CN113181177A - 去氢骆驼蓬碱衍生物在制备治疗或预防囊型包虫病药物中的应用 - Google Patents

去氢骆驼蓬碱衍生物在制备治疗或预防囊型包虫病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及去氢骆驼蓬碱衍生物的应用技术领域，是一种去氢骆驼蓬碱衍生物在制备治疗或预防囊型包虫病药物中的应用。本发明中，通过体外药效学实验数据表明去氢骆驼蓬碱衍生物1和2能够显著降低细粒棘球蚴的存活率，作用强于去氢骆驼蓬碱以及前期得到的去氢骆驼蓬碱衍生物3和4(详见专利201610405774.1)；体内药效学实验数据表明口服去氢骆驼蓬碱衍生物1和2抗囊型包虫病疗效优于阿苯达唑、去氢骆驼蓬碱以及前期得到的去氢骆驼蓬碱衍生物3和4(详见专利201610405774.1)；安全性评价实验数据表明去氢骆驼蓬碱衍生物1和2的毒性小于去氢骆驼蓬碱，从而为囊型包虫病的治疗和预防提供了一种新的选择。

Description

去氢骆驼蓬碱衍生物在制备治疗或预防囊型包虫病药物中的 应用
技术领域
本发明涉及去氢骆驼蓬碱衍生物的应用技术领域，是一种去氢骆驼蓬碱衍生物在制备治疗或预防 囊型包虫病药物中的应用。
背景技术
包虫病(Echinococcosis)是由棘球绦虫寄生于人体和动物脏器内引起的一种严重的人兽共患寄 生虫病，呈世界性分布，现已成为全球性的公共卫生问题。而我国西部七省区(新疆、青海、宁夏、 甘肃、西藏、四川、内蒙古)为高流行区，受威胁的人口达6600万，每年对经济造成的损失逾30亿 元，且呈逐年上升的趋势，是西部农、牧民“因病致贫，因病返贫”的主要原因之一。
目前包虫病的治疗手段主要有手术治疗、药物治疗及免疫预防治疗等，临床首选治疗途径仍是手 术切除病灶。为预防术后复发，常常辅以药物治疗。阿苯达唑和甲苯达唑被认为是对囊型包虫病最有 效的治疗药物，并得到了广泛的应用。但由于此类药物溶解性差，脂水分配系数小，跨膜转运速度慢 等，导致口服后吸收差、生物利用度低、个体差异大，且长期服用易产生副作用，因此寻找新的药物 或治疗方式对包虫病的防治具有重要的意义。
骆驼蓬(Pegnum hrmlL.)为蒺藜科(Zygophyllcee)多年生草本植物，主要分布在地中海中部、 中亚、北非和中东等荒漠、沙质、干旱草地等地带，我国主要分布在新疆、甘肃、青海、宁夏、内蒙 古和陕西等地区。骆驼蓬是维吾尔族、蒙古族民间沿用已久的药材，已被列入卫生部药品标准维吾尔 药分册。骆驼蓬植物的主要化学成分为生物碱(约4％至6％)，主要为骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱。大量 文献报道，去氢骆驼蓬碱均具有一定的抗包虫作用，是一种具有开发潜力的化合物。然而，在研究中 发现，去氢骆驼蓬碱具有较大的毒性作用，主要表现为神经系统症状、体温升高及心血管系统失调等。 故使其未能进一步开发并应用到临床。
减小去氢骆驼蓬碱毒性，提高其药效，去氢骆驼蓬碱衍生物合成工作成为研究热点。
发明内容
本发明提供了一种去氢骆驼蓬碱衍生物在制备治疗或预防囊型包虫病药物中的应用，克服了上述 现有技术之不足，其能有效解决现有去氢骆驼蓬碱存在毒性较大、药效有待于进一步提高的问题。
本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种去氢骆驼蓬碱衍生物在制备治疗或预防囊型包 虫病药物中的应用，去氢骆驼蓬碱衍生物的结构通式为：
Figure BDA0002875356120000011
其中，R1是选自氢、C1-4烷基、取代或非取代的五元芳基或六元芳基、取代或非取代的含有1个至 4个选自N或O或S的杂原子的五元杂芳基或六元杂芳基中的一种；R3选自氢、NH2，-CO-(CH2)f-取代 或非取代的五或六元芳基并且f选自1至6的整数、-CO-(CH2)f－取代或非取代的含有1至4个选自 N,O或S的杂原子的五或六元杂芳基；羧基、-COONH2、-COO-取代或非取代的C1-10直链或支链烷 基、-COO-取代或非取代的五或六元芳基、-COO-取代或非取代的含有1至4个选自N,O或S的杂原 子的五或六元杂芳基，-COO-(CH2)f-取代或非取代的五或六元芳基并且f选自1-6的整数、-COO-(CH2)f－取代或非取代的含有1至4个选自N,O或S的杂原子的五或六元杂芳基；R9是选自氢、C1－6烷基、 羟基-C1-6烷基、吡啶基-C1－6烷基中的一种。
下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：
上述取代或非取代的五元芳基或六元芳基上的取代基选自羟基、氨基、羧基、卤素、硝基、C1－6烷基和C1－6烷氧基中的一种。
上述去氢骆驼蓬碱衍生物1为9-丁基-1-甲基-N-(2-羟基)乙基-β-咔啉-3-甲酰胺，其结构式为：
Figure BDA0002875356120000021
上述去氢骆驼蓬碱衍生物2为1-甲基-9-(3-吡啶)甲基-β-咔啉，其结构式为：
Figure BDA0002875356120000022
本发明中，通过体外药效学实验数据表明去氢骆驼蓬碱衍生物1和2能够显著降低细粒棘球蚴的 存活率，作用强于去氢骆驼蓬碱以及前期得到的去氢骆驼蓬碱衍生物3和4(详见专利 201610405774.1)；体内药效学实验数据表明口服去氢骆驼蓬碱衍生物1和2抗囊型包虫病疗效优于阿 苯达唑、去氢骆驼蓬碱以及前期得到的去氢骆驼蓬碱衍生物3和4(详见专利201610405774.1)；安全 性评价实验数据表明去氢骆驼蓬碱衍生物1和2的毒性小于去氢骆驼蓬碱，从而为囊型包虫病的治疗 和预防提供了一种新的选择。
附图说明
附图1为本发明中阴性组细粒棘球蚴的伊红染色图。
附图2为本发明中细粒棘球蚴经去氢骆驼蓬碱体外干预的伊红染色图。
附图3为本发明中细粒棘球蚴经去氢骆驼蓬碱衍生物1体外干预的伊红染色图。
附图4为本发明中细粒棘球蚴经去氢骆驼蓬碱衍生物2体外干预的伊红染色图。
附图5为本发明中细粒棘球蚴经去氢骆驼蓬碱衍生物3体外干预的伊红染色图。
附图6为本发明中细粒棘球蚴经去氢骆驼蓬碱衍生物4体外干预的伊红染色图。
附图7为本发明中模型组对细粒棘球蚴感染干预的肝脏病理图(HE，200×)。
附图8为本发明中阿苯达唑组对细粒棘球蚴感染干预的肝脏病理图(HE，200×)。
附图9为本发明中去氢骆驼蓬碱组对细粒棘球蚴感染干预的肝脏病理图(HE，200×)。
附图10为本发明中去氢骆驼蓬碱衍生物1中剂量组对细粒棘球蚴感染干预肝脏病理图(HE，200 ×)。
附图11为本发明中去氢骆驼蓬碱衍生物1高剂量组对细粒棘球蚴感染干预肝脏病理图(HE，200 ×)。
附图12为本发明中去氢骆驼蓬碱衍生物2中剂量组对细粒棘球蚴感染干预肝脏病理图(HE，200 ×)。
附图13为本发明中去氢骆驼蓬碱衍生物2高剂量组对细粒棘球蚴感染干预肝脏病理图(HE，200 ×)。
附图14为本发明中模型组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡病理图(HE，200×)。
附图15为本发明中阿苯达唑组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡病理图(HE，200×)。
附图16为去氢骆驼蓬碱高剂量组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡病理图(HE，200×)。
附图17为本发明中去氢骆驼蓬碱衍生物1中剂量组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡病理图(HE，200 ×)。
附图18为本发明中去氢骆驼蓬碱衍生物1高剂量组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡病理图(HE，200 ×)。
附图19为本发明中去氢骆驼蓬碱衍生物2中剂量组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡病理图(HE，200 ×)。
附图20为本发明中去氢骆驼蓬碱衍生物2高剂量组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡病理图(HE，200 ×)。
附图21为本发明中模型组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡透射电镜图(10000×，5000×)。
附图22为本发明中阿苯达唑组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡透射电镜图(10000×，5000×)。
附图23为去氢骆驼蓬碱组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡透射电镜图(10000×，5000×)。
附图24为本发明中去氢骆驼蓬碱衍生物1中剂量组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡透射电镜图 (10000×，5000×)。
附图25为本发明中去氢骆驼蓬碱衍生物1高剂量组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡透射电镜图 (10000×，5000×)。
附图26为本发明中去氢骆驼蓬碱衍生物2中剂量组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡透射电镜图 (10000×，5000×)。
附图27为本发明中去氢骆驼蓬碱衍生物2高剂量组对细粒棘球蚴感染干预的囊泡透射电镜图(10000×，5000×)。
附图28为本发明中空白组健康小鼠的肝脏HE染色病理图(200×)。
附图29为本发明中ABZ组健康小鼠的肝脏HE染色病理图(200×)。
附图30为本发明中去氢骆驼蓬碱组健康小鼠的肝脏HE染色病理图(200×)。
附图31为本发明中去氢骆驼蓬碱衍生物1高剂量组健康小鼠的肝脏HE染色病理图(200×)。
附图32为本发明中去氢骆驼蓬碱衍生物2高剂量组健康小鼠的肝脏HE染色病理图(200×)。
附图33为本发明中空白组健康小鼠的脑HE染色病理图(200×)。
附图34为本发明中ABZ组健康小鼠的脑HE染色病理图(200×)。
附图35为本发明中去氢骆驼蓬碱组健康小鼠的脑HE染色病理图(200×)。
附图36为本发明中去氢骆驼蓬碱衍生物1高剂量组健康小鼠的脑HE染色病理图(200×)。
附图37为本发明中去氢骆驼蓬碱衍生物2高剂量组健康小鼠的脑HE染色病理图(200×)。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本 发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用 品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量百分数；本发明中的溶液若没有特殊说明，均为溶 剂为水的水溶液，例如，盐酸溶液即为盐酸水溶液；本发明中的常温、室温一般指15℃到25℃的温度， 一般定义为25℃。
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：该去氢骆驼蓬碱衍生物在制备治疗或预防囊型包虫病药物中的应用，去氢骆驼蓬碱衍 生物的结构通式为：
Figure BDA0002875356120000041
其中，R1是选自氢、C1-4烷基、取代或非取代的五元芳基或六元芳基、取代 或非取代的含有1个至4个选自N或O或S的杂原子的五元杂芳基或六元杂芳基中的一种；R3选自氢、 NH2，-CO-(CH2)f-取代或非取代的五或六元芳基并且f选自1至6的整数、-CO-(CH2)f－取代或非取 代的含有1至4个选自N,O或S的杂原子的五或六元杂芳基；羧基、-COONH2、-COO-取代或非取代 的C1-10直链或支链烷基、-COO-取代或非取代的五或六元芳基、-COO-取代或非取代的含有1至4个 选自N,O或S的杂原子的五或六元杂芳基，-COO-(CH2)f-取代或非取代的五或六元芳基并且f选自 1-6的整数、-COO-(CH2)f－取代或非取代的含有1至4个选自N,O或S的杂原子的五或六元杂芳基； R9是选自氢、C1－6烷基、羟基-C1-6烷基、吡啶基-C1－6烷基中的一种。
实施例2：作为上述实施例的优化，取代或非取代的五元芳基或六元芳基上的取代基选自羟基、 氨基、羧基、卤素、硝基、C1－6烷基和C1－6烷氧基中的一种。
实施例3：作为上述实施例的优化，去氢骆驼蓬碱衍生物1为9-丁基-1-甲基-N-(2-羟基)乙基- β-咔啉-3-甲酰胺，其结构式为：
Figure BDA0002875356120000051
实施例4：作为上述实施例的优化，去氢骆驼蓬碱衍生物2为1-甲基-9-(3-吡啶)甲基-β-咔啉， 其结构式为：
Figure BDA0002875356120000052
下面为根据本发明上述实施例所述的去氢骆驼蓬碱衍生物作为制备治疗囊型包虫病药物的应用的 具体药理实验。
在实验中，所用对照药物去氢骆驼蓬碱衍生物3为1-(4-甲氧基)苯基-9-丁基-β-咔啉，去氢骆 驼蓬碱衍生物4为1-(2-氯)苯基-9-丁基-β-咔啉，详见专利201610405774.1。
Figure BDA0002875356120000053
一、去氢骆驼蓬碱衍生物体外抗包虫活性筛选
1.实验分组
本次实验共分32组，分别为去氢骆驼蓬碱组1、去氢骆驼蓬碱组2、去氢骆驼蓬碱组3、去氢骆驼蓬 碱组4、去氢骆驼蓬碱组5、去氢骆驼蓬碱组6、衍生物1干预组1、衍生物1干预组2、衍生物1干预组3、 衍生物1干预组4、衍生物1干预组5、衍生物1干预组6、衍生物2干预组1、衍生物2干预组2、衍生物2 干预组3、衍生物2干预组4、衍生物2干预组5、衍生物2干预组6、衍生物3干预组1、衍生物3干预组2、 衍生物3干预组3、衍生物3干预组4、衍生物3干预组5、衍生物3干预组6、衍生物4干预组1、衍生物4 干预组2、衍生物4干预组3、衍生物4干预组4、衍生物4干预组5、衍生物4干预组6、阴性组和DMSO组； 每组3个副孔；试验周期为48h。
2.母液配置
分别称取去氢骆驼蓬碱、衍生物1、衍生物2、衍生物3和衍生物4各2.00mg溶于400μL DMSO中得到 5mg/mL的母液①；将母液①用DMSO稀释2倍后得到2.5mg/mL的母液②；将母液②用DMSO稀释2倍后得到 1.25mg/mL的母液③；将母液③用DMSO稀释2倍后得到0.625mg/mL的母液④；将母液④用DMSO稀释2 倍后得到0.3125mg/mL的母液⑤；将母液⑤用DMSO稀释2倍后得到0.15625mg/mL的母液⑥。
3.细粒棘球蚴的制备
从新疆乌鲁木齐屠宰场采集自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏，用75％酒精进行表面消毒，用一次性 注射器轻插入肝脏包囊内抽取囊液，移入50mL离心管中，静置使原头蚴自然沉淀。在无菌条件下，用 含1％双抗(青链霉素)的无菌PBS清洗原头蚴3次至5次，然后加入1％(质量百分比)胃蛋白酶(pH2.0)， 37℃消化30min，再用无菌PBS清洗20次左右，加入RPMI1640培养基，培养备用。
4.体外加药干预
取细粒棘球蚴培养液分别加入96孔培养板上，每孔加198μL，然后分别加入2μL去氢骆驼蓬碱 母液①成为去氢骆驼蓬碱干预组1(50μg/mL)、2μL去氢骆驼蓬碱母液②成为去氢骆驼蓬碱干预组2 (25μg/mL)、2μL去氢骆驼蓬碱母液③成为去氢骆驼蓬碱干预组3(12.5μg/mL)、2μL去氢骆驼 蓬碱母液④成为去氢骆驼蓬碱干预组4(6.25μg/mL)、2μL去氢骆驼蓬碱母液⑤成为去氢骆驼蓬碱干 预组5(3.125μg/mL)、2μL去氢骆驼蓬碱母液⑥成为去氢骆驼蓬碱干预组6(1.5625μg/mL)；分别 加入2μL衍生物1母液①成为衍生物1干预组1(50μg/mL)、2μL衍生物1母液②成为衍生物1干 预组2(25μg/mL)、2μL衍生物1母液③成为衍生物1干预组3(12.5μg/mL)、2μL衍生物1母液 ④成为衍生物1干预组4(6.25μg/mL)、2μL衍生物1母液⑤成为衍生物1干预组5(3.125μg/mL)、 2μL衍生物1母液⑥成为衍生物1干预组6(1.5625μg/mL)；分别加入2μL衍生物2母液①成为衍 生物2干预组1(50μg/mL)、2μL衍生物2母液②成为衍生物2干预组2(25μg/mL)、2μL衍生物 2母液③成为衍生物2干预组3(12.5μg/mL)、2μL衍生物2母液④成为衍生物2干预组4(6.25μ g/mL)、2μL衍生物2母液⑤成为衍生物2干预组5(3.125μg/mL)、2μL衍生物2母液⑥成为衍生 物2干预组6(1.5625μg/mL)；分别加入2μL衍生物3母液①成为衍生物3干预组1(50μg/mL)、 2μL衍生物3母液②成为衍生物3干预组2(25μg/mL)、2μL衍生物3母液③成为衍生物3干预组 3(12.5μg/mL)、2μL衍生物3母液④成为衍生物3干预组4(6.25μg/mL)、2μL衍生物3母液⑤ 成为衍生物3干预组5(3.125μg/mL)、2μL衍生物3母液⑥成为衍生物3干预组6(1.5625μg/mL)； 分别加入2μL衍生物4母液①成为衍生物4干预组1(50μg/mL)、2μL衍生物4母液②成为衍生物 4干预组2(25μg/mL)、2μL衍生物4母液③成为衍生物4干预组3(12.5μg/mL)、2μL衍生物4 母液④成为衍生物4干预组4(6.25μg/mL)、2μL衍生物4母液⑤成为衍生物4干预组5(3.125μ g/mL)、2μL衍生物4母液⑥成为衍生物4干预组6(1.5625μg/mL)；在198μL的细粒棘球蚴培养液 中加入2μL的DMSO混匀后得DMSO组；取200μL的细粒棘球蚴培养液得阴性组，每组3个副孔。培 养48h后，将细粒棘球蚴全部取出，伊红染色，涂片后置显微镜下拍照，DSMO组、去氢骆驼蓬碱、衍 生物1、衍生物2、衍生物3和衍生物4分别见图1、图2、图3、图4、图5和图6，根据死亡率获得 体外半数致死浓度LC50值。
衍生物1、衍生物2、衍生物3、衍生物4及去氢骆驼蓬碱体外干预的LC50结果见表1。通过表1 可以看出，在体外药物干预条件下，衍生物1和衍生物2在48h内的半数致死浓度显著低于去氢骆驼 蓬碱及衍生物3和衍生物4，说明衍生物1和衍生物2对细粒棘球蚴的杀伤活性均高于去氢骆驼蓬碱 及衍生物3和衍生物4，提示衍生物1和衍生物2为高效抗包虫药物。
二、去氢骆驼蓬碱衍生物1、衍生物2的体内抗包虫药效学实验
1.去氢骆驼蓬碱衍生物的药效学实验
1.1细粒棘球蚴囊泡的制备
制备细粒棘球蚴(方法同体外细粒棘球蚴的制备)，取活力大于95％的细粒棘球蚴于培养液中培养， 培养2个月至3个月后形成直径为2mm至3mm的细粒棘球蚴囊泡。培养条件为37℃、5％CO2的培养箱，根 据培养液的颜色，每隔5天至7天更换培养液1次。
1.2囊型包虫病小鼠动物模型的建立
无菌条件下挑选2mm至3mm大小均一的细粒棘球蚴囊泡，腹腔注射接种于6周至8周龄、体重为20g 至25g的昆明白小鼠体内，于感染6个月至8个月左右进行B超检测，直径超过0.5cm的细粒棘球蚴囊泡的 昆明白小鼠为造模成功。
1.3实验分组
将造模成功的包虫小鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性药物1组(去氢骆驼蓬碱组即HM组)、 阳性药物2组(阿苯达唑组即ABZ组)、药物干预组(衍生物1高剂量组、衍生物1中剂量组、衍生物1低 剂量组、衍生物2高剂量组、衍生物2中剂量组、衍生物2低剂量组、衍生物3高剂量组、衍生物3中剂量 组、衍生物3低剂量组、衍生物4高剂量组、衍生物4中剂量组、衍生物4低剂量组)，共16组，每组12 只。
1.4药物干预
空白对照组和模型组给予生理盐水；阳性药物1组给药去氢骆驼蓬碱，给药剂量为50mg/kg；阳性 药物2组给药阿苯达唑，给药剂量为50mg/kg；衍生物1、衍生物2、衍生物3、衍生物4高剂量组给药剂 量均为100mg/kg，衍生物1、衍生物2、衍生物3、衍生物4中剂量组给药剂量均为50mg/kg，衍生物1、 衍生物2、衍生物3、衍生物4低剂量组给药剂量均为25mg/kg；给药体积为20mL/kg，每组12只，每天灌 胃给药1次，给药4周。
1.5药物配制方法：(同一组动物根据体重按同浓度不同药量给予)
阳性药物1组(去氢骆驼蓬碱组)：精密称取去氢骆驼蓬碱50mg，加入生理盐水20mL，充分振摇溶 解，即为50mg/kg(2.5mg/mL)剂量。
阳性药物2组：精密称取50mg阿苯达唑，置于已灭菌的研钵中，用吐温-80致使药物完全润湿，在 研钵中进行研磨，然后慢慢加入0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液20mL并混匀，即为50mg/kg (2.5mg/mL)剂量。
衍生物高剂量组：精密称取100mg衍生物1、衍生物2、衍生物3、衍生物4置于已灭菌的研钵中，用 吐温-80致使药物完全润湿，在研钵中进行研磨，然后慢慢加入0.5％CMC-Na溶液20mL并混匀，即为 100mg/kg(5mg/mL)剂量。
衍生物中剂量组：精密称取50mg衍生物1、衍生物2、衍生物3、衍生物4置于已灭菌的研钵中，用 吐温-80致使药物完全润湿，在研钵中进行研磨，然后慢慢加入0.5％CMC-Na溶液20mL并混匀，即为 50mg/kg(2.5mg/mL)剂量。
衍生物低剂量组：精密称取25mg衍生物1、衍生物2、衍生物3、衍生物4置于已灭菌的研钵中，用 吐温-80致使药物完全润湿，在研钵中进行研磨，然后慢慢加入0.5％CMC-Na溶液20mL并混匀，即为 25mg/kg(1.25mg/mL)剂量。
空白对照组：生理盐水。
模型组：生理盐水。
2.6囊湿重及囊抑制率
抑囊率＝(模型对照组细粒棘球蚴囊湿重-用药组细粒棘球蚴囊湿重)/模型对照组细粒棘球蚴囊湿 重。
剖检小鼠后大体观察，模型组小鼠体内的囊泡呈透明状且囊液清亮，给药组小鼠体内的囊泡大多 呈半透明状或质地比较硬的钙化结节且囊液呈乳黄色；与模型组比较，双阳性对照组(ABZ组、HM组) 和4个去氢骆驼蓬碱衍生物(衍生物1、衍生物2、衍生物3、衍生物4)的不同给药剂量组，平均囊 湿重均不同程度减轻，差异均具有统计学意义(p<0.05)。与双阳性对照组(ABZ组、HM组)相比，除 2个衍生物(衍生物1、衍生物2)的中、高剂量组，平均囊湿重降低程度差异均具有统计学意义(p<0.05) 外，其余给药组无统计学意义；与(衍生物1、衍生物2)中剂量组比，衍生物(衍生物1、衍生物2) 低剂量组、衍生物3和衍生物4各剂量组，平均囊湿重降低程度差异均具有统计学意义(p<0.05)。各 实验组小鼠囊湿重及其抑囊率见表2。从数据结果分析，同等剂量下，衍生物(衍生物1、衍生物2) 组抑囊率均高于另两个衍生物(衍生物3、衍生物4)及HM组和ABZ组，说明2个衍生物(衍生物1、 衍生物2)抗囊型包虫病疗效优于阿苯达唑和去氢骆驼蓬碱及衍生物3和衍生物4。
2.7囊泡数目和囊泡直径的权重评分
本实验小鼠体内注射的囊泡数目是相同的、直径大小是均一的，可根据小鼠体内囊泡数量的减少 和囊泡直径的减小将囊泡数目和囊泡直径进行权重评分(各占50％权重)，作为药效学评价中的重要指 标。
Figure BDA0002875356120000081
剖检小鼠后大体观察，模型组小鼠体内的囊泡数目较多和囊泡直径较大。与模型组相比，双阳性 对照组(ABZ组、HM组)和4个去氢骆驼蓬碱衍生物(衍生物1、衍生物2、衍生物3、衍生物4)的 各剂量组，权重评分增高，差异均具有统计学意义(p<0.05)；与ABZ组相比，除与衍生物(衍生物1、 衍生物2)中、高剂量组权重评分增高程度差异具有统计学意义(p<0.05)外，其余各组无统计学意 义；与HM组相比，除衍生物(衍生物1、衍生物2)高剂量组权重评分增高程度差异具有统计学意义 外(p<0.05)，其余各组无统计学意义；与(衍生物1、衍生物2)中剂量组比，衍生物(衍生物3、 衍生物4)低剂量组权重评分增高程度有统计学差异。各实验组小鼠体内囊泡个数、囊泡直径及其权 重评分见表3。从数据结果分析，同等剂量下，衍生物(衍生物1、衍生物2)组的权重评分均高于另 两个HM衍生物组(衍生物3、衍生物4)、HM组和ABZ组，说明2个衍生物(衍生物1、衍生物2)抗 囊型包虫病疗效优于阿苯达唑和去氢骆驼蓬碱及衍生物3和衍生物4。
2.7组织病理学
取出囊泡、肝脏，置于生理盐水中清洗后用滤纸吸干，然后进行切割整理，取适量组织置于4％多 聚甲醛中固定，包埋、切片、HE染色，进行病理组织学检查。组织病理结果如下：
2.7.1肝脏切片病理结果
模型组、阳性对照组及药物干预组汇管区炎细胞浸润有不同程度的改善，其中2个衍生物(衍生 物1、衍生物2)中、高剂量组最显著(如图7至15所示)。肝组织病理分级及结果见表4、表5。
2.7.2囊泡切片病理结果
模型组细粒棘球蚴囊泡生发层结构及轮廓清晰，内壁平整，无坏死灶及钙化灶，无异物肉芽肿，外 层可见角质层细胞较多，具有吸收营养物质及保护生发层作用(如图16所示)；阳性对照组及药物干 预组的生发层结构被破坏不同程度的破坏，外层角质层细胞不同程度减少，以2个衍生物(衍生物1、 衍生物2)中、高剂量组内囊片层结构改变更显著(如图17至24所示)。囊泡组织病理损伤情况分级 及结果见表6、表7。
2.7.3囊泡透射电镜观察
TEM观察各实验组形态学结果表明：模型组细粒棘球蚴囊泡生发层结构清晰，微毛整齐且数量较多， 皮层细胞核大而圆，核仁清晰，核膜边界有少许异染色质，角质层结构均匀，板层结构清晰(如图25 所示)；阳性对照组、2个衍生物(衍生物1、衍生物2)的角质层、生化层及板层结构不同程度的破 坏，微毛不同程度减少，皮层细胞核仁不同程度的消失(如图26至33所示)。囊泡透射电镜观察组织 病理分级及结果见表8、表9。
三、两种去氢骆驼蓬碱衍生物体内安全性评价
选择15g左右的健康成年小鼠200只，随机分为HM组、ABZ组、衍生物1高、中、低剂量组、衍生 物2高、中、低剂量组及空白对照组(等量生理盐水)，每组20只。灌胃给药量为0.2mL/10g至0.4mL/10g， 每日给药1次，每周称重1次，连续给药30d，期间观察小鼠一般状况、体重、摄食量。给药结束后 对每组小鼠随机眼球采血，测定血液学及生化指标，取组织进行病理学检测。
1.一般状况
在4周给药过程期间，小鼠精神状态、反应，行为活动，排便情况、口、眼及孔道分泌物、毛色， 清洁度等日常观察指标均未见异常。
2.体重增长的影响
对小鼠每周体重进行1次统计，各组大鼠体重增长情况良好。各给药组与空白对照组之间并无统 计学差异(p>0.05)，体重增长呈线性增加，结果见表10。
3.摄食量的影响
对各组小鼠摄食量每周进行一次统计，各给药组与空白对照组相比未见明显异常。
4.脏器及其系数的影响
给药组小鼠给药4后心、肝、肺、肾、脑、脾脏器系数与空白对照组比较，差异均无统计学意义(p> 0.05)，表明2个衍生物连续长期给药后对小鼠各脏器无明显毒性影响。结果见表11。
5.血液学及生化指标的影响
各给药组小鼠在给药4周后，其白细胞计数(WBC)、淋巴细胞计数(LYM)、单核细胞计数(Mon)、 嗜酸性粒细胞计数(Eos)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板计数(PLT)血常规指 标与空白对照组比较，差异无统计学意义(p>0.05)。各给药组小鼠谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶 (AST)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)、肌酐(Cr)、总胆固醇(TC)，主要血液 生化指标与空白对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。结果见表12、13。
6.病理组织学指标检测
给药结束后24h对小鼠进行剖检，每组取小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑等脏器，用10％的甲醛 溶液浸泡固定，一定时间后冲洗、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，进行病理组织学检查。
小鼠重要内脏器官的病理组织学变化描述如下：
心脏：空白对照组、ABZ组、HM组、衍生物1高剂量组和衍生物2高剂量组小鼠心肌纤维平行排列， 胞浆染色均匀，胞核清晰呈椭圆形；未发现有明确的肌溶灶或凝固性坏死灶。
肝脏：如图28至32所示，空白对照组、ABZ组、衍生物1高剂量组和衍生物2高剂量组小鼠肝 小叶结构清晰，以中央静脉为中心，肝细胞索和肝血窦向周围呈放射状排列，胞浆丰富；汇管区未见 炎细胞侵润纤维组织增生，脂肪变性。但去氢骆驼蓬碱高剂量组汇管区观察到大量炎性细胞浸润和肝 血窦充血。
脾脏：空白对照组、ABZ组、HM组、衍生物1高剂量组和衍生物2高剂量组脾脏中白髓动脉周围淋 巴鞘和脾小体边界清楚，红髓中脾血窦和脾索结构清晰，未见异常。
肺：空白对照组、ABZ组、HM组、衍生物1高剂量组和衍生物2高剂量组肺泡组织形态、结构清晰， 肺泡无塌陷及破裂，肺泡充盈适度，肺泡囊管壁结构完整，未见异常。
肾脏：空白对照组、ABZ组、HM组、衍生物1高剂量组和衍生物2高剂量组肾脏中肾小体结构完整， 肾小球位于小体中央且结构完整，未见异常。
脑：如图33至37所示，空白对照组、ABZ组、衍生物1高剂量组和衍生物2高剂量组脑部锥体细 胞排列整齐，细胞边缘清晰，细胞呈多角形。HM组脑组织出现了组织病理学的改变，细胞排列疏松， 肿胀变形，顶状树突变短或消失。
长期毒性试验是通过临床表现、血液学、血清生化、病理组织切片来考察灌胃药物对大鼠持续给药 的毒性。血液学指标反映机体内环境及造血功能的变化，血清生化指标检验机体生理成分、代谢情况 及重要器官的功能状态，其中肾功能及肝功能的变化是考察药物是否存在蓄积毒性。本试验结果显示 衍生物各剂量组血液学与血清生化结果均在正常参考值范围内，与空白组相比无显著差异。
β-咔啉类生物碱最大的毒性为神经毒性，其次是肝毒性，从病理切片来看2个衍生物(衍生物1、 衍生物2)各剂量组和ABZ组并未对小鼠脑组织和肝组织造成伤害，对其它主要脏器、免疫器官也未 造成损害，但去氢骆驼蓬碱可见脑组织和肝组织病理学的改变。由此说明：衍生物1和衍生物2的安 全性与ABZ相当，高于去氢骆驼蓬碱。
综上所述，本发明中，通过体外药效学实验数据表明去氢骆驼蓬碱衍生物能够显著降低细粒棘球 蚴的存活率，作用强于去氢骆驼蓬碱以及前期得到的去氢骆驼蓬碱衍生物3和4(详见专利 201610405774.1)；体内药效学实验数据表明口服去氢骆驼蓬碱衍生物抗囊型包虫病疗效优于阿苯达唑 和去氢骆驼蓬碱以及前期得到的去氢骆驼蓬碱衍生物3和4(详见专利201610405774.1)；安全性评价 实验数据表明去氢骆驼蓬碱衍生物1和2的毒性小于去氢骆驼蓬碱，从而为囊型包虫病的治疗和预防 提供了一种新的选择。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非 必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
表1
药物 LC<sub>50</sub>(mg/kg)
去氢骆驼蓬碱 48.28±17.76
衍生物1 9.24±1.52
衍生物2 8.02±0.84
衍生物3 14.34±5.70
衍生物4 12.62±2.88
表2
Figure BDA0002875356120000111
Figure BDA0002875356120000121
注：a与模型组相比，p<0.05；b与ABZ组相比，p<0.05；c与HM组相比，p<0.05；
d与衍生物1中剂量组相比，p<0.05；e与衍生物2中剂量组相比
表3
Figure BDA0002875356120000122
注：a与模型组相比，p<0.05；b与ABZ组相比，p<0.05；c与HM组相比，p<0.05；
d与衍生物1中剂量组相比，p<0.05；e与衍生物2中剂量组相比
表4
Figure BDA0002875356120000123
表5
Figure BDA0002875356120000131
表6
Figure BDA0002875356120000132
表7
Figure BDA0002875356120000133
表8
Figure BDA0002875356120000141
表9
Figure BDA0002875356120000142
表10
Figure BDA0002875356120000143
Figure BDA0002875356120000151
表11
Figure BDA0002875356120000152
表12
Figure BDA0002875356120000153
Figure BDA0002875356120000161
表13
Figure BDA0002875356120000162

Claims (4)

1.一种去氢骆驼蓬碱衍生物在制备治疗或预防囊型包虫病药物中的应用，其特征在于去氢骆驼蓬碱衍生物的结构通式为：
Figure FDA0002875356110000011
其中，R1是选自氢、C1-4烷基、取代或非取代的五元芳基或六元芳基、取代或非取代的含有1个至4个选自N或O或S的杂原子的五元杂芳基或六元杂芳基中的一种；R3选自氢、NH2，-CO-(CH2)f-取代或非取代的五或六元芳基并且f选自1至6的整数、-CO-(CH2)f－取代或非取代的含有1至4个选自N,O或S的杂原子的五或六元杂芳基；羧基、-COONH2、-COO-取代或非取代的C1-10直链或支链烷基、-COO-取代或非取代的五或六元芳基、-COO-取代或非取代的含有1至4个选自N,O或S的杂原子的五或六元杂芳基，-COO-(CH2)f-取代或非取代的五或六元芳基并且f选自1-6的整数、-COO-(CH2)f－取代或非取代的含有1至4个选自N,O或S的杂原子的五或六元杂芳基；R9是选自氢、C1－6烷基、羟基-C1-6烷基、吡啶基-C1－6烷基中的一种。
2.根据权利要求1所述的去氢骆驼蓬碱衍生物在制备治疗或预防囊型包虫病药物中的应用，其特征在于取代或非取代的五元芳基或六元芳基上的取代基选自羟基、氨基、羧基、卤素、硝基、C1－6烷基和C1－6烷氧基中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的去氢骆驼蓬碱衍生物在制备治疗或预防囊型包虫病药物中的应用，其特征在于去氢骆驼蓬碱衍生物1为9-丁基-1-甲基-N-(2-羟基)乙基-β-咔啉-3-甲酰胺，其结构式为：
Figure FDA0002875356110000012
。
4.根据权利要求1或2所述的去氢骆驼蓬碱衍生物在制备治疗或预防囊型包虫病药物中的应用，其特征在于去氢骆驼蓬碱衍生物2为1-甲基-9-(3-吡啶)甲基-β-咔啉，其结构式为：
Figure FDA0002875356110000013
。
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