WO2014110936A1 - 一种美洲大蠊提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

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effluent
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water
american cockroach
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Inventor
耿福能
Original Assignee
四川好医生攀西药业有限责任公司
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/63—Arthropods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like

Definitions

  • the invention relates to the technical field of medicine, in particular to a method for preparing an extract of the American cockroach.
  • Periplaneta americana is an insect of the genus Insectidae, which is commonly known as " ⁇ ". Its medicine is contained in the "Shen Nong's Herbal Classic", which is listed as a Chinese product. "Taste: salty, cold; governance: blood stasis syndrome is cold and heat, broken accumulation, throat and throat, no cold inside.” " ⁇ ” is the first name of its common name in the "Compendium of Materia Medica", also known as stone ginger, snails; each place has its own different methods, such as: stealing oil, tea, stove, peas and so on.
  • Blattidae is a large family of insects that have lived on Earth for 320 million years, a creature that appeared in the same era as dinosaurs. Undoubtedly it is one of the most active, oldest and most successful insect groups in the world.
  • the problem to be solved by the present invention is how to provide a preparation method of the American cockroach extract, which can overcome the defects existing in the prior art, can significantly improve the traits of the American cockroach extract, and especially solve the finished product.
  • the drawbacks of deep color and heavy odor are enhanced to enhance the compliance of patients during treatment.
  • the American cockroach extract of the present invention has a good curative effect in the preparation of a medicament for treating wound repair.
  • An American cockroach extract characterized in that the preparation process of the extract comprises the following methods:
  • step 3 The filtrate obtained in step 2 is concentrated to a relative density of 1. 02 ⁇ 1. 25 (60 ° C measured), added to ethanol, allowed to stand, filtered;
  • the filtrate obtained in step 3 is recovered from ethanol to an alcohol-free taste, added with water, filtered or centrifuged;
  • the supernatant obtained in the step 4 is passed through a macroporous adsorption resin column, and the resin column is washed with pure water, and the effluent is collected until the ninhydrin reaction is negative;
  • step 6 Pass the effluent obtained in step 5 through a polyamide column, rinse the resin column with pure water, and collect the effluent until the ninhydrin reaction is negative;
  • the effluent obtained in the step 6 is concentrated under reduced pressure, dried, and pulverized.
  • the preparation method of the American cockroach extract comprises the following steps: 1. taking the American cockroach fresh worm, the dried worm or the degreased dry worm, picking up the impurities and the non-medicinal parts, and weighing the selected raw materials. , add acetone back to 2 - 4 times, add 2 - 5 times each time
  • Correction page (Article 9 1) Amount, each reflux 0. 5-1. 5 hours 3 ⁇ 4 to lj degreasing raw materials, acetone;
  • the filtrate obtained in step 2 is concentrated to a relative density of 1. 02 ⁇ 1. 25 (60 ° C measured), adding ethanol to the alcohol content of 55% ⁇ 90%, at - 5 ° C ⁇ 25 ° C static Set for 6 ⁇ 24 hours, filtered;
  • the filtrate obtained in step 3 is recovered from ethanol to a non-alcoholic taste, and water is added to 0.1 to 2 g of the original drug per ml, filtered or centrifuged;
  • the supernatant obtained in the step 4 is passed through a macroporous adsorption resin column, and the resin column is washed with pure water, and the effluent is collected until the ninhydrin reaction is negative;
  • step 6 Pass the effluent obtained in step 5 through a polyamide column, rinse the resin column with pure water, and collect the effluent until the ninhydrin reaction is negative;
  • the effluent obtained in the step 6 is concentrated under reduced pressure at 7 CTC or less, dried, and pulverized. Still further, a method for preparing an extract of the American cockroach, characterized in that the preparation method comprises the following steps:
  • Step 1 Take the American cockroach fresh insects, dried worms or dried defatted insects, pick up the impurities and non-medicinal parts; Weigh the appropriate amount of raw materials in Step 1 and add 3 times of acetone reflux, each time adding 8 - 12 Multiple times, each time reflux for 1 hour to get the degreased raw material, and the acetone is evaporated;
  • step 3 Reduce the filtrate obtained in step 2 to a relative density of 1. 02 ⁇ : 1. 15 (60 )), and add ethanol to an alcohol content of 75% to 85% at 0. ( ⁇ 15 °C to stand for 8 ⁇ 18 hours, filtered;
  • the filtrate obtained in step 3 is recovered from ethanol to a non-alcoholic flavor, and water is added to each milliliter equivalent to 0.5 to 2 grams of virgin drug, filtered or centrifuged;
  • step 5 Pass the supernatant obtained in step 4 through a macroporous adsorption resin column and rinse the tree with pure water.
  • Correction page (Article 9 1) a lipid column, collecting the effluent until the ninhydrin reaction is negative;
  • step 6 Pass the effluent obtained in step 5 through a polyamide column, rinse the resin column with pure water, and collect the effluent until the ninhydrin reaction is negative;
  • the preferred preparation method is that the filtrate in step 3 is concentrated to a relative density of 1.05 (measured at 60 ° C).
  • the adsorbent resin column of step 5 is a polar, weakly polar and non-polar macroporous resin.
  • the polyamide in the polyamide column has a particle size of from 100 to 200 mesh.
  • the present invention also provides an extract of the American cockroach prepared by the above method.
  • the present invention also provides an application of an extract of Periplaneta americana in the preparation of an induced solution for inducing differentiation of mesenchymal stem cells into epidermal cells.
  • the above-mentioned American cockroach extract can be added into a pharmaceutically acceptable auxiliary material to prepare a gel, a film coating agent, a patch, a tablet, a capsule, a soft capsule, an oral liquid, a dropping pill, a spray, a granule or an injection. And a variety of oral or external preparations.
  • the American cockroach extract obtained by the invention has good water solubility, light color, almost no odor, stable and reliable quality, high patient compliance, and good clinical promotion in treating various wounds and the like. Use value.
  • Correction page (Article 9 1) Amount, reflux for 1 hour each time, remove the acetone, add water and decoction for 3 times, add 5 times the volume of water per medicinal material, extract for 1 hour each time, filter; the filtrate is concentrated at 70 ° C under reduced pressure. Relative density 1.
  • the filtrate is decompressed to recover ethanol to a non-alcoholic taste, adding water to 1 gram of the original drug per ml, filtered; the filtrate passes through the HPD100 macroporous adsorption resin column, the resin column is rinsed with pure water, and the effluent is collected until the effluent The ninhydrin reaction was negative; the effluent passed through the polyamide column, and the resin column was washed with pure water, and the effluent was collected until the ninhydrin reaction was negative; the resulting effluent was concentrated under reduced pressure, dried, and pulverized. Light yellow American cockroach extract 3. 2 kg, no odor.
  • Correction page (Article 9 1) Allow to stand for 24 hours, filter; the filtrate is decompressed to recover ethanol to a non-alcoholic taste, add water to the equivalent of 2 grams of crude drug per milliliter, centrifugation; the supernatant is passed through the AB-8 type macroporous adsorption resin column, rinsed with pure water Resin column, collecting the effluent until the effluent ninhydrin reaction is negative; the effluent passes through the polyamide column, the resin column is rinsed with pure water, and the effluent is collected until the effluent ninhydrin reaction is negative; the resulting effluent is 79 °C Concentrated under reduced pressure, dried, pulverized, and obtained a light yellow American cockroach extract 2. 8 kg, no odor.
  • Test Example 1 The food group of the present invention induces differentiation of mesenchymal stem cells into epidermal cells.
  • Bone marrow is derived from normal patients with clinical bone marrow biopsy, no history of hematological diseases and family genetic disease, informed consent of patients
  • the American cockroach extract (hereinafter referred to as ML extract) is prepared by the method of Example 2.
  • D is p a s e I I
  • trypsin ethylenediaminetetraacetic acid
  • E D T A ethylenediaminetetraacetic acid
  • Blank group cultured in L-DMEM medium containing 10% FBS;
  • Inducing agent was added to the blank group (10-7 mol/L dexamethasone + 20 ng/mL EGF, +15 ng/mL bFGF + 1% ITS (insulin transferrin)); drug group: O. Olg/ml ⁇ MEM ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM
  • DMEM medium was diluted and mixed, then added to a test tube containing Ficoll lymphocyte separation solution, and centrifuged at 400 g for 30 min to collect mononuclear cells of the interface layer. The cells were washed twice with D- Hank's solution, and the cells were resuspended in DMEM containing 10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100 mg/L streptomycin, and placed in a volume of 37 ⁇ . Incubate in a 5% C0 2 , saturated humidity incubator.
  • the fluid was changed for the first time, the unattached cells were discarded, and the adherent cells were retained for further culture.
  • the cells were substantially filled with the bottom of the bottle, they were digested with 0.25 % trypsin + 0.02% EDTA.
  • the third generation mesenchymal stem cells were digested with 0.25% trypsin + 0.02% EDTA.
  • cytokeratin CK19 the indicator is a characteristic marker of epidermal cells
  • Test Example 2 Acute toxicity and median lethal dose of extracts to mice
  • Example 2 Extract dry powder, yellow brown powder, miso, easy to absorb moisture, soluble in water.
  • concentration of the extract solution was 0. lg/ml, 0. 2g/ml, 0. 4g/ml reddish brown clarified liquid, and the above samples were all provided by Sichuan Good Doctor Panxi Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Test environmental conditions This test application facility is carried out in an animal laboratory that meets the SPF (III) standard. Indoor room controlled by automatic air conditioning at 19 ⁇ 21°C, relative humidity control
  • Correction page (Article 9 1) At 50 ⁇ 65%.
  • the indoor air is regulated by an automatic ventilator. Manually control fluorescent lighting, 8 ⁇ 20 hours per day, 20 ⁇ 8 hours dark.
  • the experimental animals were kept in cages. The animals were no more than 5 per cage, free drinking water, regular full-price vocabulary, and regular quantitative feeding. The mice were fed 8g/20g bw every day at around 4pm.
  • mice Take 40 mice weighing 18 ⁇ 22g, male and female, randomly divided into 10 groups according to body weight, 4 rats in each group, free water, 6 hours after fasting, each group was 0. 4ml/10g 70%, 56%, 45% of the extract liquid was intragastrically administered, and the control group was intragastrically administered with the same volume of normal saline. The toxicity and death of the mice were observed after administration. The observation was carried out for 7 days, once a day. 1 :
  • mice Take a batch of mice, 60 mice weighing between 20 ⁇ 22g, male and female, randomly divided into 6 groups according to body weight, 10 in each group, fasting water for 6h 2g/kg, 27. 4g/kg, 24. 6g/kg, 22. 2g/kg, 19. 9g/kg, .Og/kg (NS 0.
  • mice After a large dose of ig mice, the mice were mostly active, prone, slow response to external stimuli, slight decrease in skin temperature, partial animal reflexes disappeared, respiratory rate slowed, amplitude weakened, until breathing Stop, die within 8 hours (see Table 1 for deaths in each group); Survival animals gradually disappear within 10 to 14 hours, return to normal state, activity, diet, and drinking water return to normal until survival No abnormalities occurred in 14 days; dead animals were dissected by autopsy, and all major organs were observed with the naked eye. Only a large amount of clear liquid was found in the gastrointestinal tract. No abnormalities were observed in the other organs, and the heart, liver and spleen were taken. The main organs of the lungs, kidneys, stomach and other organs were fixed with 10% formaldehyde, and pathological biopsy was performed. Discovery extraction
  • mice dose log count number of animals death number mortality probability group
  • mice weighing 18 ⁇ 22g, male and female were randomly divided into 5 groups according to sex and body weight, respectively, NS control group, American cockroach extract administration group, MEBO (Shantou Meibao Pharmaceutical Co., Ltd.) Apply to burns, burns, burns, etc., thickness less than 1mm) Control group.
  • the mice were placed in a holder, and the right hind paw area of the mouse was placed in a 55-inch constant temperature water bath for 15 seconds. Thereafter, every half hour, each group of mice was applied once in the right ankle. 3 times, 4. After 5 hours, the mice were sacrificed by cervical dislocation, and two were cut at the same site.
  • mice weighing 18 ⁇ 22g, male and female refer to the literature method.
  • the 2 cm ⁇ 2 cm asbestos paper was hollowed out on the back of the mouse, and 100 uL of water-free ethanol was dropped on a 20 mg cotton ball with a micropipette, placed in the exposed place, and the ignition was burned to cause a II degree burn model.
  • gender and burn area they were randomly divided into 5 groups: NS control group, American cockroach extract group, and MEBO control group. Each group was applied with a drug, and 30 Bid was continuously applied. The wound was cleaned before changing the dressing. The burn area and healing of the mice were observed.
  • the mice were photographed for 9 days and 15 days, respectively, and photographed with a digital camera.
  • the IPP 5.1 image analysis software package was used to measure the burn area of each group.
  • the test results were subjected to t test. The results are shown in Table 4.
  • the extract of the American cockroach prepared by the method provided by the invention has light color, light odor, and high content of a large amount of active ingredients such as free amino acids, nucleoside substances and a large amount of macromolecular proteins.
  • the extraction of the American cockroach can induce the differentiation of mesenchymal cells into epidermal cells, providing a safe and reliable source of seed cells for clinical treatment of tissues/organs with epithelial cells.
  • the American cockroach extract obtained by the specific extraction preparation method has low impurity
  • correction page (Article 91)
  • the color is light, the odor is light, and the content of a large number of active ingredients such as free amino acids, nucleosides, and a large amount of macromolecular proteins is high. It is clinically used as an inducer for stem cell differentiation, and has a good effect on treating skin burns and burns. It is convenient for clinical use and can be directly applied to the affected area.
  • the preparation method is simple, the cost is low, and the large-scale production is convenient, and has good clinical application and industrial application prospect.

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Abstract

本发明公开了一种美洲大蠊提取物及其制备方法，所述方法采用丙酮回流，水提，浓缩，向浓缩液中加入乙醇；回收乙醇，得滤液；取回收乙醇后的滤液通过吸附树脂柱，收集流出液至流出液茚三酮反应呈阴性；通过聚酰胺柱，收集流出液至流出液茚三酮反应呈阴性；浓缩、干燥。本发明还公开了该美洲大蠊提取物在制备定向诱导间充质干细胞分化成表皮细胞的诱导液中的应用。

Description

一种美洲大蠊提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域， 具体涉及一种美洲大蠊提取物的制备 方法。
背景技术
美洲大蠊（Periplaneta americana) 为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目 蜚蠊科大蠊属昆虫， 俗称 "蟑螂" ， 其入药始载于 《神农本草经》 ，. 其中把它列为中品， 谓 "味： 咸、 寒； 治： 血瘀证坚寒热、 破积聚、 喉咽闭、 内寒无子" 。 "蟑螂"为其俗名首见于 《本草纲目拾遗》 ， 也称其为石姜、滑虫；各地方有其不同的称法，如：偷油婆、茶婆子、 灶蚂子等。 蜚蠊科 (Blattidae)是一个庞大的昆虫家族， 在地球上已 生存了 3. 2亿年， 与恐龙属同一时代出现的生物。 无疑它是世界上生 命力最强、 最古老、 至今繁衍最成功的昆虫类群之一。
近几年来随着我国对传统中医药资源研宄开发的重视，有些学者 对这一几千年来无法根绝的害虫进行了应用方面的研究，并取得了可 喜的成就， 发掘出了这一传统意义上的害虫的正面价值。 以美洲大蠊 醇提物纯化制成的产品 "康复新液"， 在烧伤、 烫伤等外伤创面的良 好疗效。 发明专利 （专利号 03117804. 9 ) "美洲大 «药用浸膏提取工 艺"中用热 将美洲大蠊灭活后， 采用 80%乙醇回流提取、 回收乙醇 并进行油水分离， 醇提后药渣加入适量水 65〜75°C温浸提取， 药液 浓缩后进行油水分离， 合并醇提药液低于 75°C真空浓缩成浸膏; 发 明专利 （申请号 200610021993. 6) "美洲大蠊提 ¾ί物 含该提取物的 药物组合物及其制备方法"中美洲大蠊原料经石油醚脱脂后，采用水 提醇沉法或醇提水沉法制备浸膏等。
1
更正页 （细则第 9 1 条) 相关文献报道及相关发明专利中美洲大蠊提取物或成¾色泽较 深、 腥臭味较重。 某些患者使用过程中有抵触情绪， 甚至出现恶心、 呕吐等胃肠道不适的情况， 导致不能继续治疗， 延误病情。
发明内容
本发明所要解决的问题是：如何提供一种美洲大蠊提取物的制备 方法， 该制备方法能克服现有技术中所存在的缺陷， 能显著改善美洲 大蠊提取物性状， 特别是解决了成品色泽深、腥臭味重的弊端， 增强 患者治疗过程中的依从性。并且本发明的美洲大蠊提取物在制备治疗 创面修复的药物中有很好的疗效。
一种美洲大蠊提取物，其特征在于该提取物的制备过程包括如下 方法：
① . 取美洲大蠊鲜虫、干虫或经脱脂后的千虫， 称取适量， 加丙 酮进行回流， 得到脱脂原料；
② . 加水煎煮提取 2〜4次；
③ .将步骤②所得的滤液浓缩至相对密度 1. 02〜1. 25(60°C测）， 加入乙醇， 静置， 滤过；
④ .将步骤③所得的滤液回收乙醇至无醇味，加水，滤过或离心；
⑤ . 将步骤④所得的上清液通过大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树 脂柱， 收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；
⑥ . 将步骤⑤所得的流出液通过聚酰胺柱, 用纯水冲洗树脂柱， 收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；
⑦ . 将步骤⑥所得的流出液减压浓缩、 干燥， 粉碎。
进一步, 美洲大蠊提取物的制备方法具体包括如下步骤： ①. 取美洲大蠊鲜虫、干虫或经脱脂后的干虫， 挑去杂质及非药 用部位， 称取精选的原料适量， 加丙酮回流 2- 4次， 每次加入 2- 5倍
2
更正页 （细则第 9 1条) 量， 每次回流 0. 5-1. 5小时 ¾至 lj脱脂原料， 挥去丙酮；
② . 加水煎煮提取 2〜4次， 每次加入药材重量 5〜20倍体积的 水， _每次煎煮提取 0. 5〜2小时， 滤过；
③ .将步骤②所得的滤液浓縮至相对密度 1. 02〜1. 25(60°C测）， 加入乙醇至含醇量达 55%〜90%， 在- 5°C〜25°C静置 6〜24小时， 滤 过；
④ . 将步骤③所得的滤液回收乙醇至无醇味，加水至每毫升相当 于 0. 1〜2克原生药， 滤过或离心;
⑤ .将步骤④所得的上清液通过大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树 脂柱， 收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；
⑥ . 将步骤⑤所得的流出液通过聚酰胺柱， 用纯水冲洗树脂柱， 收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；
⑦ . 将步骤⑥所得的流出液 7CTC以下减压浓縮、 干燥， 粉碎。 再进一步， 一种美洲大蠊提取物的制备方法， 其特征在于其制备 方法包括如下步骤：
① . 取美洲大蠊鲜虫、干虫或经脱脂后的干虫， 挑去杂质及非药 用部位； 称取步骤①精选的原料适量， 加丙酮回流 3 次， 每次加入 8 - 12倍量， 每次回流 1小时得到脱脂原料， 挥去丙酮；
② .加水煎煮提取 2-4次，每次加入药材重量 8-15倍体积的水， 每次煎煮提取 0. 5〜2小时， 滤过;
③ .将步骤②所得的滤液 縮至相对密度 1. 02〜： 1. 15(60Ό测）， 加入乙醇至含醇量达 75%〜85%，在 0。 (〜 15°C静置 8〜18小时，滤过;.
④ .将步骤③所得的滤液回收乙醇至无醇味，加水至每毫升相当 于 0. 5〜2克原生药， 滤过或离心;
⑤ . 将步骤④所得的上清液通过大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树
3
更正页 （细则第 9 1条) 脂柱， 收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性;
⑥ . 将步骤⑤所得的流出液通过聚酰胺柱， 用纯水冲洗树脂柱， 收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；
⑦ . 将步骤⑥所得的流出液 7(TC以下进行减压浓縮、 干燥， 粉 碎。
经过发明人研究，优选的制备方法为步骤③所述滤液浓縮至相对 密度 1. 05 (60°C测）。
优选的步骤⑤所述吸附树脂柱为极性、弱极性和非极性大孔树脂 优选的步骤⑥所述聚酰胺柱中聚酰胺的粒度为 100〜200目。 本发明还提供了上述方法制备的美洲大蠊提取物。
本发明还提供一种美洲大蠊提取物在制备定向诱导间充质干细 胞分化为表皮细胞的诱导液中的应用。
上述美洲大蠊提取物可加入药学上可接受的辅料制成凝胶剂、涂 膜剂、 贴剂.、 片剂、 胶囊、 软胶囊、 口服液、 滴丸、 喷雾剂、 颗粒剂 或注射液等多种内服外用制剂。
本发明的有益效果:采用本发明所得的美洲大蠊提取物水溶性良 好、 色泽浅、 几乎无腥臭味， 质量稳定可靠， 患者依从性高， 在治疗 各种创面等方面具有很好的临床推广运用价值。
附图说明
图 1大鼠抗人的抗体 CD29， CD34, CD44, CD90的表达情况， 对细 胞进行形态观察及免疫荧光检测
具体实施方式
下面结合实施例以及实验室数据对本发明作进一步描述：
实施例 1
称取美洲大蠊鲜虫 40kg， 加丙酮加热回流 4次， 每次加入 3倍
4
更正页 （细则第 9 1 条) 量， 每次回流 1小时， 挥去丙酮， 加水煎煮提取 3次， 每次加入药材 重量 5倍体积的水， 每次煎煮提取 1小时， 滤过； 滤液 70°C减压浓 縮至相对密度 1. 08 (60Ό测）， 加入乙醇至含醇量达 75%, 在 0°C静 置 12小时， 滤过； 滤液常压回收乙醇至无醇味， 加水至每毫升相当 于 1克原生药， 滤过; 滤液通过 D101型大孔吸附树脂柱， 用纯水冲 洗树脂柱， 收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性； 流出液通过聚 酰胺柱，用纯水冲洗树脂柱， 收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴 性； 所得的流出液 70°C减压浓缩、 干燥， 粉碎， 得浅黄色美洲大蠊 提取物 2. 3公斤， 无腥臭味。
实施例 2
称取美洲大蠊干虫 30kg， 加丙酮加热回流 3次， 每次加入 4倍 量， 每次回流 60分钟， 挥去丙酮， 加水煎煮提取 3次， 每次加入药 材重量 10倍体积的水， 每次煎煮提取 1 、时， 滤过； 滤液 75°C减压 浓缩至相对密度 1. 05 (6CTC测）， 加入乙醇至含醇量达 80%， 在 4°C 静置 12小时， 滤过； 滤液减压回收乙醇至无醇味， 加水至每毫升相 当于 1克原生药, 滤过； 滤液通过 HPD100型大孔吸附树脂柱， 用纯 水冲洗树脂柱， 收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；流出液通 过聚酰胺柱，用纯水冲洗树脂柱， 收集流出液直至流出液茚三酮反应 呈阴性； 所得的流出液 75Ό减压浓縮、 干燥，' 粉碎， 得浅黄色美洲 大蠊提取物 3. 2公斤， 无腥臭味。
实施例 3
称取用美洲大蠊干虫 25kg加丙酮加热回流 3次，. 每次加入 3倍 量， 每次回流 30分钟， 挥去丙酮， 加水煎煮提取 2次， 每次加入药 材重量 20倍体积的水， 每次煎煮提取 2小时， 滤过; 滤液 68°C减压 浓缩至相对密度 1. 25 (6CTC测）， 加入乙醇至含醇量达 55%， 在 25°C
5
更正页 （细则第 9 1 条) 静置 24小时， 滤过； 滤液减压回收乙醇至无醇味， 加水至每毫升相 当于 2克原生药，. 离心； 上清液通过 AB- 8型大孔吸附树脂柱， 用纯 水冲洗树脂柱， 收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性； 流出液通 过聚酰胺柱，用纯水冲洗树脂柱， 收集流出液直至流出液茚三酮反应 呈阴性； 所得的流出液 79 °C减压浓缩、 干燥，. 粉碎， 得浅黄色美洲 大蠊提取物 2. 8公斤， 无腥臭味。
实施例 4
称取用美洲大蠊干虫 40kg， 加丙酮加热回流 3次， 每次加入 2 倍量， 每次回流 40分钟， 挥去丙酮， 加水煎煮提取 3次， 每次加入 药材重量 12倍体积的水， 每次煎煮提取 0. 5小时， 滤过;. 滤液 80°C 减压浓缩至相对密度 1. 15 (60°C测）， 加入乙醇至含醇量达 90%, 在 - 5Ό静置 6小时， 滤过； 滤液减压回收乙醇至无醇味， 加水至每毫升 相当于 1. 5克原生药， 滤过； 滤液通过 HPD400型大孔吸附树脂柱， 用纯水冲洗树脂柱， 收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性； 流出 液通过聚酰胺柱， 用纯水冲洗树脂柱， 收集流出液直至流出液茚三酮 反应呈阴性; 所得的流出液 65°C减压浓縮、 干燥，. 粉碎， 得浅黄色 美洲大蠊提取物 3. 8公斤， 无腥臭味。
参比实施例 1
将干燥的美洲大蠊粗碎， 每 lOOKg粗粉加 300Kg水，浸泡 0. 5小 时后，温度约在 70°C，提取三次，第一次 7小时;第二次加水 200Kg， 提取 5小时; 第三次加水 200Kg， 提取 3小时; 合并三次提取液， 过 滤, 滤液浓缩至相对密度为 1. 05〜1. 08 ( 70°C )时, 加入浓度为 93 % w/w的乙醇， 使成含醇量为 40%， 70 °C保温搅拌 20分钟， 静置 10小 时， 弃去上层油脂， 下层药液过滤， 滤液回收乙醇， 减压浓缩至相对 密度为 1. 15〜1. 18 ( 70°C ), 常压浓缩至水分 2.5%的膏， 即得含美洲
6
更正页 （细则第 9 1条) 大蠊提取物， 备用。
以下通过具体药效学实验证明本发明的有益效果：
试验例 1 本发明药物组食物诱导间充质干细胞定向分化为表皮细 胞
1、 材料和仪器
材料： 骨髓来源于临床骨髓穿刺检查正常患者， 无血液系统疾 病和家族遗传病史， 患者知情同意
药物、 试剂及仪器：
美洲大蠊提取物 （以下简称 ML提取物） 是由实施例 2方法制备 的
D u lb e c c 0 最低必需培养基（D M E M ) , D is p a s e I I 、 胰蛋白酶、 乙二胺四乙酸 (E D T A )、 淋巴细胞分离液、 相关抗体等 无菌超净工作台
C02恒温培养箱
C X 4 0普通光学显微镜和 C K 4 0倒置相差显微镜
Beckman21R低温高速离心机
MD100 一 2 电子天平
培养瓶、 培养皿、 培养板等
2、 分组
共四组：
空白组： 采用含 10%FBS 的 L— DMEM培养基培养；
阳性组： 在空白组基础上加入诱导剂 （成分为 10-7mol/L地塞米 松 +20 ng/mL EGF, +15 ng/mL bFGF+ 1%ITS (胰岛素转铁蛋白））； 药物组： 采用含 0. Olg/ml ML提取物的 L一 DMEM培养基培养； 药物 +阳性组：在空白组基础上加入诱导剂及 0. Olg/ml美洲大蠊
更正页 （细则第 9 1条) 提取物。
3、 实验方法
(一）骨髓间充质干细胞的分离培养
( 1 ) 分离培养
无菌条件下取临床骨髓穿刺检查正常患者 2mL健康骨髓， 用 DMEM培养液等倍稀释混匀后， 加入到含 Ficoll淋巴细胞分离液的试 管中， 400g离心 30min， 收集界面层的单个核细胞， D- Hank' s液 洗涤细胞 2次， 重悬细胞于含体积分数为 10%胎牛血清、 100U/mL青 霉素、 100 mg/L链霉素的 DMEM培养液中，置 37Ό、含体积分数为 5% C02、 饱和湿度恒温培养箱培养。 3d后首次换液， 弃去未贴壁细胞， 保留贴壁细胞继续培养。 待细胞基本长满瓶底时， 用 0. 25 %胰蛋白 酶 +0. 02%EDTA消化传代。
( 2)传代 2次后对细胞进行鉴定： 形态观察及免疫荧光检测 收集细胞， 调整细胞悬液浓度， 每张爬片上接种 10000个细胞。 第二天， 取出玻璃爬片， PBS清洗 3次。 固定液固定 15分钟。 封闭 液封闭 1小时。 一抗孵育 2h-12h。 PBS清洗 3次， 二抗孵育 lh-2h。 DAPI孵育 5分钟。 PBS清洗封片。检测的间充质干细胞细胞表面标志 物为： 大鼠抗人的抗体 CD29， CD34, CD44, CD90的表达情况， 以鉴 定该培养细胞是否为骨髓间充质干细胞。 免疫荧光。
检测结果见图 1， 左上： CD29阳性表达率 98. 6土 1. 8%; 右上： CD34阳性表达率 0. 6土 0. 2%; 左下： CD44阳性表达率 93. 3 ±2. 1%; 右下： CD90阳性表达率 89. 2±4. 5%，说明成功得到了间充质干细胞。
(二）定向诱导骨髄间充质干细胞分化为表皮细胞
( 1 ) 培养
取第 3代间充质干细胞， 用 0. 25 %胰蛋白酶 +0. 02%EDTA消化成
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更正页 （细则第 9 1条) 细胞悬液， 随机分为四组： 空白组 （采用含 10%FBS 的 L—DMEM培 养基培养）、 阳性组（在空白组基础上加入诱导剂）、 药物组（采用含
0. 01g/ml ML提取物的 L— DMEM培养基培养）、 药物 +阳性组（在空白 组基础上加入诱导剂及 0. 01g/ml ML提取物）， 将第 3代细胞接种在 PLL处理过的玻璃爬片上， 分别加入上述培养基， 每组各设 3个平行 组， 按照常规细胞培养。
(2) 检测
按照常规细胞培养要求继续培 # 7天后， 收集细胞，按照免疫荧 光检测的方法进行培养细胞爬片制作， 进行细胞角蛋白 CK19 (该指 标为表皮细胞特征性标志物） 表达的检测。 通过 CK19表达情况鉴定 表皮干细胞是否形成。
荧光染色结果显示： 空白组无 CK19表达为阴性， 阳性组、 药物 组及药物 +阳性组均有 CK19的表达， 其中药物组 （ML提取物) CK19 表达显著， 说明 ML提取物具有诱导人间充质干细胞 hMSCs分化为表 皮干细胞的作用。
试验例 2 提取物对小鼠的急性毒性及半数致死剂量
1、 实验材料
1. 1. 实验药物：
实施例 2提取物干粉， 黄棕色粉末， 味腥， 易吸潮， 易溶于水。 提取物溶液浓度分别为 0. lg/ml , 0. 2g/ml， 0. 4g/ml红棕色澄清 液体， 以上样品均由四川好医生攀西药业有限责任公司提供。
1. 2. 实验动物及环境条件：
昆明种小鼠， SPF级 （三级） 合格动物。
试验环境条件： 本试验应用设施符合 SPF (三) 级标准的动物实 验室内进行。 室内通过自动空调控制室温在 19〜21°C， 相对湿度控制
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更正页 （细则第 9 1条) 在 50〜65%。 通过自动换气装置调节室内空气。 人工控制荧光照明， 每天 8~20时明， 20〜8时暗。 实验动物分笼饲养， 动物每笼不超过 5 只， 自由饮水, 常规全价词料, 定时定量喂养， 每天下午 4时左右， 小鼠喂食 8g/20g b. w.。
1. 3. 实验试剂
氯化钠注射液（0. 9%)，规格： 500ml : 4. 5g，其它试剂均为市售， 分析纯。
1. 4. 试验仪器
JA1003电子天平， 上海精科天平， d=lmg;
EB - 3200D电子天平， 由日本岛津生产， d=0. 01g;
YB电子天平， 上海海康电子仪器厂生产, d=0. lg;
手术器械、 秒表、 直尺、 灌胃针等。
2、 实验方法与结果
2. 1、 提取物对小鼠的急性毒性试验药物配制： 采用四川好医生 攀西药业有限责任公司按照实施例 2方法制备的提取物，制成浓度分 别为 0. lg/ml， 0. 2g/ml , 0. 4g/ml红棕色澄清液体， 用量筒计量最后 所得药液体积， 供实验用。
2. 2预试验： 取体重 18〜22g小鼠 40只， 雌雄各半， 按体重随机 分成 10组， 每组 4只， 自由饮水， 禁食 6小时后， 各组按 0. 4ml/10g 体重分别灌胃 70%、 56%、 45%提取物液体， 对照组灌胃等体积生理盐 水， 观察小鼠给药后毒性反应及死亡情况， 观察 7天， 每天一次， 各 组动物死亡情况如表 1 :
本发明美洲大蠊提取物的毒性结果
Figure imgf000012_0001
10
更正页 （细则第 9 1条)
Figure imgf000013_0001
2. 3提取物对小鼠的半数致死剂量 (LD50)测定：
2. 3. 1药物配制： 称取一定量药粉， 缓缓加入蒸馏水研磨， 将药 物配成糊状悬液， 直至灌胃针可通过为止，用量筒计量最后所得药液 体积， 最后得到 76%提取物药液， 供实验用。
1. 1. 2半数致死量测定： 取小鼠一批, 体重在 20〜22g之间的小 鼠 60只， 雌雄各半， 按体重随机分成 6组, 每组 10只， 禁食不禁水 6h，各组分别灌胃 提取物 30. 4g/kg、27. 4g/kg、24. 6g/kg、22. 2g/kg、 19. 9g/kg、. Og/kg (NS 0. 4ml/10g b. w. )， 按不同浓度同体积给药， 0. 4ml/10g体重灌胃， 观察 14天， 每天一次， 记录逐日的小鼠毒性 反应及死亡数，死亡动物即时尸体解剖，肉眼观察各主要脏器，取心、 肝、 脾、 肺、 肾、 胃等主要脏器， 10%甲醛固定，. 病理切片检査。 存 活动物至实验结束处死， 同上法大体尸检， 取主要脏器病理检查。
1. 1. 3试验结果
提取物一次大剂量灌胃 ig小鼠后， 小鼠大多活动减少， 俯卧， 对外界刺激反应迟缓， 皮肤体温略有下降， 部分动物翻正反射消失， 呼吸频率减慢， 幅度变弱， 直至呼吸停止， 在广 8小时内死亡（各组 死亡情况见表 1 ); 存活动物此种情况在 10〜14小时内逐渐消失，. 恢 复正常状态， 活动、 饮食、. 饮水均恢复至正常， 直至存活 14天未见 异常情况出现； 死亡动物经尸体解剖， 肉眼观察各主要脏器， 仅胃肠 内有大量清稀液体，其余各脏器均未见肉眼可见异常病变，取心、肝、 脾、 肺、 肾、 胃等主要脏器 10%甲醛固定， 病理切片检查。 发现提取
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更正页 （细则第 9 1条) 物的毒性作用器官主要在胃，胃的损伤主要体现在胃黏膜较严重的坏 死脱落， 以及出血。 给药后恢复 14天小鼠心、 肝、 脾、 肺、 肾和胃 几个脏器未见明显病变。 说明 ML造成的小鼠胃、 肺和肾的损伤有自 愈的可能。
实验结果如表 2所示：
表 2 —次灌胃 （ ig) 给药测定提取 对小鼠的 LD: 剂量 对数 动物数 死亡数 死亡率 概率 组别
g/kg 剂量 (只） (只） (%) 单位
1 30. 4 1. 398 10 6 60 5. 25
2 27. 4 1. 327 10 4 40 4. 75
3 24. 6 1. 258 10 1 10 3. 72
4 22. 2 1. 188 10 0 0 3. 03
5 19. 9 1. 114 10 0 0 1
6 0 1 10 0 0 1
LD50=29. Og/kg
LD5。的 95%可信区间: 27. 4g/kg~30. 8g/kg。
由表 2可知，提取物的小鼠半数致死剂量（LD5。）为： 29. Og/kg, LD50的 95%可信限范围为: 27. 4g/kg〜30. 8g/kg。
试验例 3 提取物创面修复试验
1、提取物对小鼠实验性烫伤的影响
取体重 18〜22g小鼠 50只， 雌雄各半， 按性别与体重随机分为 5组， 分别为 NS对照组， 美洲大蠊提取物给药组， 湿润烧伤膏 （汕 头市美宝制药有限公司， 涂于烧、 烫、 灼伤等创面， 厚度薄于 lmm) 对照组。将小鼠置于固定器内，小鼠右后足跖部位置于预先调至 55Ό 恒温水浴中 15秒， 此后每隔半小时各组小鼠分别于右足跖部涂药 1 次， 共给药 3次， 4. 5小时后将小鼠脱颈椎处死， 于同一部位剪下两
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更正页 （细则第 9 1条) 足跖部，用精密扭力天平称重，以每鼠右足重减去左足重量为肿胀度， 将对照组和给药组的肿胀程度进行比较和统计学处理。 结果见表 3。
表 3 提取物对小鼠实验性烫伤的影响 士 SD) 浓度 动物数 给药 足跖肿胀度 抑制率 组别
(g/ml) (n) 次数 (mg) (%) 对照组 NS 10 3 180.2±16.1 1 参比实施例 1制备
0.4 10 3 169.6±14.1 5.9 的 ML提取物 实施例 2制备的 ML
0.2 10 3 168.1±13·6 6.7 提取物
实施例 2制备的 ML
0.4 10 3 163.7±15·6* 9.2 提取物
湿润烧伤膏 1 10 3 154.3±11.0** 14.4
* ： P<0.05, ： P〈0.01 与对照组比较
结果显示，提取物各剂量对热水烫伤致小鼠足跖的肿胀度有不同 程度的降低， 其中 0.4g/ml组、 0.2g/ml组与对照组比较有显著性差 异 (P〈0.05)， 说明提取物对烫伤有较好的保护作用。
2 提取物对小鼠实验性烧伤的影响
取体重 18〜22g小鼠 60只， 雌雄各半， 参照文献方法。 将中间 挖空 2cmX2cm的石棉纸置于小鼠背上， 用微量移液器吸取 lOOuL无 水乙醇滴于 20mg棉球上，置于暴露处，点火燃烧造成 II度烧伤模型。 按性别与烧伤面积随机分为 5组， 分别为 NS对照组， 美洲大蠊提取 物给药组， 湿润烧伤膏对照组。 各组分别涂药， 连续涂 30 Bid, 换药前将创面清洗干净。观测小鼠烧伤面积和愈合情况，给药 9天与 15天， 分别用数码相机拍照， 用 IPP5.1图像分析软件包测量各组动 物烧伤面积。 将所测结果进行 t检验。 结果见表 4。
13
更正页 （细则第 91条) 提取物对小鼠实验性烧伤的影响 土 SD)
浓度 创面结痂面积（mm:
动物 给药 脱痂时间 组 别 (g/ml
数 次数 开始给药 给药 9天 给药 15天 (天） )
对照组 1 20 Bid 126.7±39· 1 66·9±34.4 32.0±12.6 19·3±3· 1 比实施例 1
1备的 ML提 0.4 10 Bid 128.4±45.1 37.9±18.3* 19.1±13.3 17.6±1.8 取物
施例 2制备
0.2 10 Bid 121.1±30·0 55·8±16.6 15.5±10.4* 17.2±1.6 1 ML提取物
施例 2制备
0.4 10 Bid 122.5±32·8 45.5±23.5 10.9 + 5.4** 16.1±0.3** ； ML提取物
润烧伤膏 1 10 Bid 126.4±31.7 59.4±11.7 15.0±5.8* 17.8±2.3
* ： P<0.05, ** ： Ρ<0.01 与对照组比较
结果显示， 与对照组比较， 给药 9天、 给药 15天， 提取物对小 鼠的创面结痂面积均有一定的减少，各剂量给药组均可使创面愈合时 间縮短， 提取物高剂量组与对照组比较有显著性差异 (Ρ<0.05或
Ρ<0.01)， 说明提取物对小鼠实验性烧伤有洽疗作用。
本发明提供的方法制备的美洲大蠊提取物色泽浅、腥臭味淡，且 将游离氨基酸、核苷类物质以及大量大分子蛋白质等大量有效成分含 量高。美洲大蠊提取 可诱导间充质千细胞定向分化为表皮细胞，为 临床治疗修复具有上皮细胞的组织 /器官提供了一种安全、 可靠的种 子细胞来源。
工业应用性
本发明通过特定提取制备方法得到的美洲大蠊提取物，其杂质低
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更正页 （细则第 91条) 色泽浅、腥臭味淡， 且将游离氨基酸、核苷类物质以及大量大分子蛋 白质等大量有效成分含量高。临床上用于干细胞分化诱导剂， 治疗皮 肤烧烫伤效果很好， 临床使用方便， 可直接涂抹于患处， 制备方法简 便， 成本低廉， 方便大生产， 具有良好的临床应用和工业应用前景。
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更正页 （细则第 9 1条)

Claims

权 利 要 求 书
1. 一种美洲大蠊提取物的制备方法包括如下的步骤：
① . 取美洲大蠊鲜虫、 干虫或经脱脂后的干虫， 称取适量， 加丙酮进行回流， 得 到脱脂原料；
② . 加水煎煮提取 2〜4次；
③ . 将步骤②所得的滤液浓缩至相对密度 1.02〜1.25 ( 60°C测）， 加入乙醇， 静 置， 滤过；
④ . 将步骤③所得的滤液回收乙醇至无醇味， 加水， 滤过或离心；
⑤ . 将步骤④所得的上清液通过大孔吸附树脂柱， 用纯水冲洗树脂柱， 收集流出 液直至流出液茚三酮反应呈阴性；
⑥ . 将步骤⑤所得的流出液通过聚酰胺柱， 用纯水冲洗树脂柱， 收集流出液直至 流出液茚三酮反应呈阴性；
⑦ . 将步骤⑥所得的流出液减压浓缩、 干燥， 粉碎。
2. 一种美洲大蠊提取物的制备方法包括如下步骤：
① . 取美洲大蠊鲜虫、 干虫或经脱脂后的干虫， 挑去杂质及非药用部位， 称取精 选的原料适量， 加丙酮回流 2-4次， 每次加入 2-5倍量， 每次回流 0.5-1.5小时得 到脱脂原料， 挥去丙酮；
② . 加水煎煮提取 2〜4次， 每次加入药材重量 5〜20倍体积的水， 每次煎煮提 取 0.5〜2小时， 滤过；
③ . 将步骤②所得的滤液浓缩至相对密度 1.02〜1.25 ( 60°C测）， 加入乙醇至含 醇量达 55%〜90%， 在 -5°C〜25°C静置 6〜24小时， 滤过；
④ . 将步骤③所得的滤液回收乙醇至无醇味， 加水至每毫升相当于 0.1〜2克原 生药， 滤过或离心；
⑤ . 将步骤④所得的上清液通过大孔吸附树脂柱， 用纯水冲洗树脂柱， 收集流出 液直至流出液茚三酮反应呈阴性；
⑥ . 将步骤⑤所得的流出液通过聚酰胺柱， 用纯水冲洗树脂柱， 收集流出液直至 流出液茚三酮反应呈阴性；
⑦ . 将步骤⑥所得的流出液 70°C以下减压浓缩、 干燥， 粉碎。
3. 一种美洲大蠊提取物的制备方法， 其特征在于其制备方法包括如下步骤： ① . 取美洲大蠊鲜虫、 干虫或经脱脂后的干虫， 挑去杂质及非药用部位； 称取步 骤①精选的原料适量， 加丙酮回流 3次， 每次加入 8-12倍量， 每次回流 1小时 得到脱脂原料， 挥去丙酮；
② . 加水煎煮提取 2-4次， 每次加入药材重量 8-15倍体积的水， 每次煎煮提取 0.5〜2小时， 滤过；
③ . 将步骤②所得的滤液浓缩至相对密度 1.02〜1.15 (60°C测）， 加入乙醇至含 醇量达 75%〜85%， 在 0°C〜15°C静置 8〜18小时， 滤过；
④ . 将步骤③所得的滤液回收乙醇至无醇味， 加水至每毫升相当于 0.5〜2克原 生药， 滤过或离心；
⑤ . 将步骤④所得的上清液通过大孔吸附树脂柱， 用纯水冲洗树脂柱， 收集流出 液直至流出液茚三酮反应呈阴性；
⑥ . 将步骤⑤所得的流出液通过聚酰胺柱， 用纯水冲洗树脂柱， 收集流出液直至 流出液茚三酮反应呈阴性；
⑦ . 将步骤⑥所得的流出液 70°C以下进行减压浓缩、 干燥， 粉碎。
4. 根据权利要求 1 所述的的制备方法， 其特征在于： 步骤③所述滤液浓缩至相 对密度 1.05 (60°C测）。
5. 根据权利要求 1 所述的的制备方法， 其特征在于： 步骤⑤所述吸附树脂柱为 极性、 弱极性和非极性大孔树脂。
6. 根据权利要求 1 所述的的制备方法， 其特征在于： 步骤⑥所述聚酰胺柱中聚 酰胺的粒度为 100〜200目。
7. 如权利要求 1-6任意一项所述方法制备的美洲大蠊提取物。
8. 美洲大蠊提取物在制备定向诱导间充质干细胞分化为表皮细胞的诱导液中的 应用。
9. 根据权利要求 8所述的用途， 其特征在于： 所述的美洲大蠊提取物为权利要 求 1-6任意一项所述方法制备的美洲大蠊提取物。
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