CN104666828A - 贝母生物碱在制备预防或治疗慢性呼吸系统疾病中新用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了贝母生物碱在制备预防或治疗慢性阻塞性肺病的新用途。贝母生物碱中含有的单体化合物包括川贝酮、西贝碱、西贝碱氮氧化物、西贝碱苷、伊贝碱、伊贝碱苷、异浙贝甲素、异浙贝甲素氮氧化物、贝母辛、梭砂贝母碱、贝母甲素和贝母乙素。本发明的贝母生物碱能够显著地提高慢性阻塞性肺病的肺功能、阻止肺气肿的形成、改善肺部病理状况、减少肺部及外周血液炎症因子水平、调节肺部氧化因子作用和基质金属蛋白酶活性。本发明的贝母生物碱质量稳定，使用安全，易于控制，且制备方法简单，便于大生产和临床使用。

Description

贝母生物碱在制备预防或治疗慢性呼吸系统疾病中新用途

技术领域

本发明涉及贝母生物碱在慢性疾病中的一种新用途，具体涉及到贝母生物碱在制备预防或治疗慢性阻塞性肺病（COPD）的药物中的应用，属药物领域。

背景技术

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一种慢性呼系统疾病，2001年4月美国国立心、肺、血液研究所（NHLBI）和世界卫生组织（WHO）共同发表了《慢性阻塞性肺疾病全球倡议》（Global initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，GOLD），并于2014年做了修订（Rabe KF, et al. Global strategy for the diagnosis, management and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2007，176：532-555）；GOLD将COPD定义为：COPD是一种可以预防和治疗的疾病，可伴有一些显著的肺外效应，这些肺外效应与患者疾病的严重性相关。COPD是一种具有气流受限特征的疾病，气流受限不完全可逆、呈进行性发展，与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。COPD的慢性气流受限是由小气道疾病（阻塞性细支管炎）和肺实质破坏（肺气肿）共同造成的，COPD主要累及肺脏，但也可引起全身的不良效应。COPD发病率高、致残率高、危害性大，病程中反复急性加重是导致患者肺功能下降、劳动能力丧失、呼吸肌疲劳的主要原因，如何减少急性加重、延缓肺功能下降、改善患者生存质量，减少致残成为目前国际上研究的热点。

COPD是一种严重危害民众身体健康的疾病，目前居全球死亡原因的第4位，且发病率与死亡率仍在上升。COPD是发达国家最常见的慢性疾病，在发展中国家情况更是不容乐观，呈爆发趋势。在我国，COPD同样是严重危害人民群体健康的重要慢性呼吸系统疾病，不同地区之间、城乡之间的COPD患病率存在显著差别，而且发病率之高十分惊人。城市人口十大死因中呼吸疾病（主要是COPD）占13.89％，居第4位，在农村占22.04％，居第1位，全国每年因COPD死亡的人数达100万，致残人数达500-1000万。近年来，我国COPD的发病率与死亡率仍然呈上升趋势，近期有研究对我国7个地区成年人群进行调查表明，COPD患病率占40岁以上人群的8.2％。COPD不仅严重损害了人民群众的健康，还给社会带来了沉重的经济负担。根据世界银行/世界卫生组织发表的研究，预计2020年COPD将排在死亡原因的第3位，经济负担的第5位（World Bank/WHO Global Burden of Disease Study. World Health Organization. Available from URL: http://www.who.int/topics/global_burden_ of_ disease）。由于其发病率高、致残率高、死亡率高以及疾病严重的经济负担，已经引起了各国相关工作者的极大关注和世界各国的重视。

COPD的病因目前尚不完全明确，通过研究发现多种因素与COPD的发病率增高有关，如吸烟、空气污染等。大气污染可刺激气道产生炎症，成为COPD的诱因，随着我国空气污染的加重，其患病率将会进一步增加。

目前，COPD的临床治疗药物主要包括β2受体激动剂、糖皮质激素（ICS）、M3受体拮抗剂、磷酸二酯酶4（PDE-4）抑制剂等。GOLD推荐的临床用药为长效β2受体激动剂和吸入ICS，但是长效β2受体激动剂仅能改善COPD症状，ICS有非常严重的副作用，GOLD推荐不能长期使用。长期的临床试验也显示，现有的治疗药物并不能改变患者肺功能下降的趋势，也无法降低死亡率（The Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease 2014. Workshop report: global Strategy for the diagnosis, management and prevention of chronic obstructive pulmonary disease (updated 2014). Available from URL: http://www.goldcopd.org/uploads/users/files/GOLD_Report2014_Feb07.pdf）。因此，对COPD治疗药物的开发具有迫切的社会应用需求。

贝母是疗效确切的用于肺部疾病治疗的常用中药之一。经过成分研究发现，贝母生物碱为其活性成分。以前大量的研究都是证实贝母生物碱的传统的镇咳、祛痰、平喘等药理活性（颜晓燕等，暗紫贝母及浙贝母醇水提取物镇咳、祛痰及平喘作用比较研究，中国实验方剂学杂志，2012，18:250-254）。

目前尚未有关贝母生物碱在治疗和预防慢性阻塞性肺病方面的报道。

发明内容

本发明技术方案的主要目的在于提供从贝母中提取得到的贝母生物碱的新用途。

本发明提供了在预防或治疗慢性阻塞性肺病药物中的用途。

本发明中，所述的慢性阻塞性肺病是指一种以气流受限为特征的疾病，临床特征包括呼气气流减少、肺用力排空缓慢，气喘，咳嗽和咯痰，并伴有慢性气道阻塞及肺部过度膨胀，发病时同时出现慢性阻塞性支气管炎和阻塞性肺气肿，包括但不限于。

本发明中，所述的慢性阻塞性肺病为慢性阻塞性支气管炎、阻塞性肺气肿或慢性阻塞性肺炎，末细支气管远端部分（包括呼吸性细支气管、肺泡管、 肺泡囊和肺泡）膨胀，并伴有气腔壁的破坏，包括但不限于。

本发明中，所述的贝母生物碱中总生物碱含量以西贝碱计为0.05 -100%W/W。

本发明中，所述贝母总生物碱中含有西贝碱、川贝酮、西贝碱苷、伊贝碱、伊贝碱苷、西贝碱氮氧化物、异浙贝甲素、异浙贝甲素氮氧化物、贝母辛、梭砂贝母碱、贝母甲素和/或贝母乙素生物碱化合物。

本发明中，所述贝母生物碱是由如下方法制备的：

取贝母，粉碎或不粉碎，碱水溶液浸润或不浸润，用氯仿、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、酸水溶剂中的一种或两种以上的混合溶剂提取，真空干燥，进行或不进行分离纯化而得到的贝母总生物碱，干燥，即得贝母总生物碱。

本发明中，所述贝母来源主要包括《中华人民共和国药典》2010年版一部中川贝母（Fritillaria cirrhosa D.Don）、暗紫贝母（Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia）、甘肃贝母（Fritillaria przewalskii Maxim.）、梭砂贝母（Fritillaria delavayi Franch）、太白贝母（Fritillaria taipaiensis P.Y.Li）、瓦布贝母（Fritillaria unibracteata Hsiao et K. C. Hsia var. wabuensis (S. Y. Tang et S.C. Yue) Z. D. Liu, S. Wang et S. C. Chen）等变种和栽培品、浙贝母（Fritillaria thunbergii Miq.）、平贝母（Fritillaria ussuriensis Maxim.）、新疆贝母（Fritillaria walujewii Regel）、伊犁贝母（Fritillaria pallidiflora Schrenk）、湖北贝母（Fritillaria hupehensis Hsiao et K.C. Hsia），以及分布于四川、云南、西藏、甘肃、青海、陕西、浙江、湖北、重庆、新疆、黑龙江、河北等省，来源于百合科贝母属Fritillaria L.植物的鳞茎或地上部分。

本发明中，所述的药物为注射剂、口服制剂、鼻腔给药制剂或局部给药制剂。

其中，药物的剂型不限于此，按上述药用原料与制药上常用的药用载体，如赋形剂或辅料可以混合制成注射剂、冻干粉针剂、喷鼻剂、注射微球、脂质体、片剂、胶囊剂、水剂、散剂、糊剂、喷雾剂、气雾剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊、滴丸剂、凝胶剂、贴片、膏剂等及其可以接受的缓控释制剂。

制备含有特定活性成分的各种药物组合物的方法对本领域技术人员而言是已知的，或根据本说明书是显而易见的。

本发明提供了贝母生物碱制备预防或治疗慢性阻塞性肺病（COPD）的新用途。贝母生物碱中含有的单体化合物川贝酮、西贝碱、西贝碱苷、伊贝碱、伊贝碱苷、西贝碱氮氧化物、异浙贝甲素、异浙贝甲素氮氧化物、贝母辛、梭砂贝母碱、贝母甲素和贝母乙素。本发明的贝母生物碱能够显著地提高慢性阻塞性肺病的肺功能、阻止肺气肿的形成、改善肺部病理状况、减少肺部及外周血液炎症因子水平、调节肺部氧化因子作用和基质金属蛋白酶活性。本发明的贝母生物碱质量稳定，使用安全，易于控制，且制备方法简单，便于大生产和临床使用。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1是大鼠BALF中细胞分类计数的涂片。

图2是终末细支气管粘膜上皮细胞和纤毛的坏死脱落程度及终末细支气管的粘液分泌的HE切片。

图3是大鼠肺组织HE切片。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1　本发明贝母总生物碱的提取

取贝母粉末适量，碱水溶液浸润，用适量的溶剂进行提取直至无生物碱，减压浓缩，45℃真空干燥，得粗提物。粗提物用适量酸液溶解，酸液用石油醚适量萃取三次，用碱水调PH值至碱性，用氯仿适量萃取四次，置于真空干燥箱内以45℃干燥72h，得到贝母总生物碱提取物。

实施例2  贝母总生物碱提取物中总生物碱含量的测定

1. 对照品溶液的制备

精密称取西贝碱对照品，加三氯甲烷置水浴上微热使溶解，制成每1 ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。

2. 标准曲线制备

精密量取对照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6与1.0ml分别置25ml具塞试管中，分别补加三氯甲烷至10ml，精密加蒸馏水5ml，加0.05％溴甲酚绿缓冲液2.0ml，密塞，剧烈振摇后，移入至分液漏斗中，静置30分钟。分取三氯甲烷层，以干燥滤纸滤过，取续滤液，以相应试剂为空白，照紫外分光光度法，在415nm的波长处测定吸光度，绘制标准曲线。

3. 供试品溶液的制备

取按实施例1制备的提取物适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液3ml，浸润1h，加三氯甲烷-甲醇（4∶1）混合溶液20ml，80℃水浴回流提取2h，放冷，滤过，用适量混合溶液洗涤药渣2～3次，洗液与滤液合并于100ml量瓶中，加混合溶液至刻度，摇匀。精密量取2ml，置25ml具塞试管中，水浴蒸干，精密加入三氯甲烷10ml使溶解，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加蒸馏水5ml”起，依法测定吸光度，计算出总生物碱的含量。

经含量测定，按实施例1提取方法所得到的贝母总生物碱提取物中总生物碱含量以西贝碱计算，结果为0.033%～99.84%。

实施例3　本发明贝母生物碱中单体化合物的含量测定

1. 混合对照品储备液的制备

分别精密称取自制生物碱类对照品西贝碱、川贝酮、西贝碱氮氧化物、异浙贝甲素、异浙贝甲素氮氧化物、贝母甲素、贝母乙素、贝母辛和梭砂贝母碱适量，置 5ml量瓶中，加甲醇至刻度，振摇使混合均匀，配制成混合对照品储备液。

2. 供试品溶液的制备

收集按实施来源不同的贝母药材样品，按实施例1中生物碱的提取方法制备得到贝母生物碱，取适量提取物，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液3ml，浸润1h，加三氯甲烷-甲醇（4∶1）混合溶液20ml，80℃水浴回流提取2h，放冷，滤过，用适量混合溶液洗涤药渣2-3次，将滤液减压回收至干，加甲醇溶液溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。进液相前用0.45μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

3. 色谱条件

kromasil-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙睛(A)与0.2%三乙胺溶液(B)；流速1.0ml/min；检测器为SEDEX75蒸发光散射检测器，载气压力为 3.6Bar，漂移管温度为40℃；进样量为20μl；柱温为35℃。线性梯度洗脱程序：0—60min，10%A—100%A。

 4. 结果：

从表3-1中可见，6批不同的贝母生物碱提取物中，贝母总生物碱中含有西贝碱、川贝酮、伊贝碱、西贝碱苷、伊贝碱苷、西贝碱氮氧化物、异浙贝甲素、异浙贝甲素氮氧化物、贝母辛、梭砂贝母碱、贝母甲素和/或贝母乙素等可测定的生物碱化合物。

实施例4  本发明药物组合物的制备

取实施例1-3制备得到的贝母生物碱，加上可溶性淀粉，湿法制粒，即得颗粒剂。

实施例5  本发明药物组合物的制备

取实施例1-3制备得到的贝母提取物，再加上糊精，制粒后，加上适量的硬脂酸镁，压片，即得片剂。

实施例6  本发明药物组合物的制备

取实施例1-3制备得到的贝母提取物，加上微晶纤维素，混匀后，装胶囊，即得。

以下通过具体药效学试验证明本发明的有益效果。

试验例1  贝母生物碱对大鼠COPD模型治疗作用

1 实验材料与方法

1.1 试验材料及药物的制备

本发明中所使用贝母生物碱来源：提取物按实施例1制备得到的贝母生物碱。

1.2 试验动物及分组

 清洁级雄性Wistar大鼠，体重180-220g，购自四川大学实验动物中心(合格证号：SCXK（川）2009-09)。实验动物环境设施符合Ⅰ级标准（许可证号：SCXK（川）2013-113）。室温20-25℃，相对湿度为60-80%，自然采光。自由进食饮水，以清洁级饲料喂养，饲料购自四川大学实验动物中心。适应性饲养一周后开始实验。大鼠按体重随机分组，分为贝母生物碱高剂量组（A组）、中剂量组（B组）、低剂量组（C）、醋酸地塞米松阳性对照组（D组）、模型组（E组）、空白对照组（F组），每组12只大鼠。造模开始后连续灌胃7周。贝母总生物碱和醋酸地塞米松均由1% Tween-80生理盐水溶液配制。

1.3 慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠模型的建立

A、B、C和D组分别于实验第1天和第20天经气管灌注小剂量内毒素（LPS，200μg/μl）。迅速注入LPS，迅速直立动物轻拍，使药物在支气管肺内分布均匀，清醒后随意进食。空白对照组F组气管滴入等量的生理盐水，注入内毒素后次日熏香烟，共40天，将天下秀香烟（川渝中烟工业有限责任公司，焦油量：10mg，烟气烟碱量：0.8mg，烟气CO：12mg）插入注射器针头上连续抽吸将烟雾注入仓内，仓中烟雾浓度为10%，熏烟1h后移出仓外。空白对照组置于染毒箱中不作熏烟处理。

1.4 观察及检测指标：

1.4.1 大鼠一般情况观察：

包括体重、精神状态、活动情况、进食进水情况、毛皮有无光泽，大小便情况、呼吸情况、口鼻部分泌物情况，有无咳嗽等。

1.4.2 大鼠肺功能测定：

肺功能测试前一天大鼠禁食不禁水。测试时用1.5％的戊巴比妥钠溶液50mg/kg腹腔注射麻醉，插管。用Buxco动物肺功能分析系统（Buxco Electronic, Incorporated, Sharon, CT, USA）进行测定和分析潮气量（TV）、呼气峰流速（PEF）、吸气峰流速（PIF）、第0.3s末用力呼气量与用力肺活量的比值（FEV0.3/FVC）、肺动态顺应性（Cydn）、用力肺活量（FVC）、每分钟通气量（MV）等。

1.4.3 血液和血清样本的收集及左支气管肺泡灌洗液（BALF）的制备：

测完肺功能以后，迅速打开大鼠胸腔，快速心脏采血，取血液于抗凝管中，4℃保存，用于测定血常规。

待心脏取血处死动物后，迅速开胸分离肺脏，用止血钳夹闭右主支气管，用留置针进行灌洗，以0.9%生理盐水10ml灌洗左侧肺脏，分3次进行灌洗，得支气管肺泡灌洗液8ml左右，回收率为80%。每次回收液体经过两层无菌纱布过滤于无菌离心管中，离心，并取下层沉淀细胞进行涂片，染色，计数。

1.4.4 支气管肺泡灌洗液（BALF）的细胞计数与分类计数

（1）细胞总数计数：混匀肺泡灌洗液，取适量BALF进行适当稀释，吸取稀释BALF 50μl至血细胞计数板行细胞计数。在低倍镜下，白细胞呈圆形，浆透亮，核呈紫黑色，稍有折光，借此特点可与杂质相区别。然后按公式计算：白细胞数=（4个大方格细胞总数/4）×104个/ml，总细胞数目=白细胞数（个/ml）×BALF体积。每个标本进行计数3次，取平均值。

（2）细胞分类计数方法：余BALF于4℃低温离心机中3500r/min离心10min。下层细胞沉淀涂片。室温晾干玻片，用甲醇固定10min，行H﹠E染色、干燥、镜检、封片。先用低倍镜观察全片，了解涂片染色、细胞分布情况，按细胞形态学特征分类计数巨噬细胞、中性粒细胞(形态学判断:胞质淡紫色、胞核深紫红色分叶状者为中性粒细胞；胞体较大，胞质灰蓝色，胞核呈肾形或马蹄形者为巨噬细胞)，求得巨噬细胞、中性粒细胞的比值(百分比)。

1.4.5 肺组织病理标本采集：

BALF制备完成后，迅速摘取各组大鼠的右肺中叶，4%中性多聚甲醛溶液固定，用于H﹠E染色和免疫组化染色。病理制作组织切片程序按常规脱水、浸腊包埋、切片，每一组织块连续4μm切片2张，行H﹠E染色，于光学显微镜下摄片观察组织形态学改变。

1.4.6 大鼠肺组织H﹠E病理切片的病理学分析及组织形态定量分析

光学显微镜观察H﹠E染色并进行病理切片的病理学分析：每只小鼠取3个HE染色切片，低倍镜（×100）下随机取5个视野（含有终末细支气管），对每个视野中的所有气管分别进行气管粘液分泌和气管纤毛脱落程度进行双盲评分。

光学显微镜观察H﹠E染色并进行病理切片的组织形态定量分析，包括平均内衬间隔（Mean linear intercept，MLI）、肺泡破坏指数(Destructive index，DI)、平均肺泡隔厚度(mean alveolar septal thickness，MAST)、平均肺泡数(mean alveolar number, MAN)。

2试验结果

2.1 大鼠整体状况的观察：

2.1.1 大鼠一般情况观察

空白对照组（F组）大鼠双目有神，营养良好，肌肉丰满，体格健壮，被毛柔顺有光泽，耳廓及四爪颜色淡红，反应灵敏、活跃，鼻部干净，呼吸音清，呼吸平稳，节律均匀。

模型组（E组）大鼠双目略显呆滞，形体较瘦，被毛蓬松直立，干枯无光泽，耳廓及四爪颜色淡白，精神倦怠，畏冷扎堆，不喜活动，饮食饮水量均减少，可闻及痰鸣音，部分大鼠大便稀溏，大鼠鼻部有少许白色粘性分泌物，甚至个别大鼠鼻部流血，有的呼吸表现为快而表浅，有的表现为慢而深。

阳性对照组（D组）大鼠双目略显呆滞，形体较瘦，被毛蓬松直立，干枯无光泽，耳廓及四爪颜色淡白，精神倦怠，畏冷扎堆，不喜活动，饮食饮水量均减少，可闻及痰鸣音，部分大鼠大便稀溏，大鼠鼻部有少许白色粘性分泌物，部分大鼠呼吸呈慢而深状况。

贝母生物碱低剂量治疗组（C组）大鼠双目略显呆滞，被毛蓬松直立，干枯无光泽，耳廓及四爪颜色较淡，精神倦怠，不喜活动，饮食饮水量减少，部分大鼠有扎堆现象，大便稀溏，可闻及痰鸣音，部分大鼠鼻部有少许白色粘性分泌物，有的呼吸表现为快而表浅，有的表现为呼吸慢而深。

贝母生物碱中剂量治疗组（B组）大鼠双目略显呆滞，被毛蓬松直立，干枯无光泽，耳廓及四爪颜色较淡，精神倦怠，不喜活动，饮食饮水量略有减少，部分大鼠有扎堆现象，大便稀溏，可闻及痰鸣音，个别大鼠鼻部有少许白色粘性分泌物，有的呼吸表现为快而表浅，有的表现为呼吸慢而深。

贝母生物碱高剂量治疗组（A组）大鼠双目有神，被毛较柔顺，光泽欠佳；耳廓及四爪颜色较淡，不喜活动，部分大鼠有扎堆现象，饮食饮水量略有减少，个别大鼠鼻部略潮湿，除个别大鼠可闻及痰鸣音，其余大鼠呼吸音清，节律均匀。

2.1.2 大鼠体重的变化

分别记录各组大鼠每天的体重，从中选取实验第1天、第10天、第20天、第30天、第40天及第50天的大鼠平均体重，结果见表1-1。

 各组大鼠在造模前（0周）体重无明显差异。从第10天至第50天，模型组大鼠体重明显低于正常组（P<0.05）；从第10天至第50天，贝母生物碱中剂量组较模型组体重增加明显（P<0.05），和空白对照组无显著性差异；而从第40天至第50天，贝母生物碱高、低剂量组较模型组体重增加明显（P<0.05）；贝母生物碱中剂量组较高剂量组体重无显著性差异；从第10天至第50天，阳性对照组的体重显著低于贝母生物碱中剂量组的体重（P<0.05），从第40天至第50天，阳性对照组的体重显著低于贝母生物碱高剂量组和模型组的体重（P<0.05）。以上结果表明，模型组由于烟熏刺激和LPS的作用等造模因素均能影响大鼠的消化系统，导致动物食欲降低，消化吸收功能降低从而体重增加缓慢；阳性药物地塞米松和贝母生物碱比较，具有较强的副作用，使大鼠的体重显著降低；与正常组比较，贝母生物碱高剂量组对大鼠的体重基本无影响，而高剂量的贝母生物碱对大鼠的体重增加速度与模型组相当，显著低于正常组，可推测高剂量贝母生物碱对大鼠的饮食及胃肠道基本没有改善作用。

2.2 大鼠肺功能测定结果

采用Buxco动物肺功能分析系统进行测定并分析各组大鼠的肺功能，检测指标包括潮气量（TV）、呼气峰流速（PEF）、吸气峰流速（PIF）、第0.3s末用力呼气量与用力肺活量的比值（FEV0.3/FVC）、肺动态顺应性（Cydn）、用力肺活量（FVC）、每分钟通气量（MV），结果见表1-2。

模型组大鼠肺功能各项指标均有改变， FEV0.3/FVC%、PIF、TV、Cdyn及MV明显低于正常组(P<0.05)，FRC和RV明显高于正常组(P<0.05)。贝母生物碱高剂量及中剂量组FEV0.3/FVC%、PIF、MV、TV、Cdyn、FRC和RV显著优于模型组和阳性对照组(P<0.05)，且与空白对照组相当，其作用成剂量依赖性。以上结果表明，贝母生物碱能够显著改善大鼠COPD模型的肺功能，且其作用成剂量依赖性；阳性对照组对大鼠COPD模型的肺功能基本没有改善。

2.3 大鼠BALF细胞计数及分类

对支气管肺泡灌洗液（BALF）的细胞计数与分类计数，结果见图1和表1-3。表1-3中给出了实验大鼠BALF液中的总白细胞计数和白细胞分类计数的结果。从表1-3中看到：BALF的回收率在80%左右，各组的BALF回收率没有显著性差异；贝母生物碱治疗组和空白对照组的BALF中红细胞极少见，模型组和阳性对照组BALF中易见红细胞，其原因是由于这两个组大鼠均有肺出血现象；COPD模型组的总白细胞计数值最高，贝母生物碱低剂量组和阳性对照组的总白细胞计数值略低于模型组，但无显著性差异；贝母生物碱高、中剂量组总白细胞计数值与空白对照组相当，显著低于模型组，这说明了高、中剂量的贝母生物碱对COPD有明显的抗炎效果。

白细胞分类主要为肺泡巨噬细胞，其次为中性粒细胞。肺泡巨噬细胞计数在各组均为优势细胞，百分比数据发现变化最大的是中性粒细胞的百分比。COPD模型组的中性粒细胞百分比与正常组相比明显的增高，差异非常显著(P<0.05)；贝母生物碱高剂量组、中剂量组和阳性对照组中性粒细胞百分比与空白对照组相比显著增高；贝母生物碱高、中剂量组和阳性对照组中性粒细胞百分比显著低于模型组；阳性对照组中性粒细胞百分比低于贝母生物碱高、中剂量组。由以上可知，贝母生物碱高剂量组具有显著的抗肺阻塞性肺炎的作用，其对COPD抗炎作用与阳性药物地塞米松相当。

 2.4 大鼠血液样本分析

大鼠心脏取血于抗凝管后，进行血常规测定，相关炎症细胞参数结果见表1-4。由表1-4可知，模型组的白细胞数、中间细胞和中性粒细胞都显著高于空白对照组，中性粒细胞百分比非常显著高于空白对照组；贝母生物碱高剂量组、中剂量组和阳性对照组的白细胞数、中间细胞和中性粒细胞都高于空白对照组；贝母生物碱高剂量组和中剂量的白细胞数、中性粒细胞数显著低于模型组，贝母生物碱低剂量组的白细胞数、中性粒细胞数略低于贝母生物碱高剂量组，但差异无统计学意义；而阳性对照组的白细胞数、中性粒细胞数以及中性粒细胞数与贝母生物碱高剂量组、中剂量组和模型组无显著性差异。由以上可知，贝母生物碱具有显著的抗炎活性，且其抗炎活性相当于阳性药物地塞米松。

 

2.5 大鼠肺组织病理学改变及组织形态定量分析

2.5.1 大鼠肺组织病理学改变

肺组织整体外观形态：

正常组大鼠两肺大小适中，淡粉肉色，外表光滑柔和，抽吸灌洗液时弹性良好；模型组大鼠两肺体积明显增大，暗红偏紫夹有点块苍白，外表粗糙略硬，弹性较差，肺组织可见明显实变坏死斑块；贝母生物碱高剂量、中剂量和阳性对照组组两肺体积无明显增大，颜色稍红略暗，绝大部分无紫瘀及苍白点块，表面基本光滑，弹性尚良。

大鼠肺组织HE染色光镜观察：

正常对照组：支气管粘膜上皮细胞排列整齐，支气管粘膜下未见明显炎细胞浸润，纤毛无损伤脱落，无粘液分泌；肺泡结构连续，肺泡壁完整，肺泡腔无扩大，且未见明显炎性细胞渗出（见图2）。

模型对照组：支气管粘膜上皮细胞明显变性坏死脱落及杯状细胞增生，支气管壁大量炎细胞浸润，纤毛大量脱落，肺泡腔及支气管内有炎性渗出物，有大量粘液分泌，肺泡腔可见巨噬细胞；肺泡壁大量被破坏，有的肺部有明显实变（见图2）。

贝母生物碱高剂量组：支气管粘膜部分上皮细胞变性，坏死，杯状细胞增生，支气管腔内有渗出物，支气管壁少量炎细胞浸润，肺泡腔内有少量炎性渗出物，部分肺泡扩张融合（图2）。

贝母生物碱中剂量组：支气管粘膜上皮细胞变性，坏死，脱落，杯状细胞生，管壁中度炎细胞浸润，粘液腺减少，肺泡腔内有炎性细胞渗出，部分肺泡扩张融合（图2）。

阳性对照组：支气管粘膜部分上皮细胞变性坏死脱落，杯状细胞增生，支气管内有渗出物及变性坏死物，肺泡腔内有炎性渗出物，易见巨噬细胞、部分肺泡扩张融合，支气管壁中度炎细胞浸润（见图2）。

对终末细支气管粘膜上皮细胞和纤毛的坏死脱落程度进行了评分，同时对终末细支气管的粘液分泌情况也进行了评分，结果见表1-5。由表1-5可知，模型组的终末细支气管粘膜上皮细胞和纤毛的坏死脱落程度及终末细支气管的粘液分泌显著高于空白对照组；贝母生物碱高、中剂量组的终末细支气管粘膜上皮细胞和纤毛的坏死脱落程度及终末细支气管的粘液分泌显著低于模型组，与空白对照组相当；贝母生物碱低剂量组的终末细支气管粘膜上皮细胞和纤毛的坏死脱落程度及终末细支气管的粘液分泌与模型组无显著性差异；阳性对照组的终末细支气管粘膜上皮细胞和纤毛的坏死脱落程度及终末细支气管的粘液分泌略低于模型组。可见，贝母生物碱能够显著改善终末细支气管粘膜上皮细胞和纤毛的坏死脱，且其效果显著优于阳性药物。

 

2.5.2 大鼠肺组织组织形态定量分析

大鼠肺组织组织形态定量分析结果见表1-6及图3。与空白对照组比较，模型组、阳性组和川贝母生物碱低剂量组的平均内衬间隔（MLI）、肺泡破坏指数（Dl）和平均肺泡隔厚度（MAST）显著增高，平均肺泡数（MAN）显著降低。阳性组的平均内衬间隔（MLI）、肺泡破坏指数（Dl）和平均肺泡隔厚度（MAST）略低于模型组，阳性组的平均肺泡数（MAN）高于模型组，但差异无统计学意义。川贝母生物碱高、中剂量组的平均内衬间隔（MLI）、肺泡破坏指数（Dl）和平均肺泡隔厚度（MAST）显著低于模型组、阳性组和低剂量组，川贝母生物碱高、中剂量组的平均肺泡数（MAN）显著高于模型组、阳性组和低剂量组，差异均有统计学意义。可见，川贝母生物碱可以显著改善肺组织病理状况，其作用明显优于地塞米松阳性药物。

 

试验例2  贝母提取物对COPD临床疗效评价

1实验材料与方法

1.1 试验材料及药物的制备

本发明中所使用的药物来源：提取物按实施例1制备得到的贝母生物碱。

1.2 研究设计

采用随机平行对照法，在武侯区社区医院呼吸内科选择住院患者205例，方案获得成都市武侯区社区医院伦理委员会批准并全过程跟踪。纳入的患者为已经确证为慢性阻塞性疾病，且无结核、肿瘤、矽肺、支气管扩张、心脏病等引起的慢性咳嗽喘息，严重心肺功能不全，合并心血管、肾、肺、造血系统等严重原发性疾病及精神病，妊娠或哺乳妇女，过敏体质或对多种药物过敏等。

退出标准：未按规定服药无法判定疗效；资料不全无法判定疗效、安全性；严重不良反应并发症，特殊生理变化等，难以继续治疗（不良反应者纳人不良反映统计）；使用影响疗效药物。

1.3 诊断标准

1.3.1 西医诊断参照《慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2007年修订版）》；

1.3.2 中医诊断参照《中医病证诊断疗效标准》

1.4 治疗方法

两组均连续治疗15d为1疗程

1.4.1 对照组：抗生素，头孢他啶，2.0g/次·天，再用一般的止咳化痰剂。

1.4.2 治疗组：贝母提取物0.15g/次·天，口服给药。

1.4.3 安慰剂组：给药为空白淀粉颗粒，不含其它药物。

1.5 观测指标

临床症状、TLC肺总量（L）、RV残气量（L）、FVC用力肺活量（L）、FEV第1秒钟用力呼吸容积（L）、MVV每分钟最大通气量（L/ S）、PEF最大呼气流量（L）、不良反应。

1.6 疗效判定

连续治疗2疗程，判定疗效，参照《中药新药临床研究指导原则》。显效：临床症状与体征消失或显著减轻恢复到发作前水平。有效：临床症状与体征减轻，基本恢复到发作前水平。无效：症状与体征无改善。

1.7 统计分析

采用SPSS 16.0统计软件，计量资料采用均值±标准差表示，组间比较用单因素方差分析和t检验，计数资料采用卡方检验。

2 结果

2.1 基本资料

纳人样本205例，分成三组，三组人口学资料及临床特征具有均衡性（P>0.05），见表2-1。

 2.2 临床疗效

连续治疗2疗程，临床疗效治疗组优于对照组和空白组（P<0.05）。由表2-2可知，治疗组痊愈、显效人数、总有效率显著多于对照组和空白组。可得出结论，贝母生物碱疗效显著优于阳性药物。

2.3 肺功能指标

连续治疗2疗程，相对于空白组，肺功能指标治疗组和对照组均有改善（P<0.05），且治疗组治疗组优于对照组。由表2-3可见，治疗组和对照组在TLC、RV、FVC、FEV1、MVV、PEF方面显著优于空白组，治疗组在TLC、RV、FVC、FEV1、MVV、PEF方面优于对照组。可见，贝母生物碱对肺功能的改善作用显著优于阳性药物组。

 由以上临床试验可知，贝母生物碱治疗慢性阻塞性肺病效果显著，且其治疗作用显著优于阳性药物，安全可靠。

Claims (9)

1.贝母生物碱在制备预防或治疗慢性阻塞性肺病药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物是治疗慢性阻塞性支气管炎、阻塞性肺气肿或慢性阻塞性肺炎的药物。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的药物是治疗呼气气流减少、肺用力排空缓慢，气喘，咳嗽和咯痰，并伴有慢性气道阻塞及肺部过度膨胀的药物。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的药物是治疗细支气管远端部分（包括呼吸性细支气管、肺泡管、 肺泡囊和肺泡）的膨胀，并伴有气腔壁的破坏的药物。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的用途，其特征在于：所述的贝母生物碱中总生物碱含量以西贝碱计为0.05-100%W/W。

6.根据权利要求1-4所述的用途，其特征在于：所述贝母生物碱中含有西贝（母）碱、西贝碱苷、川贝酮、西贝碱氮氧化物、异浙贝甲素、异浙贝甲素氮氧化物、贝母辛、梭砂贝母碱、伊贝碱、伊贝碱苷、贝母甲素或/和贝母乙素生物碱单体。

7.根据权利要求1-4任意一项所述的用途，其特征在于：所述提取物是由如下方法制备的：

取贝母，粉碎或不粉碎，碱水溶液浸润或不浸润，用氯仿、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、酸水溶剂中的一种或多种以上的混合溶剂提取，真空干燥，进行或不进行分离纯化而得到的贝母总生物碱，真空干燥，即得贝母总生物碱。

8.根据权利要求1-4所述的用途，其特征在于：所述的药物为注射剂、口服制剂、鼻腔给药制剂或局部给药制剂。

9.根据权利要求1-4所述的用途，其特征在于：所述的药物含有贝母生物碱，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备得到的制剂。