CN107236701A

CN107236701A - 干细胞外泌体的分离方法

Info

Publication number: CN107236701A
Application number: CN201710447410.4A
Authority: CN
Inventors: 金银鹏; 傅青春; 李洪超; 王俊怡; 王皙; 张苗; 孟玲玉; 王晓今; 陈成伟
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-06-14
Filing date: 2017-06-14
Publication date: 2017-10-10
Anticipated expiration: 2037-06-14
Also published as: CN107236701B

Abstract

本发明涉及一种干细胞外泌体的分离方法，包括如下步骤：采用含血清培养基培养干细胞至细胞密度大于70％，收集干细胞，然后采用不含血清培养基继续培养；收集得到的产物中的培养基，然后过滤，收集滤液；将滤液加入第一浓缩管，离心，得到浓缩液；将浓缩液分装于第二浓缩管，离心；在第二浓缩管中加入缓冲液，再次离心；将再次离心后的第二浓缩管的内管倒置于收集管中，离心，收集管中的液体为含高浓度干细胞外泌体的溶液。本发明提供的干细胞外泌体的分离方法，通过联合运用大小不同的浓缩管，可以实现快速、高效、廉价地提取培养基中的外泌体；并且离心时间较短，可有效减少外泌体的机械性损伤，更好地保留外泌体的活性。

Description

干细胞外泌体的分离方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种干细胞外泌体的分离方法。

背景技术

外泌体(exosome)是由细胞内的多泡体(multivesicular body,MVB)与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种直径约30～150nm的膜性囊泡。很多细胞均能分泌外泌体，如T细胞、B细胞、树突细胞、肥大细胞和肿瘤细胞等。外泌体中包含有多种蛋白质和RNA,在细胞之间起到传通信息和相互调控的作用，而这种传速信息的方式和相互调控的机制并不完全清楚，尤其是在肿瘤细胞之间：外泌体是否将癌细胞的特征信息传速到了癌旁组织，并通过所包含的蛋白促进其癌变；外泌体是否对月中瘤细胞的迁移、增殖以及浸调有影响等。这些急待解决的问题都遇到了一个共同的瓶颈，那就是外泌体的提取与分离。现有技术中的外泌体的分离方法包括：(1)超高速离心或者是密度梯度离心，这种方法有一个限制因素，那就是需要配各超高速高心机，而这种设备的价格是非常昂贵的，因此限制了一些中小型实验室对外泌体的研究；(2)用超滤的方法，单纯的超滤方法收集的外泌体浓度不能达到很高，对于需要较高浓度外泌体的检测与治疗等应用也是一种限制。因此，还需要寻求新型的低成本高效率的分离纯化干细胞外泌体的方法，来克服现有技术中存在的缺陷。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种干细胞外泌体的分离方法，以通过联合运用大小不同的浓缩管，实现快速、高效、廉价地提取培养基中的外泌体；并且离心时间较短，可有效减少外泌体的机械性损伤，更好地保留外泌体的活性。

为实现上述目的，本发明提供了一种干细胞外泌体的分离方法，包括如下步骤：S1：采用含血清培养基培养干细胞至细胞密度大于70％，收集干细胞，然后采用不含血清培养基对干细胞继续培养；S2：除去S1得到的培养体系中的干细胞，然后将剩余组分过滤，收集滤液；S3：将滤液加入第一浓缩管，离心，得到浓缩液；S4：将浓缩液分装于第二浓缩管，离心；然后在第二浓缩管中加入缓冲液，再次离心；S5：将再次离心后的第二浓缩管的内管倒置于收集管中，离心，收集管中的液体为含高浓度干细胞外泌体的溶液。需要说明的是，S4中，缓冲液的体积和第二浓缩管的容积的比值优选为(0.4～0.6):1；本发明采用的干细胞可以是hASCs干细胞。

在本发明的进一步实施方式中，S1中，含血清培养基为含有质量分数为10％的FBS(胎牛血清)的DMEM培养基；不含血清培养基为DMEM培养基；继续培养的时间为23～25h。

在本发明的进一步实施方式中，S2中，过滤为采用0.22μm过滤膜过滤。

在本发明的进一步实施方式中，S3中，第一浓缩管为15mL10KD浓缩管；S4中，第二浓缩管为0.5mL10KD浓缩管。

在本发明的进一步实施方式中，S3中，离心条件为：4℃，3500～4500g离心35～45min；S4中，离心和再次离心的条件均为：常温，15000g离心8～12min；S5中，离心条件为：常温，900～1100g离心1.5～2.5min。需要说明的是，常温是指15～30℃。

在本发明的进一步实施方式中，S4中，缓冲液包括：0.01MPBS缓冲液；其中，PBS缓冲液的pH值为7.2～7.4。

在本发明的进一步实施方式中，S4中，缓冲液还包括：0.05MTris-HCl缓冲液；PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液的体积比为(0.4～0.6):1；其中，Tris-HCl缓冲液的pH值为7.2～7.4。

在本发明的进一步实施方式中，S1中，在继续培养之前还包括对收集的干细胞进行多次洗涤的步骤；其中，洗涤液包括：0.01M PBS缓冲液，PBS缓冲液的pH值为7.2～7.4；多次为2～4次。

在本发明的进一步实施方式中，S1中，在每升洗涤液中，还包括：5～10g EDTA-Na₂、0.5～0.8g聚乙二醇和5～6g乳糖酸。需要说明的是，在实际配制过程中，对于1L洗涤液，可以先加入5～10g EDTA-Na₂、0.5～0.8g聚乙二醇和5～6g乳糖酸，然后加入0.01M PBS缓冲液，直至总体积为1L。

在本发明的进一步实施方式中，S1中，聚乙二醇的数均分子量为7500～8500。

本发明中，采用的hASCs干细胞的分离培养方法包括如下步骤：取年轻健康人体抽脂术后的脂肪组织，PBS液冲洗3遍后剪碎成约1mm³的小块，加入0.1％胶原酶Ⅰ消化30min。配制完全培养基：500ml培养基，10％血清，10ng/ml bFGF，加等体积完全培养基终止消化，1000rpm离心10min。重悬细胞，100μm滤网过滤后按1×10⁶/ml接种于T25细胞培养瓶中，置37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱培养，48小时后换液。观察细胞至90％融合时，0.25％胰酶消化，按1：3传代培养。

本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本发明采用大小不同的浓缩管联合运用，可以实现快速、高效、廉价地提取培养基中的外泌体，且浓度比单纯用超滤法收集的外泌体要高；(2)本发明提供的分离方法的离心时间比超速离心时间短，可有效减少外泌体的机械性损伤，更好地保留外泌体的活性；(3)本发明采用的浓缩管可以重复使用，分离方法简单，综合起来成本更低。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例一中分离得到的hASCs在显微镜下观察到的形态图；

图2为本发明实施例一中hADSCs的表面标记CD90在流式细胞仪检测下的结果图；

图3为本发明实施例一中hADSCs的表面标记CD44在流式细胞仪检测下的结果图；

图4为本发明实施例一中hADSCs的表面标记CD105在流式细胞仪检测下的结果图；

图5为本发明实施例一中hADSCs的表面标记CD73在流式细胞仪检测下的结果图；

图6为本发明实施例一中hADSCs的表面标记CD73+CD105+在流式细胞仪检测下的结果图；

图7为本发明实施例一中hADSCs的表面标记CD34-CD45-CD11b-CD19-HLA-DR-在流式细胞仪检测下的结果图；

图8为本发明实施例五中分离得到含高浓度hASCs干细胞外泌体的溶液中hASCs外泌体在扫描电镜下观察到的形态图；

图9为本发明实施例五中分离得到含高浓度hASCs干细胞外泌体的溶液中hASCs外泌体的粒径分布图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

实施例一：hASCs干细胞的分离、培养

实验方法：取年轻健康人体抽脂术后的脂肪组织，PBS液冲洗3遍后剪碎成约1mm³的小块，加入0.1％胶原酶Ⅰ消化30min。配制完全培养基：500ml培养基，10％血清，10ng/mlbFGF，加等体积完全培养基终止消化，1000rpm离心10min。重悬细胞，100μm滤网过滤后按1×10⁶/ml接种于T25细胞培养瓶中，置37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱培养，48小时后换液。观察细胞至90％融合时，0.25％胰酶消化，按1：3传代培养。

流式细胞仪检测hASCs表面分子标记：CD44、CD73、CD90、CD105。

实验结果：将分离得到的hASCs在P2代以后细胞维持成纤维样形态，大小均一且排列紧密，呈漩涡状或放射状生长(具体见图1)。

流式细胞仪检测结果显示超过95％的细胞表面表达CD73(100％)、CD44(100％)、CD90(99.8％)、CD105(97.6％)呈阳性，而造血细胞系分子标记物CD34、CD45、CD19等呈阴性表达的细胞占97.8％(具体如图2-图7所示)，证实分离得到的hASCs为标准的间充质干细胞。

下面将实施例一分离得到的hASCs继续培养，然后提取hASCs外泌体，具体如实施例二至实施例七。

实施例二

本实施例提供一种干细胞外泌体的分离方法，包括如下步骤：

S1：采用含血清培养基培养干细胞至细胞密度80％，收集干细胞；采用洗涤液洗涤干细胞3次，然后采用不含血清培养基继续培养干细胞24h；其中，含血清培养基为含有质量分数为10％的FBS的DMEM培养基；不含血清培养基为DMEM培养基；洗涤液包括：0.01M PBS缓冲液，PBS缓冲液的pH值为7.2；

S2：除去S1得到的培养体系中的干细胞，然后将剩余组分采用0.22μm过滤膜过滤，收集滤液；

S3：将滤液加入15mL10KD浓缩管(第一浓缩管)，4℃、4000g离心40min，得到浓缩液；

S4：将浓缩液分装于0.5mL10KD浓缩管(第二浓缩管)，常温、15000g离心10min；在第二浓缩管中加入缓冲液，再次常温、15000g离心10min；其中，缓冲液包括：0.01MPBS缓冲液，PBS缓冲液的pH值为7.2；

S5：将S4中再次离心后的0.5mL10KD浓缩管(第二浓缩管)的内管倒置于收集管中，常温、1000g离心2min，收集管中的液体为含高浓度干细胞外泌体的溶液。

实施例三

S1：采用含血清培养基培养干细胞至细胞密度为70％，收集干细胞；采用洗涤液洗涤干细胞2次，然后采用不含血清培养基继续培养干细胞23h；其中，含血清培养基为含有质量分数为10％的FBS的DMEM培养基；不含血清培养基为DMEM培养基；洗涤液包括：0.01M PBS缓冲液，PBS缓冲液的pH值为7.2；

S3：将滤液加入15mL10KD浓缩管(第一浓缩管)，4℃、3500g离心35min，得到浓缩液；

S4：将浓缩液分装于0.5mL10KD浓缩管(第二浓缩管)，常温、15000g离心8min；在第二浓缩管中加入缓冲液，再次常温、15000g离心8min；其中，缓冲液包括：0.01MPBS缓冲液，PBS缓冲液的pH值为7.2；

S5：将S4中再次离心后的0.5mL10KD浓缩管(第二浓缩管)的内管倒置于收集管中，常温、900g离心1.5min，收集管中的液体为含高浓度干细胞外泌体的溶液。

实施例四

S1：采用含血清培养基培养干细胞至细胞密度为90％，收集干细胞；采用洗涤液洗涤干细胞4次，然后采用不含血清培养基继续培养干细胞25h；其中，含血清培养基为含有质量分数为10％的FBS的DMEM培养基；不含血清培养基为DMEM培养基；洗涤液包括：0.01M PBS缓冲液，PBS缓冲液的pH值为7.4；

S3：将滤液加入15mL10KD浓缩管(第一浓缩管)，4℃、4500g离心45min，得到浓缩液；

S4：将浓缩液分装于0.5mL10KD浓缩管(第二浓缩管)，常温、15000g离心12min；在第二浓缩管中加入缓冲液，再次常温、15000g离心12min；其中，缓冲液包括：0.01MPBS缓冲液，PBS缓冲液的pH值为7.4；

S5：将S4中再次离心后的0.5mL10KD浓缩管(第二浓缩管)的内管倒置于收集管中，常温、1100g离心2.5min，收集管中的液体为含高浓度干细胞外泌体的溶液。

实施例五

S1：采用含血清培养基培养干细胞至细胞密度80％，收集干细胞；采用洗涤液洗涤干细胞3次，然后采用不含血清培养基继续培养干细胞24h；其中，含血清培养基为含有质量分数为10％的FBS的DMEM培养基；不含血清培养基为DMEM培养基；每升洗涤液包括：8gEDTA-Na₂、0.65g数均分子量为8000的聚乙二醇、5.5g乳糖酸，余量为0.01M PBS缓冲液，PBS缓冲液的pH值为7.2；

S4：将浓缩液分装于0.5mL10KD浓缩管(第二浓缩管)，常温、15000g离心10min；在第二浓缩管中加入缓冲液，再次常温、15000g离心10min；其中，缓冲液包括：0.01MPBS缓冲液和0.05MTris-HCl缓冲液；PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液的体积比为0.5:1，PBS缓冲液的pH值为7.2，Tris-HCl缓冲液的pH值为7.2；

实施例六

S1：采用含血清培养基培养干细胞至细胞密度为70％，收集干细胞；采用洗涤液洗涤干细胞2次，然后采用不含血清培养基继续培养干细胞23h；其中，含血清培养基为含有质量分数为10％的FBS的DMEM培养基；不含血清培养基为DMEM培养基；每升洗涤液包括：5gEDTA-Na₂、0.5g数均分子量为7500的聚乙二醇、5g乳糖酸，余量为0.01M PBS缓冲液，PBS缓冲液的pH值为7.2；

S4：将浓缩液分装于0.5mL10KD浓缩管(第二浓缩管)，常温、15000g离心8min；在第二浓缩管中加入缓冲液，再次常温、15000g离心8min；其中，

ON17-P11856缓冲液包括：0.01MPBS缓冲液和0.05MTris-HCl缓冲液；PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液的体积比为0.4:1，PBS缓冲液的pH值为7.2，Tris-HCl缓冲液的pH值为7.2；

实施例七

S1：采用含血清培养基培养干细胞至细胞密度为90％，收集干细胞；采用洗涤液洗涤干细胞4次，然后采用不含血清培养基继续培养干细胞25h；其中，含血清培养基为含有质量分数为10％的FBS的DMEM培养基；不含血清培养基为DMEM培养基；每升洗涤液包括：10gEDTA-Na₂、0.8g数均分子量为8500的聚乙二醇、6g乳糖酸，余量为0.01M PBS缓冲液，PBS缓冲液的pH值为7.4；

S4：将浓缩液分装于0.5mL10KD浓缩管(第二浓缩管)，常温、15000g离心12min；在第二浓缩管中加入缓冲液，再次常温、15000g离心12min；其中，缓冲液包括：0.01MPBS缓冲液和0.05MTris-HCl缓冲液；PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液的体积比为0.6:1，PBS缓冲液的pH值为7.4，Tris-HCl缓冲液的pH值为7.4；

将本发明实施例二至实施例七分离得到的含高浓度干细胞外泌体的溶液进行测定。

1、BCA蛋白浓度测定：

根据BCA蛋白浓度测定试剂盒，将实施例二至实施例七分离得到的含高浓度干细胞外泌体的溶液进行蛋白测定：首先，配置工作液：BCA：Cu＝50:1，然后，稀释标准品，按多浓度梯度接种于96孔(制备标准曲线)，然后将样品多梯度稀释，接种于96孔板，每孔另加200微升BCA工作液，于37℃放置15-30mins，最后酶标仪测定A562nm。根据标准曲线和样品数据算出蛋白浓度。以实施例二测定得到的蛋白浓度为100％，表征其他组别的相对蛋白浓度。

表1不同组别的样品的相对蛋白浓度

2、治疗急性肝衰竭大鼠模型的情况

实验方法：

(1)造模

取雄性SD大鼠100只，耳钉标记并称量每只实验大鼠体重，以0.8g/kg体重计算D-gal用量。电子天平称量D-gal粉末l0g，加入90ml生理盐水中充分溶解，以lmol/L的NaOH溶液调节其pH值至7.0。100ml容量瓶定容后转入试管备用，D-gal终浓度为0.1g/μL。用一次性5ml注射器，以0.8g/kg体重给药剂量向大鼠腹腔内注射D-gal。注射点取两侧腹股沟区以上1cm范围，局部酒精棉球消毒，注射器针头与皮肤呈45度方向刺入，穿过腹肌刺入腹腔，有落空感即进入腹膜腔，回抽无血液、肠液、尿液后缓慢注入药物。记录每只大鼠的耳钉编号、体重、给药剂量及给药时间，间隔12h后再次注射一次。给药后自由进食和饮水。经腹腔注射D-gal造模后大鼠出现精神萎靡、嗜睡、反应迟钝、行为异常、尿黄等症状。

(2)经股静脉分别注射本发明实施例二至实施例七分离得到的含高浓度干细胞外泌体的溶液

1)大鼠的固定与手术区域消毒

在急性肝衰竭动物模型建造后第2天，将SD大鼠随机分为8组，即低浓度实施例一组、实施例二组、实施例三组，实施例四组、实施例五组、实施例六组、hASCs组以及PBS对照组，每组10只。术前使用大鼠固定器将大鼠固定在超净操作台上，取仰卧位，标记手术部位，以手术部位为中心周围5cm区域用碘伏消毒。

2)手术过程

手术操作过程严格遵守无菌操作原则，于超净台上取左侧髂窝皮肤作一斜行切口，暴露出股静脉，使用一次性1ml注射器，接30G 1/2针头，实施例一组、实施例二组、实施例三组，实施例四组、实施例五组、实施例六组分别经股静脉注射相应组分离得到的含高浓度干细胞外泌体的溶液100μg/只，hASCs组注射细胞数为2×10⁶个，PBS对照组注射PBS100μg/只。注射后以75％酒精棉球压迫止血，待出血停止后缝合伤口。

3)术后预防感染

术后在大鼠伤口处涂抹双抗防止感染，并分成5只一笼饲养，避免大鼠相互撕咬增加手术部位感染机会。

4)术后观察项目

观察统计每组大鼠的生存率及生活状态，每天观察记录实验大鼠体重、活动、进食、尿液、毛色、肌力、对刺激的反应等一般情况，有无脱毛、皮疹、厌食、腹泻、嗜睡、昏迷等症状。

实验结果：PBS对照组当日即出现大鼠死亡，该组大鼠精神异常萎靡，嗜睡、拒绝进食、毛蓬松杂乱，连续3天不断出现死亡，该组大鼠总体生存率仅为20％；实施例二组、实施例三组，实施例四组从第3日开始出现死亡，120h后未再出现死亡情况，具体每组的存活率情况如下表2所示。

表2各组大鼠的生存率统计表

组别	实施例二	实施例三	实施例四	实施例五
					存活率	70％	70％	70％	100％
组别	实施例六	实施例七	hASCs组	PBS对照组
					存活率	100％	100％	40％	20％

3、扫描电镜观察：

实验方法：滴1滴约10μg外泌体液(实施例五制备得到的含高浓度干细胞外泌体的溶液)滴于封口膜上，用镊子取1个碳支持膜铜网盖在液滴上5min，然后滴1滴2％磷钨酸染液与封口膜上，然后用镊子将铜网从外泌体液滴移到磷钨酸液滴上，染色3min，用滤纸吸干液体，至于白炽灯下烤干，用透射电镜观察并拍照。

实验结果：本发明实施例五制备得到的含高浓度干细胞外泌体的溶液中，hASCs外泌体呈均一大小的圆杯形态，大小约在30～200nm之间，具体如图8所示。

4、Nanosight粒度仪检测：

实验方法：打开NS300软件，将1mL实施例五制备得到的含高浓度干细胞外泌体的溶液样品注射入样品槽，注满为止，调整软件参数使视频清晰，点开软件中的RUN键，收集数据。

实验结果：利用Nanosight粒度仪检测收集的hASCs外泌体，可以看到hASCs外泌体的尺寸、浓度以及对应的强度等，粒径大小如图9所示，大多数外泌体均处于30～200nm间；此外，利用粒度仪还可以捕捉到hASCs外泌体在液体中的布朗运动，如图9所示。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

Claims

1.一种干细胞外泌体的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：采用含血清培养基培养干细胞至细胞密度大于70％，收集干细胞，然后采用不含血清培养基对所述干细胞继续培养；

S2：除去所述S1得到的培养体系中的干细胞，然后将剩余组分过滤，收集滤液；

S3：将所述滤液加入第一浓缩管，离心，得到浓缩液；

S4：将所述浓缩液分装于第二浓缩管，离心；然后在所述第二浓缩管中加入缓冲液，再次离心；

S5：将所述再次离心后的第二浓缩管的内管倒置于收集管中，离心，所述收集管中的液体为含高浓度干细胞外泌体的溶液。

2.根据权利要求1所述的干细胞外泌体的分离方法，其特征在于：

所述S1中，所述含血清培养基为含有质量分数为10％的胎牛血清的DMEM培养基；所述不含血清培养基为DMEM培养基；所述继续培养的时间为23～25h。

3.根据权利要求1所述的干细胞外泌体的分离方法，其特征在于：

所述S2中，所述过滤为采用0.22μm过滤膜过滤。

4.根据权利要求1所述的干细胞外泌体的分离方法，其特征在于：

所述S3中，所述第一浓缩管为15mL10KD浓缩管；

所述S4中，所述第二浓缩管为0.5mL10KD浓缩管。

5.根据权利要求1所述的干细胞外泌体的分离方法，其特征在于：

所述S3中，所述离心条件为：4℃，3500～4500g离心35～45min；

所述S4中，所述离心和所述再次离心的条件均为：常温，15000g离心8～12min；

所述S5中，所述离心条件为：常温，900～1100g离心1.5～2.5min。

6.根据权利要求1所述的干细胞外泌体的分离方法，其特征在于：

所述S4中，所述缓冲液包括：0.01M PBS缓冲液；其中，所述PBS缓冲液的pH值为7.2～7.4。

7.根据权利要求6所述的干细胞外泌体的分离方法，其特征在于：

所述S4中，所述缓冲液还包括：0.05MTris-HCl缓冲液；所述PBS缓冲液和所述Tris-HCl缓冲液的体积比为(0.4～0.6):1；其中，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.2～7.4。

8.根据权利要求1所述的干细胞外泌体的分离方法，其特征在于：

所述S1中，在所述继续培养之前还包括对收集的干细胞进行多次洗涤的步骤；

其中，所述洗涤液包括：0.01M PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的pH值为7.2～7.4；所述多次为2～4次。

9.根据权利要求8所述的干细胞外泌体的分离方法，其特征在于：

所述S1中，在每升所述洗涤液中，还包括：5～10g EDTA-Na₂、0.5～0.8g聚乙二醇和5～6g乳糖酸。

10.根据权利要求9所述的干细胞外泌体的分离方法，其特征在于：

所述S1中，所述聚乙二醇的数均分子量为7500～8500。