CN105878287B - 一种美洲大蠊酶解物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种美洲大蠊酶解物及其制备方法和应用，所述的的美洲大蠊酶解物中的肽类物质含量高、无毒、色泽浅等优点。所述的制备方法包括加入蛋白酶水解，除油脂，离心，醇沉，大孔树脂吸附等步骤，本发明研究表明，所述的美洲大蠊酶解物还具有缩短创面修复时间、治疗消化道溃疡的效果显著的有益效果。

Description

一种美洲大蠊酶解物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种美洲大蠊酶解物及其制备方法和应用。

背景技术

美洲大蠊(Periplanetaamericana)为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，其入药始载于《神农本草经》，其中把它列为中品，谓“味：咸、寒；治：血瘀证坚寒热、破积聚、喉咽闭、内寒无子”。“蟑螂”为其俗名首见于《本草纲目拾遗》，也称其为石姜、滑虫；各地方有其不同的称法，如：偷油婆、茶婆子、灶蚂子等。蜚蠊科(Blattidae)是—个庞大的昆虫家族，在地球上已生存了3.2亿年，与恐龙属同—时代出现的生物。无疑它是世界上生命力最强、最古老、至今繁衍最成功的昆虫类群之一。

近几年来随着我国对传统中医药资源研究开发的重视，有些学者对这一几千年来无法根绝的害虫进行了应用方面的研究，并取得了可喜的成就，发掘出了这一传统意义上的害虫的正面价值。以美洲大蠊醇提物纯化制成的产品“康复新液”，在烧伤、烫伤等外伤创面的良好疗效,同时具有抗炎、消肿、加速病损组织修复、提高免疫力，故可以内服用于治疗十二指肠溃疡，胃溃疡，肺结核。

现代消化理论认为，蛋白质口服后不能被直接吸收进入血液，只有经过胃肠道转化成小分子肽才能被吸收，小分子肽主要指含2～15个氨基酸残基的肽，其相对分子质量在3000以下，具有可直接被消化道吸收、转运速度快、耗能低和不易饱和等特点。而美洲大蠊醇提取物中主要成分除了游离氨基酸外，还有蛋白质，多肽类等大分子物质，而蛋白质这一类大分子是不能被直接吸收进入血液的，而是需要口服后经过胃肠道的转化才能起到相应的作用。因此，需要得到一种新的美洲大蠊提取物，其包含的主要成分为可以直接被吸收进入血液的游离氨基酸、肽类等小分子物质。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了一种美洲大蠊酶解物。

所述的美洲大蠊酶解物中肽类成分含量高，能够被直接吸收进入血液，快速的作用病患处。

所述的美洲大蠊酶解物为一种新的美洲大蠊提取物。

本发明的目的还在于提供所述美洲大蠊酶解物的制备方法。

本发明所述的美洲大蠊酶解物的制备方法，它包括如下步骤：

(1)取美洲大蠊干虫或鲜虫，粉碎后加入2～20倍原料药重量的纯水，混匀料液，调解pH值；

(2)向步骤(1)中所述的料液中加入原料药重量的1％～10％的蛋白酶，水解后，过滤，冷藏去油脂后离心；将离心后的上清液浓缩，向浓缩液中加入乙醇至所得溶液中乙醇体积浓度为60％～90％，静置，过滤，滤液回收乙醇，得回收乙醇后的滤液；

(3)取步骤(2)中得到的回收乙醇后的滤液，通过吸附树脂柱，纯水冲洗，收集流出液至流出液茚三酮反应呈阴性；然后流出液再通过聚酰胺柱，纯水冲洗，并收集流出液至流出液茚三酮反应呈阴性；

(4)将步骤(3)中得到的最终流出液浓缩、干燥，即得美洲大蠊酶解物。

其中，步骤(1)中所述的纯水为原料药的10～20倍。

其中，步骤(2)中所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶中一种或者一种以上的组合，其中蛋白酶加入量为原料药的3％～10％。

其中，步骤(2)所述的水解温度为20～60℃。

其中，步骤(2)所述的水解时间为1～8小时，优选的为3.5～8小时。

其中，步骤(2)所述离心的时间为15～60分钟，速率为10000转/分～28000转/分。

其中，步骤(2)所述加入乙醇的体积浓度为90％～96％。

其中，步骤(2)所述静置温度为0～10℃，静置时间为12～24小时。

其中，步骤(3)所述吸附树脂柱为极性、弱极性和非极性大孔树脂。

其中，步骤(3)所述聚酰胺柱中聚酰胺的粒度为100～200目。

本发明的目的还在于提供所述美洲大蠊酶解物在消化道溃疡、创面修复中的应用。

进一步地，所述消化道溃疡为胃溃疡。

进一步地，所述创面为烧烫伤创面。

本发明所述的美洲大蠊酶解物中肽类成分的重量百分比能达到50％以上，且具有缩短创面愈合时间，无毒副作用，治疗溃疡效果好等优点。

通过本发明提供的制备方法能够将美洲大蠊中的大分子蛋白质在提取过程中直接水解为能被吸收进入血液的小分子肽，氨基酸等有效的小分子物质，制备出的美洲大蠊酶解物具有色泽浅、腥臭味淡、患者顺应性高，药效高且快速的优点。利用本发明所述的制备方法提高了美洲大蠊提取物的产品品质，制备的药物能够更易被病患接受，且药效更好，克服了现有美洲大蠊提取物色泽深、腥臭味重以及口服后需要经过胃肠道转化才能被有效吸收的缺陷。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例1 本发明美洲大蠊酶解物的制备方法

称取10kg美洲大蠊鲜虫鲜料，用高速组织捣碎机处理成匀浆状，再加入100升水，混匀，用10％的氢氧化钠调节pH值为7.8，加入药材重量4％的弹性蛋白酶，混匀，在20℃的温度下保持8小时，放入冷藏室冷藏16小时，用滤纸去除上层油脂后，在28000转速下离心15分钟；上清液浓缩至相对密度为60℃时的1.20，加入体积浓度为94％的乙醇至溶液中乙醇体积浓度达60％，在10℃静置12小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至15升，过滤；滤液通过型号为HPD300的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，流出液再通过粒度为100目的聚酰胺柱，用纯水冲洗聚酰胺柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，60℃减压浓缩、干燥、粉碎，得0.71kg浅黄色粉末，即为美洲大蠊酶解物。

采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊酶解物中肽类成分含量占61.7％(重量百分比)。

实施例2 本发明美洲大蠊酶解物的制备方法

称取美洲大蠊干虫5kg，粉碎成粉末，加100升纯水，混匀，用10％的氢氧化钠调节pH值为8.0，加入药材重量3％的胰蛋白酶，混匀，在45℃的温度下保持3.5小时，放入冷藏室冷藏20小时，用滤纸去除上层油脂后，在15000转速下离心50分钟；上清液浓缩至相对密度为60℃时的1.15，加入体积浓度为95％乙醇至溶液中乙醇体积浓度达75％，在20℃静置24小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至10升，过滤；滤液通过型号为HPD400的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，流出液再通过粒度为100目的聚酰胺柱，用纯水冲洗聚酰胺柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，75℃减压浓缩、干燥、粉碎，得1.05kg浅黄色色粉末，即为美洲大蠊酶解物。

采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊酶解物中肽类成分含量占58.1％(重量百分比)。

实施例3 本发明美洲大蠊酶解物的制备方法

称取美洲大蠊干虫5kg，粉碎成粉末，再加入70升水，混匀，用10％的氢氧化钠调节pH值为9.0，加入药材重量10％的胰凝乳蛋白酶，混匀，在40℃的温度下保持5小时，放入冷藏室冷藏24小时，用滤纸去除上层油脂后，在18000转速下离心50分钟；上清液浓缩至相对密度为60℃时的1.10，加入体积浓度为92％的乙醇至溶液中乙醇体积浓度达75％，在5℃静置24小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至12升，过滤；滤液通过型号为X-5的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，流出液再通过粒度为200目的聚酰胺柱，用纯水冲洗聚酰胺柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，70℃减压浓缩、干燥、粉碎，得1.05kg浅黄色粉末，即为美洲大蠊酶解物。

采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊酶解物中肽类成分含量占57.5％(重量百分比)。

实施例4 本发明美洲大蠊酶解物的制备方法

称取美洲大蠊干虫5kg，粉碎成粉末，加水80升，混匀，用10％的氢氧化钠调节pH值为7.5，加入药材重量5％的中性蛋白酶，混匀，在60℃的温度下保持4小时，放入冷藏室冷藏24小时，用滤纸去除上层油脂后，在20000转速下离心45分钟；上清液浓缩至相对密度为60℃时的1.05，加入体积浓度为96％乙醇至溶液中乙醇体积浓度达90％，在4℃静置6小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至5升，过滤；滤液通过型号为AB-8的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，流出液再通过粒度为100目的聚酰胺柱，用纯水冲洗聚酰胺柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，70℃减压浓缩、干燥、粉碎，得0.96kg浅黄色粉末，即为美洲大蠊酶解物。

采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊酶解物中肽类成分含量占56.9％(重量百分比)。

实施例5 本发明美洲大蠊酶解物的制备方法

称取美洲大蠊干虫5kg，粉碎成粉末，加水50升，混匀，用10％的氢氧化钠调节pH值为7.5，加入药材重量4％的木瓜蛋白酶，混匀，在50℃的温度下保持5小时，放入冷藏室冷藏12小时，用滤纸去除上层油脂后，在24000转速下离心30分钟；上清液浓缩至相对密度为60℃时的1.10，加入体积浓度为93％的乙醇至含醇量达65％，在0℃静置12小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至8升，过滤；滤液通过型号为HPD100的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，流出液再通过粒度为200目的聚酰胺柱，用纯水冲洗聚酰胺柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，65℃减压浓缩、干燥、粉碎，得1.10kg浅黄色粉末，即为美洲大蠊酶解物。

采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊酶解物中肽类成分含量占53.8％(重量百分比)。

实施例6 本发明美洲大蠊酶解物的制备方法

称取10kg美洲大蠊鲜虫原料，用高速组织捣碎机处理成匀浆状，再加入20升水，用10％HCL溶液调节pH值为1.0，加入药材重量1％的胃蛋白酶，混匀，在40℃的温度下保持4小时后，放入冷藏室冷藏24小时，用滤纸去除上层油脂后，在10000转速/分下离心60分钟；上清液浓缩至相对密度为60℃时的1.10，加入体积浓度为90％乙醇至溶液中乙醇体积浓度达80％，在0℃静置12小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至5升，过滤；滤液通过型号为D₁₀₁的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，流出液再通过粒度为100目的聚酰胺柱，用纯水冲洗聚酰胺柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，79℃减压浓缩、干燥、粉碎，得0.56kg浅黄色粉末，即为美洲大蠊酶解物。

采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊酶解物中肽类成分含量占52.3％(重量百分比)。

实施例7 本发明美洲大蠊酶解物的制备方法

称取美洲大蠊干虫5kg，粉碎成粉末，再加入60升水，混匀，用10％的氢氧化钠调节pH值为8.0，加入药材重量1％的胰蛋白酶和3％中性蛋白酶，混匀，在40℃的温度下保持4小时，放入冷藏室冷藏12小时，用滤纸去除上层油脂后，在26000转速下离心35分钟；上清液浓缩至相对密度为60℃的1.08，加入体积浓度为96％的乙醇至溶液中乙醇体积浓度达85％，在8℃静置18小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至8升，过滤；滤液通过型号为NK-2的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，流出液再通过粒度为100目的聚酰胺柱，用纯水冲洗聚酰胺柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，75℃减压浓缩、干燥、粉碎，得1.05kg浅黄色粉末，即为美洲大蠊酶解物。

采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊酶解物中肽类成分含量占60.2％(重量百分比)。

实施例8 本发明美洲大蠊酶解物的制备方法

称取美洲大蠊干虫5kg，粉碎成粉末，加水50升，混匀，用10％的氢氧化钠调节pH值为7.8，加入药材重量2％的中性蛋白酶、1.5％胰蛋白酶以及1％木瓜蛋白酶，混匀，在40℃的温度下保持2小时，放入冷藏室冷藏24小时，用滤纸去除上层油脂后，在21000转速下离心30分钟；上清液浓缩至相对密度为60℃时的1.10，加入体积浓度为90％的乙醇至溶液中乙醇体积浓度达80％，在4℃静置16小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至7升，离心；上清液通过型号为HPD600的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，流出液再通过粒度为200目的聚酰胺柱，用纯水冲洗聚酰胺柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，75℃减压浓缩、干燥、粉碎，得1.02kg浅黄色粉末，即为美洲大蠊酶解物。

采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊酶解物中肽类成分含量占57.3％(重量百分比)。

实施例9 本发明美洲大蠊酶解物的制备方法

称取美洲大蠊干虫5kg，粉碎成粉末，再加入10升水，混匀，用10％的氢氧化钠调节pH值为8.0，加入药材重量1％的胰凝乳蛋白酶、1.5％中性蛋白酶以及1％木瓜蛋白酶，混匀，在50℃的温度下保持3小时，放入冷藏室冷藏20小时，用滤纸去除上层油脂后，在12000转速下离心60分钟；上清液浓缩至相对密度为60℃时的1.15，加入体积浓度为95％的乙醇至含溶液中乙醇体积浓度达70％，在8℃静置12小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至12升，过滤；滤液通过型号为D3520的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，流出液再通过粒度为200目的聚酰胺柱，用纯水冲洗聚酰胺柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，75℃减压浓缩、干燥、粉碎，得1.15kg浅黄色粉末，即为美洲大蠊酶解物。

采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊酶解物中肽类成分含量占55.1％(重量百分比)。

参比实施例1 美洲大蠊酶解物

称取美洲大蠊10kg，粉碎，加入80％的乙醇回流提取3次，每次分别加入乙醇的量为原药材的8倍、6倍、6倍，过滤，滤液于70℃减压回收乙醇，回收50℃时相对密度为1.05，浓缩液于0℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为10℃，转速20000r/min，离心30分钟，得到的上清液在75℃减压浓缩、干燥、粉碎，即得4.76kg美洲大蠊醇提取物。

取上述美洲大蠊醇提取物，加纯水配成含有5％的美洲大蠊醇提取物溶液，加10％的氢氧化钠调节溶液的pH为7.0，再加入8400U/mg的木瓜蛋白酶，在55℃条件下进行水解3小时，将水解后的药液过滤，浓缩干燥，即得美洲大蠊酶解物2.17kg。

采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊酶解物中肽类成分含量占41.0％(重量百分比)。

参比实施例2 美洲大蠊醇提物

称取美洲大蠊10kg，粉碎，加入80％的乙醇回流提取3次，每次分别加入乙醇的量为原药材的8倍、6倍、6倍，过滤，滤液于70℃减压回收乙醇，回收50℃时相对密度为1.05，浓缩液于0℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为10℃，转速20000r/min，离心30分钟。离心后上清液于75℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为美洲大蠊提取物3.23kg，即为美洲大蠊醇提物。

采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊醇提物中肽类成分含量占17.7％(重量百分比)。

参比实施例3 美洲大蠊醇提物

称取美洲大蠊10kg，粉碎，加入80％的乙醇回流提取3次，每次分别加入乙醇的量为原药材的8倍、6倍、6倍，过滤，滤液于70℃减压回收乙醇，回收50℃时相对密度为1.05，浓缩液于0℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为10℃，转速20000r/min，离心30分钟；滤液通过HPD400型大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；流出液通过粒度为100目的聚酰胺柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性；所得的流出液65℃减压浓缩、干燥，粉碎，得浅黄色美洲大蠊提取物1.07kg，即得美洲大蠊醇提物。

采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊醇提物中肽类成分含量占28.9％(重量百分比)。

参比实施例4 美洲大蠊水提物

称取美洲大蠊干虫10kg，粉碎，加水，浸泡1.5小时后，水煎煮3次，每次加水量为原药材的8倍、6倍、6倍，每次煎煮时间分别为2.5小时，1.5小时，1.5小时，合并三次煎液，过滤，滤液冷藏静置24小时后去除上层油脂，下层液在18000转速下离心30分钟；上清液浓缩至相对密度为65℃时的1.12，加入体积浓度为95％的乙醇至含溶液中乙醇体积浓度达85％，在5℃静置12小时，过滤；滤液75℃减压浓缩、干燥、粉碎，得3.01kg深褐色粉末，即为美洲大蠊水提物。

采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊水提物中肽类成分含量占13.9％(重量百分比)。

参比实施例5 美洲大蠊水提物

称取美洲大蠊干虫10kg，粉碎，加水，浸泡1.5小时后，水煎煮3次，每次加水量为原药材的8倍、6倍、6倍，每次煎煮时间分别为2.5小时，1.5小时，1.5小时，合并三次煎液，过滤，滤液冷藏静置24小时后去除上层油脂，下层液在18000转速下离心30分钟；上清液浓缩至相对密度为65℃时的1.12，加入体积浓度为95％的乙醇至含溶液中乙醇体积浓度达85％，在5℃静置12小时，过滤；滤液回收乙醇，加水至10升，过滤；滤液通过型号为HPD300的大孔吸附树脂柱，用纯水冲洗树脂柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，流出液再通过粒度为100目的聚酰胺柱，用纯水冲洗聚酰胺柱，收集流出液直至流出液茚三酮反应呈阴性，75℃减压浓缩、干燥、粉碎，得1.52kg浅褐色粉末，即为美洲大蠊水提物。

采用凯氏定氮法结合氨基酸分析仪，最终测得上述美洲大蠊水提物中肽类成分含量占27.6％(重量百分比)。

综上，实施例1～实施例9和参比实施例1～5所用提取方法最终得到的美洲大蠊提取物中肽类成分含量比较如表1：

	蛋白酶	肽类成分含量(重量百分比％)
			实施例1	弹性蛋白酶	61.7
实施例2	胰蛋白酶	58.1
			实施例3	胰凝乳蛋白酶	57.5
实施例4	中性蛋白酶	56.9
			实施例5	木瓜蛋白酶	53.8
实施例6	胃蛋白酶	52.3
			实施例7	胰蛋白酶+中性蛋白酶	60.2
实施例8	胰蛋白酶+木瓜蛋白酶	57.3
			实施例9	中性蛋白酶+木瓜蛋白酶+胰凝乳蛋白酶	55.1
参比实施例1	木瓜蛋白酶	41.0
			参比实施例2	无	17.7
参比实施例3	无	28.9
			参比实施例4	无	13.9
参比实施例5	无	27.6

由表1中的各实施例制备的美洲大蠊酶解物中肽类成分含量得到：使用蛋白酶对美洲大蠊进行水解，得到的美洲大蠊酶解物中的肽类成分含量明显高于使用普通提取方法得到的美洲大蠊醇提物和水提物中的肽类成分含量。

其中参比实施例1与实施例的酶解工艺的区别在于：参比实施例1是将蛋白酶作用于已经制备好的美洲大蠊醇提物，而实施例中的蛋白酶是直接作用于美洲大蠊；由表1中的数据可以看出实施例1制备的美洲大蠊酶解物中的肽类含量明显高于参比实施例1制备的美洲大蠊酶解物。

表1中数据还可以得到使用本发明所述的制备方法制备的蛋白美洲大蠊酶解物中的肽类成分含量可以高达50％以上，具有良好的市场价值。

从表1中的数据还能得出，同为在木瓜蛋白酶作用下制备的美洲大蠊酶解物，实施例5得到的美洲大蠊酶解物中的肽类含量为53.8％，而参比实施例1所述的方法制备的美洲大蠊酶解物中的肽类含量为41.0％，由此说明本发明所述的制备方法制备的美洲大蠊酶解物中的肽类含量高。

以下将通过实验例对本发明所述的美洲大蠊酶解物的有益效果进行进一步说明：

实验例1本发明所述美洲大蠊酶解物对小鼠的急性毒性及半数致死剂量

一、实验材料

1.实验药物：实施例1和参比实施例5制备的美洲大蠊酶解物。

2.实验动物：

实验动物：昆明种小鼠，SPF级(三级)合格动物。

3.实验试剂

氯化钠注射液(0.9％)，其它试剂均为市售，分析纯。

三、实验方法与结果

预试验：取体重18～22g小鼠70只，雌雄各半，按体重随机分成7组，每组10只，自由饮水，禁食6小时后，其中3组按0.4ml/10g体重分别ig 70％、56％、45％实施例1制备的美洲大蠊酶解物液体，另外3组按0.4ml/10g体重分别ig 70％、56％、45％参比实施例5制备的美洲大蠊水提物液体，对照组ig等体积生理盐水，观察小鼠给药后毒性反应及死亡情况，观察7天，每天一次，结果见表2：

表2 毒性结果

由表1中的数据可以看出，在同体积同浓度的美洲大蠊提取物灌胃小鼠的实验结果比较中得到：参比实施例5的总体的死亡率比实施例1总体死亡率高，初步说明参比实施例5制备的美洲大蠊水提物的毒性比实施例1制备的美洲大蠊酶解物的毒性大。

以下将根据表1所述死亡情况，进行实施例1和参比实施例5制备的美洲大蠊酶解物和美洲大蠊水提物对小鼠半数致死剂量(LD₅₀)测定。

1.1对小鼠的半数致死剂量(LD₅₀)测定：

1.1.1试验方法

取体重在20～22g之间的小鼠60只，雌雄各半，按体重随机分成6组，每组10只，禁食不禁水6h，各组分别ig实施例1制备的美洲大蠊酶解物30.4g/kg、27.4g/kg、24.6g/kg、22.2g/kg、19.9g/kg、0g/kg(NS 0.4ml/10gb.w.)，按不同浓度同体积给药，0.4ml/10g ig，观察14天，每天一次，记录逐日的小鼠毒性反应及死亡数，死亡动物即时尸体解剖，肉眼观察各主要脏器，取心、肝、脾、肺、肾、胃等主要脏器，10％甲醛固定，病理切片检查。存活动物至实验结束处死，取主要脏器病理检查。

同上述试验方法对参比实施例5制备的美洲大蠊水提物进行小鼠急性毒性实验处理，观察17天，做好相应记录。

1.1.2试验结果

1.1.2.1实施例1制备的美洲大蠊酶解物：

(1)给予一次大剂量(30.4g/kg)ig小鼠后,小鼠出现的症状反应为:大多小鼠活动减少，俯卧，对外界刺激反应迟缓，皮肤体温略有下降，部分动物翻正反射消失，呼吸频率减慢，幅度变弱，直至呼吸停止，在1～8小时内死亡情况见表3，存活动物上述症状反应在10～14小时内逐渐消失，恢复正常状态，活动、饮食、饮水均恢复至正常，直至存活14天未见异常情况出现。

(2)死亡小鼠尸检情况：经尸体解剖，观察肉眼观察各主要脏器，仅胃肠内有大量清稀液体，其余各脏器均未见肉眼可见异常病变，取心、肝、脾、肺、肾、胃等主要脏器10％甲醛固定，病理切片检查后，发现毒性作用器官主要在胃，胃的损伤主要体现在胃黏膜开始脱落，未见出血症状。

(3)给药后恢复14天小鼠的解剖结果：心、肝、脾、肺、肾和胃几个脏器未见明显病变。由此说明实施例1制备的美洲大蠊酶解物造成的小鼠心、肝、脾、肺、肾、胃等主要脏器的损伤有自愈的可能。

1.1.2.2参比实施例5制备的美洲大蠊水提物：

(1)给予一次大剂量(30.4g/kg)ig小鼠后,小鼠出现的症状反应为:大多小鼠活动减少，俯卧，对外界刺激反应迟缓，部分动物皮肤温度下降，翻正反射消失，呼吸频率减慢，幅度变弱，直至呼吸停止，在1～5小时内死亡情况见表3，存活动物上述症状反应在18～24小时内逐渐消失，恢复正常状态，活动、饮食、饮水均恢复至正常，直至存活17天未见异常情况出现。

(2)死亡小鼠尸检情况：经尸体解剖，观察肉眼观察各主要脏器，胃肠内有大量清稀液体，其余各脏器均未见肉眼可见异常病变，取心、肝、脾、肺、肾、胃等主要脏器10％甲醛固定，病理切片检查后，发现毒性作用器官主要在胃，胃的损伤主要体现在胃黏膜坏死脱落，且有出血症状。

(3)给药后恢复17天小鼠的解剖结果：心、肝、脾、肺、肾和胃几个脏器未见明显病变。

1.1.2.3实施例1和参比实施例5所述的药物对小鼠的LD₅₀测定结果如表3和表4

表3 实施例1制备的美洲大蠊酶解物对小鼠的LD₅₀

根据表3中的数据按照寇氏法最终计算得到的本发明实施例1所述的美洲大蠊酶解物对小鼠的LD₅₀＝28.7g/kg；LD₅₀的95％可信区间：27.0g/kg～30.3g/kg。

表4 参比实施例5制备的美洲大蠊水提物对小鼠的LD₅₀

根据表4中的数据按照寇氏法最终计算得到的本发明参比实施5所述的美洲大蠊水提物对小鼠的LD₅₀＝25.0g/kg；LD₅₀的95％可信区间：23.4g/kg～26.6g/kg。综上，水提法来制备美洲大蠊提取物，得到的提取物对小鼠的半数致死量LD₅₀(参比实施例5)小于使用酶解法制备的美洲大蠊提取物对小鼠的半数致死量LD₅₀(实施例1)，由此说明本发明所述的美洲大蠊酶解物在无毒性药物范围内，安全可靠。

实验例2 创面修复试验

1 对小鼠实验性烫伤的影响

分组：

取体重18～22g小鼠80只，雌雄各半，按性别与体重随机分为8组，分别为NS对照组，湿润烧伤膏对照组，给药组1～6(实施例1～4所述的美洲大蠊酶解物和参比实施例2～5制备的美洲大蠊提取物)。

试验方法：

将小鼠置于固定器内，小鼠右后足跖部位置于预先调至55℃恒温水浴中15秒，此后每隔半小时各组小鼠分别于右足跖部涂相对应的药物1次，共给药3次，4.5小时后将小鼠脱颈椎处死，于同一部位剪下两足跖部，用精密扭力天平称重，以每鼠右足重减去左足重量为肿胀度，将对照组和给药组的肿胀程度进行比较和统计学处理。结果见表5。

表5 提取物对小鼠实验性烫伤的影响

注：*:P<0.05与湿润烧伤膏组比较；**:P<0.01与对照组比较

结果显示，本发明所述实施例1-4制备的美洲大蠊酶解物对热水烫伤致小鼠足跖的肿胀度有不同程度的降低，数据显示实施例1-4与湿润烧伤膏组比较P<0.05,具有显著的统计学意义。而参比实施例2-5与湿润烧伤膏组比较不具有统计学意义。进而说明本发明所述的美洲大蠊酶解物对烫伤具有良好的保护和治疗作用。

2 对小鼠实验性烧伤的影响

分组：

取体重18～22g小鼠80只，雌雄各半，将中间挖空2cm×2cm的石棉纸置于小鼠背上，用微量移液器吸取100uL无水乙醇滴于20mg棉球上，置于暴露处，点火燃烧造成Ⅱ度烧伤模型。按性别与烧伤面积随机分为8组，分别为NS对照组，湿润烧伤膏对照组，给药组1～6(实施例1～4和参比实施例2～5制备的美洲大蠊提取物)。

实验方法：

各组分别涂药，连续涂20d，每天2次，换药前将创面清洗干净。观测小鼠烧伤面积和愈合情况，给药6天与13天，分别用数码相机拍照，用IPP5.1图像分析软件包测量各组动物烧伤面积。将所测结果进行t检验。结果见表6。

表6 提取物对小鼠实验性烧伤的影响

注：*:P<0.05与湿润烧伤膏组比较；**:P<0.05与对照组比较

结果显示，与对照组比较，给药4天、给药10天，实施例1-4制备的美洲大蠊酶解物对小鼠的创面结痂面积有一定的减少，且与湿润烧伤膏组相比具有显著的统计学意义，P<0.05，实施例1-4制备的美洲大蠊酶解物还能使创面愈合时间大大的缩短。与对照组相比，参比实施例2-5制备的美洲大蠊提取物(美洲大蠊醇提物和美洲大蠊水提物)对小鼠的创面结痂面积也有一定的减少，但是与湿润烧伤膏相比没有统计学意义。所以，本实验例表4中的结果说明本发明所述的美洲大蠊酶解物对小鼠实验性烧伤有明显的治疗作用，且效果显著。

实验例3 本发明所述的美洲大蠊酶解物对乙醇致小鼠溃疡的影响

1、实验材料

(1)受试药物及分组

实验分为随机分为8个组，每组动物10只，每组小鼠按照0.05g/ml/20g体重给药，具体分组情况如下：

空白对照组：纯水；

阳性药物组：达喜(铝碳酸镁片)，生产企业：拜耳医药保健有限公司；

治疗组1:实施例1所述的美洲大蠊酶解物；

治疗组2：实施例5所述的美洲大蠊酶解物；

治疗组3：参比实施例1所述的美洲大蠊酶解物；

治疗组4：参比实施例3所述的美洲大蠊醇提物；

治疗组5：参比实施例5所述的美洲大蠊水提物；

(2)实验动物

小鼠80只，KM种，SPF级，体重20～24g，雌雄各半，由成都达硕生物科技有限公司提供

2、实验方法

2.1药液的制备

将上述受试药物，分别制成浓度为0.05g/ml的药液；

2.2对胃溃疡粘膜的保护功能评价方法

2.2.1无水乙醇致小鼠胃粘膜损伤模型试验

将各组小鼠常规饲养3天后，按1ml/只进行灌胃给药，每天给药一次，连续10天，动物每3～4天称重一次，根据体重调整给药体积。

第9天给药后禁食24h，自由饮水，末次给药后1h，所有动物均ig无水乙醇0.2ml/只，1小时后处死动物，结扎幽门，1％甲醛固定，再结贲门，将胃剪下，放入10％甲醛溶液中浸泡1小时。沿胃大弯剖开胃，肉眼可见溃疡发生在胃窦部。将胃窦部剪下，采用数码相机拍照记录，将数码照片用Image-Pro Plus 6.0软件处理，记录溃疡区域面积和整个胃窦部面积，计算各小鼠的溃疡指数和溃疡抑制率。

溃疡指数(％)＝溃疡区域面积/胃窦部面积×100。

溃疡抑制率(％)＝(空白对照组溃疡指数-各给药组溃疡指数)/空白对照组溃疡指数×100。

2.2.2统计方法

数据采用表示，用SPSS 20.0软件进行统计，进行完全随机设计资料的方差分析和多重比较的统计分析，满足正态性和方差齐性采用Dunett检验，

否则采用Tamhane’s T2检验。

3、实验结果

(1)对小鼠体重的影响

各组小鼠连续给药10天，对小鼠体重的影响，结果见表7。

表7 对小鼠体重的影响

由表7可知，阳性药物组和治疗组与空白对照组比较，在各时间点对小鼠体重的影响无显著性差异，P>0.05。

(2)对无水乙醇致小鼠胃溃疡的影响，结果见表8。

表8 乙醇致小鼠胃溃疡的影响

注：与空白对照组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01；与阳性药物组比较，#表示P<0.05

由表8中的结果得知：实施例1和实施例5制备的美洲大蠊酶解物对乙醇致小鼠的胃溃疡的抑制率分别为73.64％、63.06％，是整个实验中抑制率最高的两组；与空白对照组比较均具有明显的统计学意义，P<0.01，与阳性药物组(达喜)比较也均具有明显的统计学意义，P<0.05。

治疗组2(实施例5)与治疗组3(参比实施例1)相比较，实施例5制备的美洲大蠊酶解物对乙醇致小鼠的胃溃疡的抑制率明显高于参比实施例1制备的美洲大蠊酶解物对乙醇致小鼠的胃溃疡的抑制率，说明实施例5制备的美洲大蠊酶解物具有显著的进步。

由实验例3中的结果得到，本发明所述的美洲大蠊酶解物具有很好的保护胃黏膜的功能。

综上所述，本发明所述的美洲大蠊酶解物中肽类成分含量高，色泽浅、腥臭味淡，毒性低，且能够在缩短创面愈合时间、在治疗烧烫伤以及溃疡具有显著疗效。

Claims (9)

1.一种美洲大蠊酶解物，其特征在于，制备方法包括以下步骤：

（1）取美洲大蠊干虫或鲜虫，粉碎后加入2～20倍原料药重量的纯水，混匀料液，调解pH值7.8，向料液中加入原料药重量4%的弹性蛋白酶，或加入原料药重量2%的中性蛋白酶、1.5%胰蛋白酶及1%木瓜蛋白酶的组合物；

（2）将步骤（1）中所述的料液置于20～60℃温度下水解2～8小时，过滤，冷藏去油脂后离心，将离心后的上清液浓缩，向浓缩液中加入乙醇至所得溶液中乙醇体积浓度为60%～90%，在0～10℃，静置12～24小时后，过滤，滤液回收乙醇，得回收乙醇后的滤液；

（3）取步骤（2）中得到的回收乙醇后的滤液，通过吸附树脂柱，纯水冲洗，收集流出液至流出液茚三酮反应呈阴性，然后流出液再通过粒度为100～200目的聚酰胺柱，纯水冲洗，并收集流出液至流出液茚三酮反应呈阴性；

（4）将步骤（3）中得到的最终流出液浓缩、干燥，即得美洲大蠊酶解物。

2.一种美洲大蠊酶解物，其特征在于，制备方法包括以下步骤：

（1）取美洲大蠊干虫或鲜虫，粉碎后加入2～20倍原料药重量的纯水，混匀料液，调解pH值8，向料液中加入原料药重量3%的胰蛋白酶，或加入原料药重量1%的胰蛋白酶和3%中性蛋白酶的组合物，或加入原料药重量1%的胰凝乳蛋白酶、1.5%中性蛋白酶及1%木瓜蛋白酶的组合物；

（2）将步骤（1）中所述的料液置于20～60℃温度下水解2～8小时，过滤，冷藏去油脂后离心，将离心后的上清液浓缩，向浓缩液中加入乙醇至所得溶液中乙醇体积浓度为60%～90%，在0～10℃，静置12～24小时后，过滤，滤液回收乙醇，得回收乙醇后的滤液；

（3）取步骤（2）中得到的回收乙醇后的滤液，通过吸附树脂柱，纯水冲洗，收集流出液至流出液茚三酮反应呈阴性，然后流出液再通过粒度为100～200目的聚酰胺柱，纯水冲洗，并收集流出液至流出液茚三酮反应呈阴性；

（4）将步骤（3）中得到的最终流出液浓缩、干燥，即得美洲大蠊酶解物。

3.一种美洲大蠊酶解物，其特征在于，制备方法包括以下步骤：

（1）取美洲大蠊干虫或鲜虫，粉碎后加入2～20倍原料药重量的纯水，混匀料液，调解pH值9，向料液中加入原料药重量10%的胰凝乳蛋白酶；

（2）将步骤（1）中所述的料液置于20～60℃温度下水解2～8小时，过滤，冷藏去油脂后离心，将离心后的上清液浓缩，向浓缩液中加入乙醇至所得溶液中乙醇体积浓度为60%～90%，在0～10℃，静置12～24小时后，过滤，滤液回收乙醇，得回收乙醇后的滤液；

（3）取步骤（2）中得到的回收乙醇后的滤液，通过吸附树脂柱，纯水冲洗，收集流出液至流出液茚三酮反应呈阴性，然后流出液再通过粒度为100～200目的聚酰胺柱，纯水冲洗，并收集流出液至流出液茚三酮反应呈阴性；

（4）将步骤（3）中得到的最终流出液浓缩、干燥，即得美洲大蠊酶解物。

4.一种美洲大蠊酶解物，其特征在于，制备方法包括以下步骤：

（1）取美洲大蠊干虫或鲜虫，粉碎后加入2～20倍原料药重量的纯水，混匀料液，调解pH值7.5，向料液中加入原料药重量5%的中性蛋白酶或4%的木瓜蛋白酶；

（2）将步骤（1）中所述的料液置于20～60℃温度下水解2～8小时，过滤，冷藏去油脂后离心，将离心后的上清液浓缩，向浓缩液中加入乙醇至所得溶液中乙醇体积浓度为60%～90%，在0～10℃，静置12～24小时后，过滤，滤液回收乙醇，得回收乙醇后的滤液；

（3）取步骤（2）中得到的回收乙醇后的滤液，通过吸附树脂柱，纯水冲洗，收集流出液至流出液茚三酮反应呈阴性，然后流出液再通过粒度为100～200目的聚酰胺柱，纯水冲洗，并收集流出液至流出液茚三酮反应呈阴性；

（4）将步骤（3）中得到的最终流出液浓缩、干燥，即得美洲大蠊酶解物。

5.根据权利要求1-4任一项所述的酶解物，其特征在于，步骤（1）中所述的纯水为原料药的10～20倍。

6.根据权利要求1-4任一项所述的酶解物，其特征在于，步骤（2）所述的水解时间为3.5～5小时。

7.根据权利要求1-4任一项所述的酶解物，其特征在于，步骤（2）所述离心的时间为15～60分钟，速率为10000转/分～28000转/分。

8.根据权利要求1-4任一项所述的酶解物，其特征在于，步骤（3）所述吸附树脂柱为极性、弱极性和非极性大孔树脂。

9.权利要求1-4任一项所述的美洲大蠊酶解物在制备治疗创面修复药物中的应用。