPSC的外泌体可以冻干和储存备用。
在一个实施方案中，iPSC(和/或由其衍生的细胞)和/或源自iPSC的外泌体可以冻干以制造更浓的溶液或组合物。在特定实施方案中，iPSC或由iPSC分化的细胞可以用各种技术(例如CRISPR/Cas9)工程化以上调外泌体中一种或更多种所需蛋白的产生。例如，在特定实施方案中，iPSC(和/或由其衍生的细胞)可以通过CRISPR编辑(例如，CRISPR-Cas9基因组编辑和/或基因转移)以去除、替换和/或编辑一种或更多种基因以引起iPSC和/或其衍生细胞的外泌体中一种或更多种所需蛋白的上调(或增加其可能性)。
在一个实施方案中，可以从血液样品(或其他生物物质样品，例如唾液、血清、组织、颊细胞、通过颊拭子收集的细胞、尿液和/或毛发)产生iPSC，然后(物理和/或数字化)标记、输入库存数据库，并存储在存储库中用于持续和/或将来使用。可以通过已知的方法由iPSC产生MSC、RPE、软骨组织、HSC、血祖细胞、成熟造血细胞和/或其他细胞。
在一个实施方案中，外泌体可以是直径约30nm至约200nm的小的、单层膜的、分泌的细胞器，其与细胞具有相同的拓扑学，并富含选定的蛋白质、脂类、核酸和糖缀合物。
在一个实施方案中，外泌体可以包含不同的货物：蛋白、脂类和/或核酸。这些货物可以被专门分类并包装成外泌体。包装进外泌体的内容物可以是细胞类型特异性的并也受细胞条件影响。与细胞的质膜相比，外泌体富含胆固醇、鞘磷脂、饱和磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。
在一个实施方案中，外泌体可以包含一种或更多种细胞因子，例如EGF、碱性FGF、IL-10、LIF、VEGF、HCF、BMP-4、TNF-α、RANTES、IL-1ra、MIP-2、CXCL1、MCP-1、sICAM-1、GM-CSF和/或G-CSF。
在一个实施方案中，用于制备源自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体的方法，包括以下步骤：
(i)在培养基中培养iPSC或iPSC衍生细胞；
(ii)当细胞达到90％-100％融合时获得包含第一上清液和贴壁细胞的细胞培养物，收集第一上清液，用含有胰蛋白酶或胰蛋白酶替代物的培养基处理贴壁细胞；
(iii)收集经处理的细胞并将其添加到第一上清液以获得混合物；
(iv)通过对混合物热激并离心获得第二上清液和细胞沉淀；和
(v)将第二上清液过滤至少一次以获得外泌体。
在一个实施方案中，步骤(i)中，可以以1×106～1×108个细胞、优选1×107～1×108个细胞、最优选3×107个细胞的初始密度培养iPSC或iPSC衍生细胞。
在一个实施方案中，步骤(i)中，可以在Luvinium Bio Cell条件培养基中培养iPSC或iPSC衍生细胞。
在一个实施方案中，步骤(i)中，iPSC或iPSC衍生细胞可以在37℃、5％CO2和21％O2的培养箱中培养5-10天，优选7天。
在一个实施方案中，步骤(ii)中，可以在细胞达到至少85％融合、至少90％融合、至少95％融合或100％融合时收集第一上清液。
在一个实施方案中，步骤(iv)中，在40℃-60℃水浴中将混合物热激0.5-2小时，优选在45℃-55℃水浴中热激0.5-1.5小时，更优选在约50℃水浴中热激约1小时。
在一个实施方案中，步骤(iv)中，热激后，将混合物在2000-4000rpm下离心30-60min，优选在2500-3500rpm下离心35-50min以获得第二上清液和细胞沉淀，优选在2500-3500rpm下离心35-45min以获得第二上清液和细胞沉淀，更优选地在约3000rpm下离心约40min以获得第二上清液和细胞沉淀。
在一个实施方案中，步骤(v)中，第二上清液可以用0.2-0.5μm滤膜过滤，优选第二上清液可以相继用0.44μm滤膜、0.2μm滤膜和0.2μm过滤柱过滤。
在一个实施方案中，步骤(v)中，第二上清液可以用0.44μm滤膜过滤以获得第一滤液，可以将第一滤液离心以获得第三上清液，第三上清液可以用0.2μm滤膜过滤以获得第二滤液，可以将第二滤液离心以获得第四上清液，第四上清液可以用0.2μm过滤柱过滤以获得第三滤液，可以将第三滤液离心以获得外泌体，任选地，外泌体在PBS中重悬。
在一个实施方案中，步骤(v)中，第二上清液可以用0.44μm滤膜过滤以获得第一滤液，可以将第一滤液在约3000rpm下离心约10min以获得第三上清液，第三上清液可以用0.2μm滤膜过滤以获得第二滤液，可以将第二滤液在约3000rpm下离心约10min以获得第四上清液，第四上清液可以用0.2μm过滤柱过滤以获得第三滤液，可以将第三滤液在约3000rpm下离心约20min以获得细胞沉淀，即外泌体，任选地，外泌体在PBS中重悬。
在一个实施方案中，外泌体可以用Bradford分析进行评价。
在一个实施方案中，外泌体可以在-80℃冷冻。
在一个实施方案中，用于制备源自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体的方法可以包括以下步骤：
(i)在Luvinium Bio Cell条件培养基中以约3×107个细胞的初始密度在37℃、5％CO2和21％O2的培养箱中培养iPSC或iPSC衍生细胞约7天；
(ii)当细胞达到90％-100％融合时获得包含第一上清液和贴壁细胞的细胞培养物，收集第一上清液，用含有Tryple(胰蛋白酶替代物)的培养基(例如Luvinium Bio Cell条件培养基)处理贴壁细胞；
(iii)收集经处理的细胞并将其添加到第一上清液以获得混合物；
(iv)通过将混合物在约50℃水浴中热激约1小时然后在约3000rpm下离心约40min以获得第二上清液和细胞沉淀；和
(v)将第二上清液用0.44μm滤膜过滤以获得第一滤液，将第一滤液离心以获得第三上清液，将第三上清液用0.2μm滤膜过滤以获得第二滤液，将第二滤液离心以获得第四上清液，将第四上清液用0.2μm过滤柱过滤以获得第三滤液，将第三滤液离心以获得外泌体。
本申请还提供了源自iPSC或其他iPSC衍生细胞的外泌体。
本申请还提供了通过前述方法制备的源自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体。
在一个实施方案中，所述源自iPSC或其他iPSC衍生细胞的外泌体可以包含选自以下的一种或更多种组分：细胞因子、miRNA、siRNA、蛋白、有机分子、无机分子和生物元件。
在一个实施方案中，所述源自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体可以包含一种或更多种细胞因子。
在一个实施方案中，所述源自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体可以包含一种或更多种生长因子。
在一个实施方案中，来自iPSC或iPSC衍生细胞的细胞因子可以包括但不限于：碱性FGF、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-1α、IL-2Rα、IL-12、IL-16、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17A、IL-18、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、IP-10、MCP-1(MCAF)、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、TNF-α、TRAIL、M-CSF、TNF-β、嗜酸性粒细胞趋化因子和RANTES。
在一个实施方案中，生长因子可以包括但不限于：(1)外胚层：IGF-I、EGF、FGF、FDFa、FGFb(神经祖细胞)、BMP-4(皮肤祖细胞)；(2)中胚层：VEGF、IL-3、IL-6、IL-11、SCF(造血祖细胞)、TGF-B1、PDGF、PDBFbb、胰岛素(间充质祖细胞)、激活素、Wnt-5a(心脏祖细胞)；(3)内胚层：FGF-10、FGF-7、头蛋白(胰腺祖细胞)、FGF-4、HGF(肝祖细胞)、Wnt-2a、Wnt2b(肺祖细胞)、IGF-I、TGF-β1、KGF、BMP-2和BMP-4。
本申请还提供了一种组合物，其包含来自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体，以及药学上或化妆品学上可接受的载体。
在一个实施方案中，组合物还可以包含治疗性细胞或移植物。
在一个实施方案中，组合物可以是喷雾、乳霜或乳液。
在一个实施方案中，组合物可以内用。
在一个实施方案中，组合物可以是注射剂。
在一个实施方案中，组合物可以是冻干的。
在一个实施方案中，组合物可以包含剂量为30μg-100g的冻干外泌体，例如60μg-50g、60μg-10g、60μg-5g、60μg-1g、60μg-750mg、60μg-600mg、60μg-450mg、60μg-300mg、60μg-150mg、60μg-120mg、60μg-90mg、60μg-60mg、60μg-30mg、60μg-10mg、60μg-9mg、60μg-6mg、60μg-3mg、60μg-1mg、60μg-900μg、60μg-750μg、60μg-600μg、60μg-450μg、60μg-300μg、60μg-240μg、90μg-240μg、120μg-240μg、120μg-180μg或180μg-240μg的冻干外泌体。
在一个实施方案中，组合物可以包含剂量为约30μg、约40μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约110μg、约120μg、约130μg、约140μg、约150μg、约160μg、约170μg、约180μg、约190μg、约200μg、约210μg、约220μg、约230μg、约240μg、约250μg、约260μg、约270μg、约280μg、约290μg、约300μg、约500μg、约1mg、约10mg、约50mg、约100mg、约500mg、约1g、约10g、约50g或约100g的冻干外泌体。
在一个实施方案中，组合物可以制备成预充针。
本申请还提供了一种用于治疗对象中的病症的方法，该方法包括：向对象施用来自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体或包含来自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体的组合物，优选地，该病症是美容学状况或疾病。
本申请还提供了一种用于治疗对象中的病症的方法，该方法包括：施用治疗有效量的来自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体或包含来自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体的组合物。
在一个实施方案中，来自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体或包含来自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体的组合物可以以0.1-2000μg/kg体重的量施用，例如，以0.1-1000μg/kg、0.1-750μg/kg、0.1-500μg/kg、0.1-250μg/kg、0.1-200μg/kg、0.1-100μg/kg、0.1-10μg/kg、0.2-10μg/kg、0.3-10μg/kg、0.4-10μg/kg、0.5-10μg/kg、0.6-10μg/kg、0.7-10μg/kg、0.8-10μg/kg、0.9-10μg/kg、1-10μg/kg、1-9μg/kg、1-8μg/kg、1-7μg/kg、1-6μg/kg、1-5μg/kg、2-5μg/kg、2-4μg/kg、2-3μg/kg或3-4μg/kg体重的量施用。在一个实施方案中，外泌体或组合物以约0.9μg/kg、约1.2μg/kg、约1.5μg/kg、约1.8μg/kg、约2.1μg/kg、约2.4μg/kg、约2.7μg/kg、约3μg/kg、约3.3μg/kg、约3.6μg/kg、约3.9μg/kg、约4.2μg/kg或约4.5μg/kg体重的量施用。
与治疗前对手臂运动几乎没有控制的情况相比，患有帕金森氏病的患者在用本申请的外泌体治疗后感觉到其手臂运动的控制增加了10％。
与治疗前几乎没有腿部知觉相比，脊髓损伤的患者在用本申请的外泌体治疗后开始感觉其腿部知觉增加了10％。
与治疗前身体几乎没有力量相比，患有肌营养不良症的患者在用本申请的外泌体治疗后感觉到其身体的力量增加了20％。
在一个实施方案中，可以将来自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体或包含来自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体的组合物与移植细胞、移植组织或移植器官一起施用。
在一个实施方案中，可以将来自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体或包含来自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体的组合物注射进适于在有其需要的患者中移植的移植组织、合成制剂或其变体中。术语“注入”或“输注”以其广义使用，并且意指通过组合、输注、包被或治疗的任何植入。
在一个实施方案中，该疾病可以选自帕金森氏病、脊髓损伤、肌营养不良症、阿尔茨海默症、糖尿病、肌萎缩性侧索硬化症、白血病、肺病、风湿性疾病、心血管疾病、癌症、关节炎、外伤性脑损伤、中枢神经系统损伤、炎症和病毒感染。
在一个实施方案中，该疾病选自帕金森氏病、脊髓损伤、肌营养不良和病毒感染。
与治疗前对手臂运动几乎没有控制的情况相比，在用本申请的来自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体或包含来自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体的组合物治疗后，患有帕金森氏病的患者感觉到其手臂运动的控制增加了5％、10％、15％、20％或甚至更高。
与治疗前几乎没有腿部知觉相比，在用本申请的来自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体或包含来自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体的组合物治疗后，脊髓损伤的患者开始感觉其腿部知觉增加了5％、10％、15％、20％或甚至更高。
与治疗前身体几乎没有力量相比，在用本申请的来自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体或包含来自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体的组合物治疗后，患有肌营养不良症的患者感觉到其身体的较强力量增加了5％、10％、15％、20％、25％、30％或甚至更高。
在一个实施方案中，病毒感染由冠状病毒引起。
在一个实施方案中，冠状病毒可以选自严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(SARS-CoV)，引起新型冠状病毒疾病-2019(COVID-19)的SARS-CoV-2，或中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒(MERS-CoV)。
在一个实施方案中，冠状病毒可以是SARS-CoV-2。
在一个实施方案中，该方法可以进一步包括向提供iPSC的原始来源的受试者施用源自iPSC或iPSC衍生细胞的组合物。
在一个实施方案中，分离的外泌体也可以被进一步加工以在外泌体中分离或鉴定出具有治疗作用的一个或多个介体分子，特别地，预期的介体包括mRNA、miRNA和各种蛋白质组分(可以是或可以不是膜锚定的蛋白组分)。在这种情况下，介体将被表征并单独使用或与其他治疗剂组合使用以配制成药物组合物。
本申请还提供了本申请的外泌体或组合物在制备用于治疗受试者的病症的药物中的用途，所述病症优选为美容学状况或疾病。
本申请还提供了本发明的外泌体或组合物，其用于治疗受试者的病症，优选所述病症为美容学状况或疾病。
本申请提供了一种从mRNA iPSC及其衍生物中提取高浓度的外泌体用于哺乳动物的任何治疗应用的稳健技术生产方法。该方法不需要进一步的纯化和定量步骤即可产生高百分比的纯净且富集的外泌体。在整个培养过程中未对细胞热激而从mRNA iPSC及其衍生物中提取的外泌体在用于任何临床应用之前均应进行纯化和定量。
从mRNA iPSC及其衍生物培养物中提取的外泌体可以适合任何特定的治疗和再生应用。在第一实例中，外泌体是生产商业上相当数量的、非常纯净并具有用于临床前和临床试验的良好特性的产品的基础。多能细胞具有无限永生性，这意味着它们具有无限的扩张能力，从而无限供应外泌体。这很重要，因为外泌体的无限供应是库存过程和对病人连续供应的关键，而任何其他类型的细胞或组织在细胞分裂过程中都会经历老化过程、凋亡和衰老。该产品是从多能细胞来源开发而来的，能够消除重复寻找、筛选和鉴定新的供体的需要。这将显著降低制造的成本和复杂性。此外，由于所有细胞材料均来自单一供体，因此有望减少批次间的差异性问题。
在科学文献中已经确定，由不同供体细胞和组织产生的外泌体具有显著不同的特性，这很可能导致不可预测的和不一致的临床功效。相反，从iPSC或iPSC衍生细胞制备外泌体的方法实现了批次间的一致性，这有望提高临床结果的可预测性。外泌体通常可以被注入或注射到接受者中，而不会引起或产生个体副作用。然而，在一些临床试验中已经发现来自组织和成熟细胞的外泌体输注。本发明的外泌体是从iPSC或iPSC衍生细胞中制备的，而不是从诸如骨髓、脂肪组织或任何其他细胞类型的主要组织来源中纯化得到的。因此，与对免疫系统具有阳性反应的任何其他来源的细胞类型或组织相比，iPSC细胞中这些外泌体的纯度较高。
附图说明
图1显示了上述制备方法的流程图。
具体实施方式
如本文所用，术语“外泌体”是指大小为数十至数百纳米(优选地为约30至200nm)的囊泡，其由具有与细胞膜相同结构的磷脂双层膜组成(但是，外泌体的粒径是可变的，具体取决于分离出外泌体的细胞类型、分离方法和测量方法(Vasiliy S.Chernyshev等人，“Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes”,AnalBioanal Chem,(2015)，DOI10.1007/s00216-015-8535-3)。这些外泌体包含被称为外泌体货物的蛋白质、核酸(mRNA、miRNA等)等。已知外泌体货物包括广泛的信号转导因子，这些信号转导因子对于细胞类型是特异性的，并且根据分泌细胞的环境而被不同地调节。已知外泌体是细胞分泌的细胞间信号传导介质，通过它们传递的各种细胞信号调节细胞行为，包括靶细胞的活化、生长、迁移、分化、去分化、凋亡和坏死。同时，本文使用的术语“外泌体”旨在包括从干细胞分泌并释放到细胞外空间中并具有纳米尺寸的囊泡结构和与外泌体相似的组成的所有囊泡(例如，外泌体样囊泡)。干细胞不限于其种类，而可以优选是间充质干细胞。但是，本领域中正在使用或将来可能使用的各种外泌体，只要它们具有抗炎作用并且不会对人体造成不良影响，就可以用于本发明。因此，应注意，根据下述实施例的分离方法分离的外泌体应理解为可用于本发明的外泌体的实例，并且本发明不限于此。
在本文中，术语“iPSC衍生物”或“iPSC衍生细胞”可以互换使用，是指由iPSC分化的细胞，其包括但不限于造血干细胞(HSC)、血祖细胞、视网膜色素上皮细胞(RPE)、软骨细胞、间充质干细胞(MSC)、胚状体、CD34细胞、造血内皮细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞或其任意混合物。
如本文所用，术语“施用”药物组合物或药物是指药物组合物或药物的直接和间接施用，其中药物组合物或药物的直接施用通常由医疗保健专业人员(例如，医师，护士等)进行，并且其中间接施用包括将药物组合物或药物提供给医疗保健专业人员或使医疗保健专业人员可获得从而进行直接施用的步骤(例如，通过注射、输注、口服递送、局部递送等)。最优选地，通过皮下或真皮下注射施用细胞或外泌体。然而，在其他预期的方面，施用也可以是静脉内注射。替代地，或另外地，可以从患者的细胞分离或生长抗原呈递细胞，在体外感染，然后输给患者。因此，应当意识到，可以将所预期的系统和方法视为用于高度个性化治疗的完整的药物发现体系(例如，药物发现、治疗方案、验证等)。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指可用于制备通常是安全且无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括兽医学和/或人药学或治疗学用途可接受的载体。术语“载体”或“药学上可接受的载体”可以包括但不限于磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂(例如油/水或水/油乳剂)和/或各种类型的润湿剂。如本文所用和本文进一步所述，术语“载体”包括但不限于任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、脂质、稳定剂或本领域公知的用于药物制剂的其他材料。
如本文所使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“药学上或美容学上可接受的载体”包括两种或更多种这样的载体的混合物，等等。
在本文中，范围可以表示为从“大约”一个特定值和/或到“大约”另一特定值。当表达这样的范围时，另一实施例包括从该一个特定值和/或至该另一特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解的是，特定值形成另一实施例。还将理解，每个范围的端点相对于另一端点都是重要的且独立于另一个端点。还应理解，本文公开了许多值，并且除了该值本身之外，每个值在本文中还被公开为“约”该特定值。例如，如果公开值“10”，则也公开“约10”。还应理解，如本领域技术人员适当理解的那样，当值公开为“小于或等于”该值、“大于或等于该值”时，则也公开了这些值之间的可能范围。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，在整个申请中，以多种不同格式提供数据，并且该数据表示终点和起点以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点15，则应理解，也公开了大于、大于等于、小于、小于等于和等于10和15、以及10和15之间。还应理解，还公开了两个特定单位之间的每个单位。例如，如果公开了10和15，则也公开了11、12、13和14。
如本文所用，诱导多能干细胞(iPSC)是通过诱导一种或多种干细胞特异性基因的表达而产生的非多能细胞(通常是成熟体细胞)的人工衍生干细胞。这样的干细胞特异性基因包括但不限于八聚体转录因子家族，即Oct-3/4；Sox基因家族，即Sox1，Sox2，Sox3，Sox15和Sox 18；Klf基因家族，即Klf1，Klf2，Klf4和Klf5；Myc基因家族，即c-myc和L-myc；Nanog基因家族，即OCT4，NANOG和REX1；或LIN28。iPSC的例子在Takahashi等人(2007)Celladvance online publication 20November 2007；Takahashi&Yamanaka(2006)Cell 126：663-76；Okita等人，(2007)Nature 448：260-262；Yu等人，(2007)Science advance onlinepublication 20November 2007；和Nakagawa等人，(2007)Nat.Biotechnol.Advanceonline publication 30November 2007中有描述。
如本文所用，术语“自体的”指代细胞时，是指分离并注入回同一受试者(受体或宿主)的细胞。“同种异体的”是指非自体的细胞。
MSC的主要营养性质是生长因子和外泌体的分泌以诱导细胞增殖和血管生成。外泌体表达促有丝分裂蛋白，例如转化生长因子-α(TGF-α)、TGF-B、肝细胞生长因子(HGF)、上皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)增加成纤维细胞、上皮和内皮细胞的分裂。释放血管内皮生长因子(VEGF)、IGF-1、EGF和血管生成素-1以募集内皮细胞谱系并启动血管形成。据推测，个体的基因型在这些生长因子的表达和反应中起作用，这为利用遗传匹配的供体和受体的个性化医学的理念提供了依据。关于MSC的抗炎和免疫调节特性，据信在许多类型的肌肉骨骼创伤中，损伤部位的炎性状况阻碍了局部祖细胞和成熟细胞的自然修复过程。
不受理论的束缚，据信MSC通过旁分泌机制辅助并通过抗炎和免疫调节机制调节再生环境。对于白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-12、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)和干扰素-γ(IFN-γ)等炎症分子，MSC分泌在许多类型的免疫细胞中具有复杂的反馈机制的一系列生长因子和抗炎蛋白。关键的免疫调节细胞因子包括前列腺素2、TGF-β1、HGF、SDF-1、一氧化二氮、吲哚胺2、3-双加氧酶、IL-4、IL-6、IL-10、IL-1受体拮抗剂和可溶性肿瘤坏死因子-α受体。MSC阻止许多炎性免疫细胞的增殖和功能，炎性免疫细胞包括T细胞、自然杀伤细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞。尽管跨物种的MSC能够调节T细胞活性，但跨哺乳动物物种的机制并不相同。
根据一个实施方案的药物组合物在制剂中的含量可以根据如上所述的另外的组分的种类、量、形式等适当地选择。例如，基于可注射制剂的总重量，本发明的药物组合物的含量可以为约0.1至99重量％，优选为约10至90重量％。此外，根据疾病的种类，疾病的严重程度，制剂的类型，配制方法，患者的年龄、性别、体重、健康状况、饮食、排泄率，给药期限和给药方案，可以调节根据本发明的一个实施方案的药物组合物的合适剂量。例如，当将根据本发明的一个实施方案的药物组合物施用于成年人时，可以以每天0.001mg/kg至100mg/kg的剂量施用一次至数次。
有益效果
现有的生产用于治疗用途的外泌体的方法的主要缺点是在无需多个供体或注射培养的细胞的情况下，以商业规模实现经济生产的能力。本申请为商业开辟了广泛的治疗和制造可能性。生产过程将确保可以从单一供体中几乎无限量的生产治疗用途的外泌体。这意味着不必不断寻找新的供体来满足其制造需求。这有可能在再生医学和干细胞疗法的新兴领域创建新的标准，并提供独特的差异化因素和重要的竞争地位。
例如，它可以用作任何病毒入侵人体的免疫增强剂。暴露于SARS CoV等新型病毒引起的病毒感染只能通过抗病毒药和疫苗等特定疗法进行治疗。但是，不可能及时开发针对所有可能的威胁因子的疫苗。即使这是可行的，也不希望针对突变速度非常快的RNA病毒(包括新型SARS CoV 2)施用这些疫苗。因此，在人们能够抵抗包括细菌和病毒在内的新型生物战(BW)剂或传染性剂的情况下，需要更广泛的治疗策略。以一种更通用的方法来防止多种BW剂的作用似乎更有效。
先天免疫系统是抵御病原体的第一道防线，包括热核吞噬细胞系统(MPS，包括单核细胞/巨噬细胞，专门的组织巨噬细胞，如树突状细胞和小胶质细胞)。这些细胞会立即对外来入侵者做出反应。相比之下，自适应免疫(AI)系统会学会识别特定的病原体，但需要更长的时间才能抵抗感染。建立宿主感染的主要病毒策略是抑制先天性免疫反应以获得在AI激活之前约2周的有效复制病毒的机会窗口。对于患有癌症和类风湿关节炎的患者，除了常规治疗外，还可以通过免疫调节剂特异性刺激免疫系统。目前正在使用来自各种策略的免疫调节剂。我们建议在暴露于生物战剂(例如SARS CoV 2)之前，可以使用这些外泌体来刺激免疫系统。因此，来自iMSC的外泌体可以使我们的免疫系统做好准备，通过迅速增强先天性免疫来抵抗任何感染。我们将与外泌体一起使用FDA批准的免疫调节剂例如(1型干扰素和微小RNA)。并且，可以开发出包含最有效的加强剂的制剂，优选以鼻喷雾剂的形式供人类使用，这样我们就可以在进入的第一扇门处(即抵抗传染性病毒和细菌的粘膜免疫力和呼吸系统)增强免疫力。
下面参考附图和实施例详细描述本申请的示例性实施例。以下实施例用于描述本申请，而不是限制本申请的范围。
本领域技术人员可以理解，以下步骤的序号并不代表执行顺序的优先级，并且每个步骤的执行顺序可以根据功能和内部逻辑确定，不应对根据本申请的实施方案的实施过程有任何限制。
实施例1：从iPSC-MSC制备外泌体
37℃、5％CO2和21％O2的培养箱中，使mRNA iPSC衍生物iPSC-MSC(可以通过Verma等人，2019，Doi:10.35248/2157-7633/19.9.455中描述的方法生产)以每个T225烧瓶3×107个细胞的密度在Luvinium Bio Cell条件培养基中生长7天，以从细胞中提取高浓度的外泌体。当细胞达到90-100％融合且培养基颜色变为黄色时，将所有黄色培养基收集在50ml的长颈细口瓶无菌试管中。然后在1000rpm下离心细胞后，使用Tryple表达培养基收集细胞，弃去上清液，将细胞加入至上述50ml试管中的黄色上清液中。然后将细胞和黄色上清液于50℃水浴中热激1小时，以3000rpm的速度离心40分钟，以在室温下将细胞或碎片旋转至下方。收集上清液，弃去细胞沉淀。然后，上清液在室温下通过0.44μm的滤膜。将收集的上清液在室温下以3000rpm离心10分钟。然后收集上清液，并在室温下通过0.22μm滤膜。收集滤液后，然后将其在室温下以3000rpm离心10分钟。使上清液通过0.22μm的过滤柱，然后以3000rpm离心20分钟。使用200μl的PBS将细胞沉淀重悬。弃柱并通过Bradford测定法(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)评估纯外泌体的剩余体积，并将等分试样冷冻在-80℃。图1示出了上述制备方法的流程图。
实施例2：临床试验结果
对亚裔的2名帕金森病患者(45岁和50岁，男性)，2名脊髓损伤患者(35岁和38岁，男性)和2名肌营养不良症(15岁和18岁，男性)进行了人体临床试验，为每个个体注射浓度为180μg的从上述iMSC分离的外泌体。临床试验的细节如下：
将冷冻的浓度为180μg的外泌体稀释在500μl生理盐水中，并使用1ml移液器上下运动地轻轻混合均匀。在室温下将500μl溶液放入1ml胰岛素注射器中。然后将其注入100ml生理盐水无菌塑料瓶中。最初，以IV(静脉注射)的方式给每位患者1毫升(20滴)作为测试剂量，并等待20分钟以观察任何重要的变化或反应。如果未观察到变化或反应，然后将输注速度提高至每分钟2ml(40滴)。总输注时间为60分钟(20+40分钟)。肌营养不良患者观察到心率突然升高，然后缓慢输注后心率恢复正常。
每4周对这些患者重复相同的注射过程，持续4个月。这项研究的目的是首先确定没有副作用或没有任何不良反应的患者安全性。与治疗前对手臂运动几乎没有控制的情况相比，患有帕金森氏病的患者在上述治疗后感觉到其手臂运动的控制增加了10％。与治疗前几乎没有腿部知觉相比，脊髓损伤的患者在上述治疗后开始感觉其腿部知觉增加了10％。与治疗前身体几乎没有力量相比，患有肌营养不良症的患者在上述治疗后感觉到其身体的力量增加了20％。
总体而言，连续4个月向患者注射外泌体将对针对所有遗传和神经系统疾病的免疫系统应答产生强烈影响。
前述示例性实施例仅用于描述本申请，而不是限制本申请。本领域普通技术人员可以在不脱离本申请的精神和范围的情况下做出各种改变和修改。因此，所有等同的技术方案均应属于本申请的保护范围，并且本申请的保护范围应以权利要求为准。

Claims (16)

1.一种用于制备源自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体的方法，包括：
(i)在培养基中培养iPSC或iPSC衍生细胞；
(ii)当细胞达到至少80％融合时获得包含第一上清液和贴壁细胞的细胞培养物，收集第一上清液，用含有胰蛋白酶或胰蛋白酶替代物的培养基处理贴壁细胞；
(iii)收集经处理的细胞并将其添加到第一上清液以获得混合物；
(iv)通过对混合物热激并离心获得第二上清液和细胞沉淀；和
(v)将第二上清液过滤至少一次以获得外泌体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述iPSC或iPSC衍生细胞是人类细胞，优选地，所述iPSC或iPSC衍生细胞是人类自体细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述iPSC衍生细胞选自造血干细胞(HSC)、血祖细胞、视网膜色素上皮细胞(RPE)、软骨细胞、间充质干细胞(MSC)或其任意混合物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(ii)中，当细胞达到90％-100％融合时获得细胞培养物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(iv)中，在40℃-60℃水浴中将混合物热激0.5-2小时，优选在约50℃水浴中热激约1小时。
6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤(iv)中，热激后，将混合物在2000-4000rpm下离心30-60min，优选在约3000rpm下离心约40min以获得第二上清液和细胞沉淀。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(v)中，第二上清液可以用0.2-0.5μm滤膜过滤，优选第二上清液可以相继用0.44μm滤膜、0.2μm滤膜和0.2μm过滤柱过滤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中步骤(v)中，第二上清液用0.44μm滤膜过滤以获得第一滤液，将第一滤液离心以获得第三上清液，第三上清液用0.2μm滤膜过滤以获得第二滤液，将第二滤液离心以获得第四上清液，第四上清液用0.2μm过滤柱过滤以获得第三滤液，将第三滤液离心以获得外泌体，任选地，外泌体在PBS中重悬。
9.源自iPSC或iPSC衍生细胞的外泌体，其通过权利要求1-8中任一项所述的方法制备。
10.组合物，其包含权利要求9所述的外泌体和药学上或化妆品学上可接受的载体。
11.权利要求10的组合物，其中所述组合物还包含治疗性细胞或移植物。
12.一种治疗对象中的病症的方法，所述方法包括：向对象施用权利要求9的外泌体或权利要求10或11所述的组合物，优选地所述病症是美容学状况或疾病。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述组合物与移植细胞、移植组织或移植器官一起施用。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述疾病选自帕金森氏病、脊髓损伤、肌营养不良症、阿尔茨海默症、糖尿病、肌萎缩性侧索硬化症、白血病、肺病、风湿性疾病、心血管疾病、癌症、关节炎、外伤性脑损伤、中枢神经系统损伤、炎症和病毒感染。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述疾病选自帕金森氏病、脊髓损伤、肌营养不良和病毒感染。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述病毒感染由冠状病毒引起，所述冠状病毒优选选自严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(SARS-CoV)、引起新型冠状病毒疾病-2019(COVID-19)的SARS-CoV-2、和中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒(MERS-CoV)，更优选为SARS-CoV-2。
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