CN105560379B - 桑白皮脂肪油组分在制备治疗急性肺损伤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种桑白皮脂肪油组分在制备急性肺损伤药物中的应用。本发明通过桑白皮脂肪油组分对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的作用研究发现,桑白皮脂肪油组分可降低肺湿重/干重比值,具有减轻肺水肿作用,脂肪油组分可显著降低TNF‑α、IL‑1β、IL‑6等促炎因子含量,光镜下显示桑白皮脂肪油组分对肺组织病理学变化都有所缓解,肺组织结构趋于正常。提示桑白皮脂肪油组分可以通过减轻LPS致ALI的水肿程度,减轻病理损伤,降低TNF‑α、IL‑1β、IL‑6等促炎因子含量发挥对LPS致ALI的保护效应,其机制值得进一步研究。

Description

桑白皮脂肪油组分在制备治疗急性肺损伤药物中的应用
技术领域
本发明涉及制药领域,具体涉及一种桑白皮脂肪油组分在制备治疗急性肺损伤药物中的应用。
背景技术
脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是内毒素的主要成分,内毒素进入机体后通过诱发过度炎症反应及全身免疫反应,可以引起急性肺损伤。LPS诱导的急性肺损伤(acutelunginjury,ALI)是严重创伤或是感染后出现最早、发病率最高的并发症之一,目前全球因肺损伤造成的死亡率还很高,但是仍然没有一个可行、有效的治疗方法使其降低其死亡率,为了寻求更好的治疗方法,已经有很多的学者从传统中药抗炎作用的角度出发,研究中药单体对内毒素引起的急性肺损伤的保护作用及机制,目前,中药的抗炎作用已在临床中得以证明,中药的抗炎作用机制研究也取得了一定的进展,但仍处于起步阶段,有巨大的发展前景。
桑白皮是我国的传统中药,中国古代第一部医学典籍《神农本草经》,就将桑白皮列为药中上品,具有极高的药用价值。已广泛应用于中医临床各种方剂之中,并取得了良好的临床效果。桑白皮含有多种化学成分,具有较广泛的药理活性,包括消炎、利尿、解热、镇咳、祛痰等作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种桑白皮脂肪油组分在制备治疗急性肺损伤药物中的应用。
本发明的技术方案是:桑白皮脂肪油组分在制备治疗急性肺损伤药物中的应用。
所述桑白皮脂肪油是将精密称取的干燥至恒重的桑白皮粉末过60-80目筛并置于滤纸筒内,将滤纸筒置于索氏提取器中,然后加入桑白皮粉末重量8-12倍量的石油醚,在温度为60~90℃时回流提取5-7h;将提取液放冷至室温,过滤并收集滤液,将收集到的滤液置于已干燥至恒重的蒸发皿中,水浴挥去溶剂,在温度为100℃时干燥1h,移置于干燥器中,冷却30-40min,即得桑白皮脂肪油。
所述滤纸为脱脂滤纸。
本发明的有益效果是:本发明通过桑白皮脂肪油组分对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的作用研究发现,桑白皮脂肪油组分可降低肺湿重/干重比值,具有减轻肺水肿作用,脂肪油组分可显著降低TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子含量,光镜下显示桑白皮脂肪油组分对肺组织病理学变化都有所缓解,肺组织结构趋于正常。提示桑白皮脂肪油组分可以通过减轻LPS致ALI的水肿程度,减轻病理损伤,降低TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子含量发挥对LPS致ALI的保护效应,其机制值得进一步研究。
桑白皮产于全国各地,资源非常丰富,主产于河南、安徽、四川、湖南等地,在我国一直被用作为传统中药,临床上用于治疗多种疾病,其治病的物质基础是由独特活性成分决定的。桑白皮富含多种化学成分,其中黄酮类化合物是主要活性成分,常用于镇咳、消炎、利尿、祛痰等。现代药理研究表明桑白皮具有抗炎、利尿、降压、镇静、镇痛、抗肿瘤等作用。但其药理学作用机制尚不清楚。
急性肺损伤(Acutelunginjury,ALI)是一种急性的、持续性的肺部炎症反应综合征,这种炎症反应引起肺泡毛细血管内膜损伤和毛细血管渗透性增加。其临床表现为肺水肿、肺炎、肺顺应性减低和低氧血症。引起急性肺损伤的原因多种多样,但其病理生理学过程都很相似,本质都是炎症反应的失控。急性肺损伤的最严重的情况为急性呼吸窘迫综合征(SRDS)。小鼠吸入脂多糖所致实验性肺炎模型较为理想地模拟人的急性重症肺炎。
脂多糖(LPS)为革兰氏阴性杆菌外膜的重要成分,一种具有高度生物活性的大分子物质,当其进入肺组织后,造成肺泡毛细血管膜的破坏。LPS能促进促炎性介质的释放,并抑制抗炎性介质的分泌与释放,造成平衡失调,炎症反应失控,最终导致ALI/SRDS,甚至造成机体的休克或者死亡。
ALI的实质是炎症反应的失控,因此在ALI中有很多炎症介质参与其中。TNF-α、IL-1β、IL-6被认为是先天性免疫应答中最重要的炎性介质,它们在ALI中也具有十分重要的作用。从我们的数据可以看出,LPS诱导急性肺损伤后,肺泡灌洗液中的TNF-α、IL-1β、IL-6的水平显著提升。这些炎性介质的增多导致血管内皮细胞的损伤,肺毛细血管通透性增加,炎性细胞浸润,造成肺组织结构的严重损伤。
图1为桑白皮脂肪油组分对肺湿重/干重的影响;
图2为桑白皮脂肪油组分对肺泡灌洗液中炎症因子TNF-α表达的影响;
图3为桑白皮脂肪油组分对肺泡灌洗液中炎症因子IL-1β表达的影响;
图4为桑白皮脂肪油组分对肺泡灌洗液中炎症因子IL-6表达的影响;
图5为小鼠肺组织HE染色图片(×400)。
具体实施方式
桑白皮脂肪油组分在制备治疗急性肺损伤药物中的应用。所述桑白皮脂肪油是将精密称取的干燥至恒重的桑白皮粉末过60-80目筛并置于滤纸筒内,将滤纸筒置于索氏提取器中,然后加入桑白皮粉末重量8-12倍量的石油醚,在温度为60~90℃时回流提取5-7h;将提取液放冷至室温,过滤并收集滤液,将收集到的滤液置于已干燥至恒重的蒸发皿中,水浴挥去溶剂,在温度为100℃时干燥1h,移置于干燥器中,冷却30-40min,即得桑白皮脂肪油。
本发明具体步骤如下:
材料与方法
1实验材料
1.1动物
雄性健康BABL/c小鼠,体重18-22g,许可证号:SCXK(京)2012-0001(由北京维通利华实验动物技术有限公司提供)。饲养于18-22℃清洁级动物实验室内,自由饮食、饮水。
1.2药物
桑白皮购于郑州市中药材市场,经河南中医学院陈随清教授、董诚明教授鉴定为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥根皮。
桑白皮脂肪油提取方法:精密称取10g干燥至恒重的桑白皮药材粉末(过60目筛)于滤纸筒内,置索氏提取器中,加入100mL石油醚(60~90℃)回流提取6h,提取液放冷至室温,过滤,回收滤液,低温挥去溶剂,100℃干燥1h后,冷却,精密称定,经计算桑白皮的得油率为3.10%。
1.3试剂
脂多糖(sigma);醋酸地塞米松片,国药准字H12020686,生产批号13050102,(天津天药药业股份有限公司);生理盐水,国药准字H20003438,(河南科伦药业有限公司);小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6ELISA试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司);
主要溶液配制(1)LPS溶液:用生理盐水配成2mg/ml的溶液并于4℃保存备用。混匀后分装,置于-20°C避光保存。(2)肺泡灌洗液的配置:(氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸二氢钾0.24g、磷酸氢二钠1.44g)将以上溶质在800ml双蒸水中溶解,调节pH至7.2-7.4,然后用双馏水定容至于1L,高压灭菌,置于4°C保存。
1.4仪器:BioMate3S紫外分光光度计(ThermoFisherScientific);AB204-N万分之一精密分析天平(METTLERTOLEDO);Centrifuge-5804R小型高速低温冷冻离心机(Eppendorf公司);iMARK型酶标仪(美国BIO-RAD)。
2实验方法
2.1动物分组及给药剂量
实验分组:动物按体重和性别随机分为5组,分别为空白组、CMC-Na组、LPS组、LPS+CMC-Na组、脂肪油组。
给药剂量:按脂肪油组分得率与水煎液中剂量相当折算。对照组分别给予等体积的蒸馏水和0.5%CMC-Na溶液。
给药方法:均采用灌胃给药,给药体积为1.0mL∙100g-1,给药期间自由进食、饮水。此外,考虑到桑白皮脂肪油不溶于水,因此,脂肪油用0.5%CMC-Na溶液配制。
2.2动物模型建立
实验小鼠在动物房适应喂养1周,随机将其分为5组,每组12只小鼠。连续灌胃给药20天,末次给药后1h,除空白组和CMC-Na组给予等量生理盐水,其它组动物经小鼠鼻腔滴注给予5mg/kgLPS。LPS滴注后6h进行相关指标测定。
2.3小鼠肺水肿的检测
眼球放血处死动物后迅速分离右肺,PBS清洗1次,用滤纸吸干表面水分,电子天平称取肺湿重后将右肺置70℃恒温箱中,72h后称重获得干重,计算肺湿重/干重的比值(W/D),衡量肺水肿严重程度。
2.4肺泡灌洗液的收集
LPS滴注后6h,眼球放血处死小鼠后,切开颈部皮肤,钝性分离颈部组织并暴露气管,气管插管后用1.5ml冰冷的肺泡灌洗液反复灌洗3次后抽出灌洗液,约90%的灌洗液可被回收,最终收集到气管肺泡灌洗液(BALF)。收集到的灌洗液4℃,3000rpm,离心10分钟,收集上清液并置于-80℃的冰箱中保存等待进行细胞因子检测。
2.5 肺组织病理学检测
LPS滴注后6h,处死小鼠,小心取出肺左上叶并用生理盐水洗净表面血液,用10%甲醛固定,乙醇梯度脱水,石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察肺部组织病理变化。
2.6 BALF中细胞因子测定
按照小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6ELISA试剂盒说明书操作,并用酶标仪在波长450nm处测OD值,根据样品OD值检测BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。
2.7 统计方法
实验数据用均数±标准差(±s)表示,用SPSS18.0统计软件处理数据,各组间比较采用单因素方差分析(One-WayANOVA),P<0.05表示有显著性意义,P<0.01表示有极显著性意义。
3结果
3.1桑白皮脂肪油组分对肺湿重/干重的影响
与空白对照组、CMC-Na组相比,模型组和CMC-Na+LPS组肺湿重/干重比值明显升高(P<0.01),与CMC-Na+LPS组相比,脂肪油组可显著降低肺湿重/干重比值(P<0.05),提示脂肪油组分可降低肺湿重/干重比值,具有减轻肺水肿作用。结果见表1,图1。
表1桑白皮脂肪油组分对肺湿重/干重的影响(±s,n=6)
组别 给药剂量(mg∙kg<sup>-1</sup>) 肺湿重/干重
空白组 10mL 4.26±0.35
CMC-Na组 10mL 4.27±0.25
模型组 10mL 5.06±0.12**
CMC-Na+LPS组 10mL 4.99±0.54//
脂肪油组 119.6 4.64±0.16&
模型与空白组**p<0.01,CMC-Na+LPS组与CMC组比,//P<0.01,脂肪油组与CMC-Na+LPS组相比,&&P<0.01
3.2桑白皮脂肪油组分对BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6的影响
与空白对照组相比,模型组和CMC-Na+LPS组小鼠BALF中的TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著增高(P<0.01),表明造模成功;与CMC-Na+LPS组相比,脂肪油组可显著降低小鼠BALF中的TNF-α、IL-1β、IL-6含量(P<0.05)。脂肪油组分可显著降低TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子含量。结果见表2,图2-4。
表2桑白皮拆分部位对肺泡灌洗液中炎症因子表达的影响(±s,n=6)
组别 给药剂量(mg∙kg<sup>-1</sup>) TNF-α IL-1β IL-6
空白组 10mL 343±82 128±33 105±16
CMC-Na组 10mL 347±72 129±31 108±18
模型组 10mL 834±181** 338±53** 188±36**
CMC-Na+Lps组 10mL 830±181// 341±48// 192±38//
脂肪油组 119.6 655±146& 274±39& 155±23&
模型与空白组**p<0.01,CMC-Na+LPS组与CMC-Na组比,//P<0.01,脂肪油组与CMC-Na+LPS组相比,&&P<0.01。
3.3桑白皮脂肪油组分对小鼠肺组织病理改变的影响
光镜下显示,正常组、CMC-Na组肺泡腔清晰,结构完整,肺间隔均匀,肺泡壁光滑,肺泡腔及间质内无渗出物。肺组织无明显病变;模型组、CMC-Na+LPS组可见肺泡间隔增宽,间质水肿,毛细管扩张、充血、炎细胞浸润,部分肺泡断裂、内有水肿液聚集,肺组织破坏严重;而桑白皮脂肪油组分对肺组织病理学变化都有所缓解。见图5。
桑白皮脂肪油组分具有抗炎作用,但其对ALI有无治疗或改善作用目前还不清楚。此外,鉴于炎症是多因素的、极复杂的病理过程,因此,还有待于进一步从分子水平上揭示中药抗炎的机制。本文以脂多糖诱导小鼠建立急性肺损伤模型,探讨桑白皮脂肪油组分对炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6分泌的影响,以确定桑白皮脂肪油组分抗炎作用及其机制,为中药的创新及进一步的开发和利用打下良好的基础。

Claims (3)

1.桑白皮脂肪油组分在制备治疗急性肺损伤药物中的应用。
2.桑白皮脂肪油组分在制备治疗急性肺损伤药物中的应用,其特征在于:所述桑白皮脂肪油是将精密称取的干燥至恒重的桑白皮粉末过60-80目筛并置于滤纸筒内,将滤纸筒置于索氏提取器中,然后加入桑白皮粉末重量8-12倍量的石油醚,在温度为60~90℃时回流提取5-7h;将提取液放冷至室温,过滤并收集滤液,将收集到的滤液置于已干燥至恒重的蒸发皿中,水浴挥去溶剂,在温度为100℃时干燥1h,移置于干燥器中,冷却30-40min,即得桑白皮脂肪油。
3.根据权利要求2所述的桑白皮脂肪油组分在制备治疗急性肺损伤药物中的应用,其特征在于:所述滤纸为脱脂滤纸。
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