CN115536725A - 一种贝母成分的提取方法及抗支气管炎与copd的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于治疗、缓解或预防急慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病药学技术领域，具体而言，本发明涉及一种瑟文型异甾体生物碱单体，具有式Ⅰ结构式的化合物去氢鄂贝定碱的提取方法及其在治疗、缓解或预防急慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病中的用途。本发明通过体外在烟雾提取物（CSE）对人正常支气管上皮细胞（BEAS‑2B）活性氧、脂质氧化产物丙二醛、凋亡的影响以及抗自然凋亡活性评价，发现式Ⅰ结构所示的化合物对CSE引起的BEAS‑2B细胞损伤具有显著的治疗作用。该化合物用于制备治疗、缓解或预防急慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病药物具有良好的开发应用前景。式Ⅰ：
Description
技术领域
本发明属于防治急慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病作用的化合物, 涉及一种瑟文型异甾体生物碱单体去氢鄂贝定碱的提取方法及应用，属于呼吸系统相关的药物领域。
背景技术
急慢性支气管炎（AACB）是指气管、支气管黏膜及其周围组织的急性或慢性非特异性炎症。其中急性支气管炎起病较急，常发病于寒冷季节或气温突然降低时，若久治未愈或治愈后仍反复发作，则有可能发展为慢性支气管炎，伴有长期、反复、逐渐加重的咳嗽，部分加重者则可能演化成其他疾病。慢性阻塞性肺疾病（COPD）就是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎，可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭的常见慢性疾病。全球40岁以上人群的发病率已高达9%~10%。支气管炎和慢性阻塞性肺病是呼吸系统最常见的两种疾病，是呼吸道及肺脏内的异常炎症反应所造成内体活性氧的增加，进而引起细胞凋亡的一系列复杂机制，则兼具不可逆性气道阻塞。目前普遍认为是在环境和遗传因素相互作用的多基因疾病。
目前西药对抗呼吸道疾病主要通过对症治疗合并抗感染治疗，起效快，但容易复发，病程反复，且多药联用副作用大、长期用药患者经济负担较重。在当代绿色大健康背景下大众对于安全有效的天然药物的需求广泛存在，而天然新药开发这块尚属空白。贝母作为有临床应用百年历史的珍贵药材，其药效物质基础研究还在大力发展，而其活性成分生物碱有被分离得到，可对其药效应用开发进行实验验证，拓宽了贝母属植物的新应用病症范围，为安全有效的防治急慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病作新药物的开发提供了可靠的方向和基础。
发明内容
本发明涉及一种瑟文型异甾体生物碱去氢鄂贝定碱的提取方法及其在制备防治急慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病药物中的用途。
本发明的目的在于：针对现有技术存在的问题，提供了一种瑟文型异甾体生物碱去氢鄂贝定碱的提取方法。
本发明的目的在于：提供一种具有防治急慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病用途。但不限于上述两种疾病的瑟文型异甾体生物碱去氢鄂贝定碱。
本发明的另一个目的在于：提供一种瑟文型结构的异甾体生物碱化合物在药学上可以接受的盐的防治急慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病用途。但不限于上述两种疾病。
本发明上述的目的通过以下的技术方案实现：
本发明提供一种具有瑟文型结构的异甾体生物碱化合物去氢鄂贝定碱，其结构式如下所示：
实验证明, 通过试验证明了去氢鄂贝定碱对CSE引起BEAS-2B细胞体内活性氧、脂质氧化产物丙二醛、以及凋亡情况的作用。实验证明去氢鄂贝定碱能降低CSE引起BEAS-2B细胞活性氧增多、丙二醛增加、以及凋亡和自然凋亡的。与文献报到的其它药物相比，效果显著。
以下通过实例对本发明进一步详细的说明，但本发明发保护范围不受具体实施的任何限制，而是由权利要求加以限制。
附图说明
图1为去氢鄂贝定碱分别在10、20、40 μM对CSE诱导的BEAS-2B细胞内活性氧的抑制作用。
图2为去氢鄂贝定碱分别在10、20、40 μM对CSE诱导的BEAS-2B细胞丙二醛的抑制作用。
图3为BEAS-2B细胞自然凋亡，CSE诱导的BEAS-2B细胞凋亡及去氢鄂贝定碱分别在1、2、5、10、20、40 μM时对细胞凋亡的抑制作用。
具体实施方式
实施例1：去氢鄂贝定碱的提取方法：
方法：将瓦布贝母干燥鳞茎打成粉，用90%乙醇连续回流4 h，过滤，滤液减压浓缩。浸膏用2%HCl溶解，过滤，滤液用石油醚萃取脱脂后，用浓氨水调至pH=10，依次用二氯甲烷和水饱和正丁醇萃取，减压浓缩，分别得到二氯甲烷层提取物和正丁醇提取物。二氯甲烷提取物用硅胶柱层析分离，分别用石油醚-丙酮-二乙胺（20：1：0.1~1：5：0.1）、二氯甲烷-甲醇-二乙胺（2：1：5‰），共得到7个部分（Frs.1~7）。Fr.2经硅胶柱反复层析分离得到Fr.2-1~2-3，Fr.2-2经反相制备色谱得到去氢鄂贝定碱。
实施例2：DCFH-DA荧光探针测定BEAS-2B细胞内活性氧（ROS）的含量。
方法：取对数生长期BEAS-2B细胞，按5×105个/孔接种于6孔板，正常条件下孵育24h至70%汇合度时，加入基础培养基稀释的CSE培养液，另设阳性对照组，每个浓度设置3个复孔。24h后，按照1:1500用基础培养基稀释DCFH-DA，去除细胞培养上清并用PBS清洗两次后，按照500 μL/孔加入稀释好的DCFH-DA探针，阴性对照组加入同体积空白培养基，37℃黑暗情况下孵育30min。去除上清，用无菌PBS轻轻清洗细胞3次以充分去除未结合的荧光探针以免荧光背景过高，消化收集, 1200 g/min离心4 min收集细胞沉淀，加入200 μL PBS重悬细胞，避光等待上机检测。用FITC参数直接检测。计算荧光强度值并进行比较。
结果: CSE的干预会显著升高BEAS-2B细胞中活性氧的含量，去氢鄂贝定碱对CSE引起BEAS-2B细胞中活性氧的增加有抑制作用。在不同剂量的去氢鄂贝定碱作用下，各给药组的荧光强度均有显著下降。在40 μM剂量下可有效降低细胞中的活性氧生成。
实施例3：膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）水平变化的测定。
方法：取对数生长期BEAS-2B细胞，按照5×105个/孔接种于6孔板，正常条件下孵育24 h至70%汇合度时，加入基础培养基稀释的CSE培养液，另设对照组，每个浓度设置3个复孔。24 h后用PBS洗涤细胞样品一次，按每107/mL个的比例加入RIPA冰浴裂解30 min后12000 r/min 4℃离心10 min，取上清作为后续样品。按照试剂盒说明书配制反应体系沸水浴15 min后1000 r/min 室温离心10min，取200 μL上清至新96孔板中于540 nm处测定吸光度，并计算样品中的丙二醛含量（μM/mg）。
结果：CSE的干预会显著升高BEAS-2B细胞中丙二醛的含量，造成细胞的氧化损伤。去氢鄂贝定碱在20μM时能下调细胞中的丙二醛含量，40μM时效果更佳。
实施例4：Annexin V& PI双染法测定BEAS-2B细胞的凋亡情况。
方法：取对数生长期BEAS-2B细胞，按照1×106个/孔接种于6孔板，正常条件下孵育24h至70%汇合度时，另设对照组、单染组、实验组。加入基础培养基稀释的CSE培养液，24h后吸取培养板中的上清液转移至微型管中保存，用PBS洗细胞2次，收集清洗液保存。用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞2min，用完全培养基终止消化，将上清液、PBS、细胞悬液转移至离心管中，一并加入。在1,200 rpm，离心4 min，弃上清，重复本步操作一遍。加入预先配好的1×Annexin V Binding Solution，制成终浓度为1×106个/ml的细胞悬液。取100 μl细胞悬液，加入到新的Tube中, 避光下向细胞悬液中加入5 μl Annexin V, FITC结合物，再加入5 μl的PI Solution。在室温下避光培养15 min。加入400 μl 1×Annexin VBinding Solution，在 1 h内避光等待上机检测。
结果：去氢鄂贝定碱仅在1μM就已经有较好的抗CSE诱导的凋亡作用，在1、2、5、10、20、40 μM的凋亡率均低于10%，具有较好的抑制CSE引起的细胞凋亡，与正常组相比还可以抵抗细胞的自然凋亡。
由上述实例表明，本发明的化合物去氢鄂贝定碱对防治急慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病有较好的作用。
以上通过实例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限制。
Claims (6)
1.一种瑟文型异甾体生物碱去氢鄂贝定碱的提取方法及其在制备治疗、缓解或预防慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病药物中的用途，其特征在于，所述的贝母属瑟文型异甾体生物碱去氢鄂贝定碱，其结构如式I所示：
式I
。
2.根据权利要求1所述的贝母属瑟文型异甾体生物碱去氢鄂贝定碱, 其特征在于，去氢鄂贝定碱的提取方法。
3.根据权利要求1、2所述的贝母属瑟文型异甾体生物碱去氢鄂贝定碱或其在药学上可以接受的盐及其构成的制剂用在治疗、缓解或预防慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病的用途。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的复方药物中所含去氢鄂贝定碱作为主要成分或非主要成分用于治疗、缓解或预防急慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病。
5.根据权利要求4所述瑟文型异甾体生物碱化合物去氢鄂贝定碱在制备用于治疗、缓解或预防包括理化因素和生物感染引起的急慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病的药物用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所诉的疾病包括但不限于急慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病。
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| CN202211049580.4A CN115536725A (zh) | 2022-08-30 | 2022-08-30 | 一种贝母成分的提取方法及抗支气管炎与copd的用途 |
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-
2022
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