CN114588169A - 一种贝母属异甾体生物碱单体的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于防治急性肺损伤药物技术领域,公开了一种贝母属异甾体生物碱单体的用途,为贝母属异甾体生物碱单体在制备用于治疗、缓解或预防肺损伤的药物中的用途。肺损伤为LPS诱导的急性肺损伤。肺损伤还可为流感病毒感染、细菌感染和/或真菌感染引起的肺损伤。贝母属异甾体生物碱单体包括:去氢鄂贝定碱和贝母辛。本发明选取了对应的代表性化合物去氢鄂贝定碱和贝母辛进行防治急性肺损伤活性实验,确定去氢鄂贝定碱和贝母辛这两种天然小分子生物碱单体具有良好的防治急性肺损伤活性,可明显缓解肺部的炎症及肺水肿情况,拓宽了贝母属植物的新应用病症范围,为安全有效的急性肺损伤新药物的开发提供了可靠的方向和基础。
Description
技术领域
本发明属于防治急性肺损伤药物技术领域,尤其涉及一种贝母属异甾体生物碱单体的用途。
背景技术
目前,急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)是一种以呼吸困难、肺内炎症细胞浸润、肺微血管通透性增高、肺泡和肺实质严重水肿及进行性低氧血症为特征的临床综合征,其总体死亡率高达40%,是危害人类健康的一项重大疾病。目前认为ALI的发病机制为外界刺激引发机体的过度炎症反应导致多器官功能障碍综合征,LPS感染的肺炎是急性肺损伤最常见的发病因素,会诱导机体各种炎性因子的分泌,使炎症系统激活,触发急性肺损伤的发生。目前对ALI的临床治疗以机械通气和液体管理为主,仍缺乏有效的药物治疗,在其发病率和死亡率居高不下的当代研究中,寻找到有显著抗炎消炎作用的安全有效的药物以防治急性肺损伤的发病具有重大意义。现代药理学研究及本研究前期已证明,贝母属中的异甾体生物碱有显著的抗炎活性。异甾体生物碱分为瑟文型和介藜芦型,选取了对应的代表性化合物去氢鄂贝定碱和贝母辛进行防治急性肺损伤活性研究。
通过上述分析,现有技术存在的问题及缺陷为:临床治疗以机械通气和液体管理为主,少有的有效药物多为化学药,在当代绿色大健康背景下大众对于安全有效的天然药物的需求广泛存在,而这块的天然新药开发尚属空白。贝母作为有临床应用百年历史的珍贵药材,其药效物质基础研究还在大力发展,而其活性成分生物碱有被分离得到,可对其药效应用开发进行实验验证,拓宽了贝母属植物的新应用病症范围,为安全有效的急性肺损伤新药物的开发提供了可靠的方向和基础。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种贝母属异甾体生物碱单体的用途。
本发明是这样实现的,一种贝母属异甾体生物碱单体在制备用于治疗、缓解或预防肺损伤的药物中的用途。
进一步,所述贝母属异甾体生物碱单体包括:去氢鄂贝定碱、贝母辛中的任意一种或两种。
进一步,所述用于治疗、缓解或预防肺损伤的药物为片剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、栓剂、丸剂、散剂、纳米制剂、口服液、糖浆、溶液、悬浮液中的任意一种。
本发明的另一目的在于提供一种贝母属异甾体生物碱单体在制备用于治疗、缓解或LPS诱导的急性肺损伤的药物中的用途。
进一步,所述贝母属异甾体生物碱单体包括:去氢鄂贝定碱、贝母辛中的任意一种或两种。
进一步,所述用于治疗、缓解或LPS诱导的急性肺损伤的药物为片剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、栓剂、丸剂、散剂、纳米制剂、口服液、糖浆、溶液、悬浮液中的任意一种。
本发明的另一目的在于提供一种贝母属异甾体生物碱单体在制备用于治疗、缓解或流感病毒感染、细菌感染和/或真菌感染引起的肺损伤的药物中的用途。
进一步,其特征在于,所述贝母属异甾体生物碱单体包括:去氢鄂贝定碱、贝母辛中的任意一种或两种。
进一步,所述用于治疗、缓解或流感病毒感染、细菌感染和/或真菌感染引起的肺损伤的药物为片剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、栓剂、丸剂、散剂、纳米制剂中的任意一种。
进一步,其特征在于,所述用于治疗、缓解或流感病毒感染、细菌感染和/或真菌感染引起的肺损伤的药物为口服液、糖浆、溶液、悬浮液中的任意一种。
结合上述的所有技术方案,本发明所具备的优点及积极效果为:本发明选取了对应的代表性化合物去氢鄂贝定碱和贝母辛进行防治急性肺损伤活性实验,发现去氢鄂贝定碱和贝母辛这两种天然小分子生物碱单体具有良好的防治急性肺损伤活性,可明显缓解肺部的炎症及肺水肿情况,拓宽了贝母属植物的新应用病症范围,对于贝母的开发和成果转化提供可靠的实验依据,填补了业内关于安全天然的药物防治急性肺损伤病症的可用药选项空白,为安全有效的急性肺损伤新药物的开发提供了可靠的支撑。
附图说明
图1是本发明实施例提供的生物碱对大鼠体温变化及外观行为学的影响示意图。
图2是本发明实施例提供的生物碱对大鼠脏器指数的影响示意图。
图3是本发明实施例提供的心的HE染色结果示意图。
图4是本发明实施例提供的肝的HE染色结果示意图。
图5是本发明实施例提供的脾的HE染色结果示意图。
图6是本发明实施例提供的肾的HE染色结果示意图。
图7是本发明实施例提供的肺的HE染色结果示意图。
图8是本发明实施例提供的生物碱对大鼠肺组织的湿/干重比及髓过氧化物酶(MPO)含量的影响示意图。
图9是本发明实施例提供的生物碱对肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白含量及炎症因子水平的影响示意图。
图10是本发明实施例提供的生物碱对大鼠MyD88相关信号传导的信号通路的表达影响示意图。
图11是本发明实施例提供的生物碱对大鼠NFKB及MAPKs信号通路的表达影响示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种贝母属异甾体生物碱单体的用途,下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的用途为贝母属异甾体生物碱单体在制备用于治疗、缓解或预防肺损伤的药物中的用途。
本发明实施例提供的肺损伤为LPS诱导的急性肺损伤。
本发明实施例提供的肺损伤还可为流感病毒感染、细菌感染和/或真菌感染引起的肺损伤。
本发明实施例提供的贝母属异甾体生物碱单体包括:去氢鄂贝定碱和贝母辛。
本发明实施例提供的用途还包括:单独应用去氢鄂贝定碱或贝母辛制备用于治疗、缓解或预防肺损伤的药物。
本发明实施例提供的用途进一步包括:联合应用去氢鄂贝定碱和贝母辛制备用于治疗、缓解或预防肺损伤的药物。
本发明实施例提供的贝母属异甾体生物碱单体通过缓解肺部的炎症水平起作用。
本发明实施例提供的贝母属异甾体生物碱单体通过缓解肺水肿起作用。
本发明实施例提供的药物的剂型可为片剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、栓剂、丸剂、散剂、纳米制剂。
本发明实施例提供的药物剂型还可为口服液、糖浆、溶液、悬浮液。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1:
1.材料
1.1实验动物
健康SPF级SD雄性大鼠72只,周龄6-8W,体重180-200g,由成都达硕实验动物中心提供,饲养于四川大学华西药学院动物房。
1.2试剂与仪器
1.2.1试剂
其余试剂均为国产分析级试剂。
1.2.2仪器耗材
名称 | 供应商 |
Eclipse E100数码三目摄像显微镜 | 日本Nikon |
Alpha-1860紫外可见分光光度计 | 上海谱元仪器有限公司 |
HS-S7320型石蜡切片机 | 沈阳恒松科技有限公司 |
RE-5203旋转蒸发仪 | 上海亚荣生化仪器厂 |
减压真空干燥箱 | 上海一恒科技有限公司 |
Varioskan LUX多功能酶标仪 | 美国Thermo Fisher Scientific |
凝胶成像仪 | 广州博鹭腾生物科技有限公司 |
动物体温计 | 山东尚农电子科技有限公司 |
组织研磨仪 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 |
2mL、5mL一次性注射器、一次性真空采血管、一次性采血针、灌胃针、手术用剪刀、镊子、穿刺针、离心管、移液器。
2.实验方法
2.1实验动物模型的建立
将72只SD大鼠饲养于四川大学华西药学院规范化动物房一周适应环境,自由饮水和饮食。随机分组,分为空白对照组(C)、LPS模型组(P)、去氢鄂贝定碱低剂量组(Q1,2.5mg/kg)、去氢鄂贝定碱中剂量组(Q2,5mg/kg)、去氢鄂贝定碱高剂量组(Q3,10mg/kg)、贝母辛低剂量组(X1,2.5mg/kg)、贝母辛中剂量组(X2,5mg/kg)、贝母辛高剂量组(X3,10mg/kg)、阳性药地塞米松组(D、5mg/kg),共9组每组各8只。
本发明采用脂多糖(LPS)腹腔注射的方式建立大鼠急性肺损伤模型,经预实验结果选择LPS给药剂量为5mg/kg。建模前12h禁食不禁水,阳性药组及治疗组均灌胃给药(5ml/kg),空白组和模型组灌胃给等量的生理盐水。LPS用生理盐水溶解配为2mg/ml的溶液,避光保存一周内使用,按照5mg/kg的剂量腹腔注射建模后恢复自由进食,建模后12h再次同剂量灌胃给药。自建模起第0h、6h、12h、24h测定体温,建模24h后称重并处死,按照下列实验指标内容对应采集样本,处死前禁食12h但不禁水。
2.2标本的采集
2.2.1血液样本的采集
取待处死大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉,打开腹腔露出腹主动脉血管,用一次性采血针和真空采血管收集血液,及时离心取上清冻存供后续检测。
2.2.2支气管肺泡灌洗液的收集
经腹主动脉放血后的大鼠用手术间剪开胸腔露出肺和心脏,分离出右主支气管结扎,于颈部游离出气管,在环状软骨处用7号穿刺针轻轻刺入并用棉线结扎固定。用5ml无针头的注射器吸取预冷的生理盐水3mL,注入管腔可见左肺随之鼓起,反复抽吸三次计为一次灌洗,重复灌洗3次(回收率为80%以上),将三次的灌洗液合并即得肺泡灌洗液(BALF)。低温离心后取上清分装冻于-80℃冰箱中。
2.2.3组织标本的采集
经腹主动脉放血后的大鼠迅速摘取其双肾、脾脏、肝脏,打开胸腔后取心脏,过预冷的生理盐水漂洗去除血污,用纱布吸掉多余水分后称重记录供计算脏器指数。取右肺上叶漂洗吸干称重,于60℃烘箱内烘24h后称重,计算肺湿/干重比。取灌洗后的左肺和称重后的心脏、脾脏、右肾、肝大叶放入4%多聚甲醛固定48h,后续进行常规石蜡包埋、切片、HE染色,显微镜下观察各脏器的组织形态及病理状态。其余肺组织用锡箔纸包裹迅速冻于液氮中,长期保存在-80℃冰箱中用于后续指标的测定。
2.3样本的实验测定
2.3.1肺泡灌洗液(BALF)中IL-6、TNF-α、IL-1β和HO-1含量的测定
取冻存的肺泡灌洗液上清于室温下融解后,按照ELISA试剂盒说明进行操作,测定IL-6、IL-6、TNF-α、IL-1β和HO-1的含量变化。
2.3.2肺组织中的髓过氧化物酶(MPO)含量的测定
取冻存的肺组织按照试剂盒的说明进行匀浆和配制反应体系,测定吸光度后依照标曲计算出肺组织中的MPO含量(U/g)并进行统计分析。
2.3.3肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量的测定
取冻存的适量肺组织加入RIPA裂解液于低温进行组织研磨,12000g4℃离心3min,取上清用于后续测定。依照BCA试剂盒说明书进行操作,测定吸光度后依照标曲计算蛋白浓度(ug/ml)并进行统计分析。
2.4统计学分析
3.实验结果
3.1生物碱对大鼠体温变化及外观行为学的影响
与空白组相比较,模型组腹腔注射LPS以建立急性肺损伤模型大鼠6h后,可明显测得大鼠体温上升,且在注射后12h及24h体温均保持在较高的水平。同时对大鼠进行行为学观察可见空白组大鼠存活良好活动自如,未出现呼吸急促。模型组大鼠动作缓慢,表现为气短、精神萎靡。给药组大鼠均表现出明显更好的状态。去氢鄂贝定碱(Q)和贝母辛(X)不同剂量组药物给药后均可见腹腔注射后LPS体温升高程度有所缓解,且在病程的前中后期均保持在比较稳定缓和的水平。
3.2生物碱对大鼠脏器指数的影响
与空白组相比较,模型组的肝脏、脾脏和肾脏的脏器系数均有一定的上升,这是因为LPS腹腔注射后会引发全身的炎症反应综合征,脏器会有一定的水肿和免疫激活状态。而阳性药地塞米松给药后脾脏的脏器系数会出现明显的下降,是地塞米松的免疫抑制作用所致,去氢鄂贝定碱和贝母辛均未出现明显的脏器毒性和免疫抑制反应。
3.3生物碱对大鼠脏器病理形态的影响
对于各脏器的病理状况进行显微观察,光镜下可见心脏、肾脏各脏器均无明显异常。LPS处理的小鼠肝脏出现脂肪堆积和少许炎症细胞浸润,脾脏中的地塞米松组可见白髓区域减小,有一定的脾萎缩现象。
与空白组相比较,可见模型组大鼠肺间质和肺泡水肿、透明膜形成和慢性阶段细胞的增生和纤维化,肺泡-毛细血管膜厚度增加导致弥散功能障碍。穿出血管的中性粒细胞进入肺泡及肺泡隔,肺叶均存在弥漫性的肺泡间隔增厚与肺泡壁破坏,肺间质炎症细胞浸润与出血。低剂量给药组小鼠部分肺叶结构破坏严重,部分肺叶结构相对完整,肺叶之间病灶不均匀。与模型组相比,各给药组大鼠的肺叶肺泡结构明显改善,肺泡间质增厚明显缓解,肺间质炎症细胞浸润范围明显缩小,肺泡出血和肺泡水肿现象明显改善。
3.4生物碱对大鼠肺组织的湿/干重比及髓过氧化物酶(MPO)含量的影响
与空白组相比较,可见模型组大鼠的肺/湿干重比明显升高,提示肺水肿现象明显,模型建立成功。与模型组大鼠比较,各给药组大鼠的湿/干重比系数均有下降的趋势,去氢鄂贝定碱的中、高剂量组及贝母辛的高剂量组有显著性的差异,表示肺水肿现象有显著的缓解。
髓过氧化酶是炎症反应发生时检查中性粒细胞被激活水平的关键指标因子。与空白组相比较,模型组的MPO含量明显升高,肺部炎症反应显著。与模型组相比较,除去氢鄂贝定碱和贝母辛的低剂量组外各给药组肺组织MPO含量均有显著下降,其中去氢鄂贝定碱下降的最多。综合看来,去氢鄂贝定碱和贝母辛在中剂量时已具有明显的缓解肺水肿及缓解炎症水平的活性作用。
3.5生物碱对肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白含量及炎症因子水平的影响
对肺泡灌洗液中的蛋白含量进行测试,发现模型组较空白组的蛋白含量显著升高,是因为肺组织微血管通透性改变,炎症和肺上皮细胞产生的蛋白总量增加产生聚集,给药组则表现出良好的改善趋势。同时,模型组的肺泡灌洗液中的炎症因子水平均有显著上升,均代表了急性肺损伤病程中的炎症聚集和肺组织病理性改变的病症。与模型组相比,除去氢鄂贝定碱和贝母辛的低剂量组的蛋白水平和炎症因子水平无显著性差异外,各给药组均表现出良好的抗炎活性和肺组织保护功能,且作用效果体现出一定的剂量依赖性。
综合看来,去氢鄂贝定碱和贝母辛在中剂量5mg/kg时对于急性肺损伤大鼠有明显的防治作用,在此基础上提高剂量会使药效更加明显,在二者均有优异的防治肺水肿抗炎功效的背景下进行同剂量下比较,贝母辛的药效作用略胜一筹。
3.6生物碱对大鼠MyD88相关信号传导的信号通路的表达影响
与空白组相比,模型组的MyD88和TRAF6蛋白表达量明显上升,这是由LPS经由TLR4受体对应引起的MyD88蛋白表达量上调,也伴随着TRAF6的上调响应引起了后面一系列的炎症反应。这表明了LPS的刺激会激活TLR4/MyD88依赖型相关信号通路,且随着合适剂量下药物的处理干预,MyD88和TRAF6蛋白量的表达均有下降,LPS引起的急性肺损伤炎症反应呈现剂量依赖性的缓解。
3.7生物碱对大鼠NFKB及MAPKs信号通路的表达影响
蛋白印迹结果显示,在TLR4/MyD88依赖型相关信号通路被激活后,模型组大鼠中的NFKB信号通路和MAPKs信号通路均有响应,NFKB、Erk、p38、Jnk蛋白磷酸化水平均明显升高。在不同剂量的药物处理下,与模型组相比可见NFKB磷酸化水平下降,且呈现剂量依赖性,其中去氢鄂贝定碱在低剂量时即可表现出良好的调控效果。此外在MAPKs相关信号通路中,去氢鄂贝定碱和贝母辛通过降低Erk、p38和JNK的磷酸化水平三方面共同调控,降低炎症水平,缓解大鼠急性肺损伤病况。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种贝母属异甾体生物碱单体在制备用于治疗、缓解或预防肺损伤的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的贝母属异甾体生物碱单体在制备用于治疗、缓解或预防肺损伤的药物中的用途,其特征在于,所述贝母属异甾体生物碱单体包括:去氢鄂贝定碱、贝母辛中的任意一种或两种。
3.如权利要求1所述的贝母属异甾体生物碱单体在制备用于治疗、缓解或预防肺损伤的药物中的用途,其特征在于,所述用于治疗、缓解或预防肺损伤的药物为片剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、栓剂、丸剂、散剂、纳米制剂、口服液、糖浆、溶液、悬浮液中的任意一种。
4.一种贝母属异甾体生物碱单体在制备用于治疗、缓解或LPS诱导的急性肺损伤的药物中的用途。
5.如权利要求4所述的贝母属异甾体生物碱单体在制备用于治疗、缓解或LPS诱导的急性肺损伤的药物中的用途,其特征在于,所述贝母属异甾体生物碱单体包括:去氢鄂贝定碱、贝母辛中的任意一种或两种。
6.如权利要求4所述的贝母属异甾体生物碱单体在制备用于治疗、缓解或LPS诱导的急性肺损伤的药物中的用途,其特征在于,所述用于治疗、缓解或LPS诱导的急性肺损伤的药物为片剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、栓剂、丸剂、散剂、纳米制剂、口服液、糖浆、溶液、悬浮液中的任意一种。
7.一种贝母属异甾体生物碱单体在制备用于治疗、缓解或流感病毒感染、细菌感染和/或真菌感染引起的肺损伤的药物中的用途。
8.如权利要求7所述的贝母属异甾体生物碱单体在制备用于治疗、缓解或流感病毒感染、细菌感染和/或真菌感染引起的肺损伤的药物中的用途,其特征在于,所述贝母属异甾体生物碱单体包括:去氢鄂贝定碱、贝母辛中的任意一种或两种。
9.如权利要求7所述的贝母属异甾体生物碱单体在制备用于治疗、缓解或流感病毒感染、细菌感染和/或真菌感染引起的肺损伤的药物中的用途,其特征在于,所述用于治疗、缓解或流感病毒感染、细菌感染和/或真菌感染引起的肺损伤的药物为片剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、栓剂、丸剂、散剂、纳米制剂中的任意一种。
10.如权利要求7所述的贝母属异甾体生物碱单体在制备用于治疗、缓解或流感病毒感染、细菌感染和/或真菌感染引起的肺损伤的药物中的用途,其特征在于,所述用于治疗、缓解或流感病毒感染、细菌感染和/或真菌感染引起的肺损伤的药物为口服液、糖浆、溶液、悬浮液中的任意一种。
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CN114010718A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-02-08 | 四川大学 | 一种川贝母提取物的制备方法及其应用 |
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2022
- 2022-03-24 CN CN202210297000.7A patent/CN114588169A/zh active Pending
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