CN111850077A - 美洲大蠊多肽溶液的制备方法及美洲大蠊多肽溶液 - Google Patents

美洲大蠊多肽溶液的制备方法及美洲大蠊多肽溶液 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种美洲大蠊多肽溶液的制备方法及美洲大蠊多肽溶液，涉及多肽提取技术领域，本发明提供的美洲大蠊多肽溶液的制备方法，包括将预处理后的美洲大蠊依次经过醇提、酶解、水提和纯化后，得到所述美洲大蠊多肽溶液。该方法操作简单、成本较低，适于工业上推广应用。

Description

美洲大蠊多肽溶液的制备方法及美洲大蠊多肽溶液
技术领域
本发明涉及多肽提取技术领域，尤其是涉及一种美洲大蠊多肽溶液的制备方法及美洲大蠊多肽溶液。
背景技术
美洲大蠊，俗称蟑螂，是地球上最古老的昆虫之一，属于节肢动门、昆虫纲、蜚蠊目，是常见的医学昆虫。其因为繁殖快、数量多、难以消灭，特别是携带多种细菌等原因被人们视为害虫，但其顽强的生存能力却引起医学界的关注。
在我国古代，美洲大蠊就被视为一种药物，美洲大蠊经晒干后加工成粉末即可得美洲大蠊粉，美洲大蠊粉是中国传统医学药品之一，具有活血散瘀，解毒消疳，利尿消肿的作用。其功效在多部文献中有记载，《神农本草经》：主血瘀，症坚、寒热，破积聚，喉咽痹；《名医别录》：通利血脉；《唐本草》：食之下气；《本草纲目》：主瘀血，症坚，寒热，下气，利血脉；《分类草药性》：治一切饮食诸毒。同蜈蚣捣烂包鱼口，消疮，敷结毒，治喉娥；《陆川本草》：驱风解热，通血脉。治肿疡(外敷)。
经研究，美洲大蠊干虫体提取物，含有多元醇类、粘氨酸、粘糖氨酸、多肽以及多种氨基酸等活性物质。目前药学工作者普遍认为，美洲大蠊中蛋白质、氨基酸、肽类、含氮小分子等化学成分是其主要药效成分；且现在医学界发现美洲大蠊提取物在创面、黏膜修复方面具有很好的功效，故而美洲大蠊提取物，特别是氨基酸、肽类等很有研究意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种美洲大蠊多肽溶液的制备方法，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供应用上述的制备方法制备得到的美洲大蠊多肽溶液。
本发明提供了一种美洲大蠊多肽溶液的制备方法，包括将预处理后的美洲大蠊依次经过醇提、酶解、水提和纯化后，得到所述美洲大蠊多肽溶液。
进一步的，所述预处理包括粉碎处理和/或脱脂处理；
优选地，所述粉碎处理包括将干燥的美洲大蠊粉碎至＜60目；
优选地，所述脱脂处理包括将美洲大蠊置于有机溶剂中进行脱脂；
优选地，将美洲大蠊置于有机溶剂中24h以上进行脱脂；
优选地，所述有机溶剂的用量为美洲大蠊重量的4-6倍，优选为5倍；
优选地，所述有机溶剂包括乙酸乙酯；
优选地，所述脱脂次数为2-4次，优选为3次。
进一步的，所述醇提包括将预处理后的美国大蠊置于有机溶剂中，在70-80℃的条件下浸提7h以上，固液分离后收集醇提液；
优选地，所述浸提的次数为1-3次，优选为2次；
优选地，所述浸提的温度为80℃，浸提的时间8h；
优选地，所述有机溶剂优选为70％-80％(v/v)的乙醇溶剂，更优选包括80％(v/v)的乙醇溶剂；
优选地，所述有机溶剂的用量为美洲大蠊重量的4-6倍，优选为5倍。
进一步的，所述酶解包括向醇提过的虫渣中加入胰蛋白酶溶液进行浸提，将酶灭活后固液分离，收集酶解液；
优选地，浸提的温度为35-45℃，浸提的时间为1.5-2.5h；
优选地，浸提的温度为40℃，浸提的时间为2h；
优选地，所述胰蛋白酶溶液的用量为虫渣质量的4-6倍，优选为5倍；
优选地，所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的含量为0.2％-0.4％(w/v)，优选为0.3％(w/v)；
优选地，所述酶灭活的温度为75-85℃，时间为0.5-1.5h；
优选地，所述酶灭活的温度为80℃，时间为1h。
进一步的，所述水提包括向酶解后的虫渣中加入水，浸提后固液分离，得到水提液；
优选地，所述水提的温度为75-85℃，时间为2.5-3.5h；
优选地，所述水提的温度为80℃，时间为3h；
优选地，所述水的用量为虫渣质量的4-6倍，优选为5倍。
进一步的，在纯化前还包括将酶解得到的酶解液和水提得到的水提液混合并加入乙醇溶液进行醇沉，过滤后得到醇沉滤液；
优选地，所述乙醇溶液加入后的终浓度为75％-85％(v/v)，优选为80％(v/v)；
优选地，加入乙醇溶液后静置15h以上，然后过滤后得到醇沉滤液。
进一步的，在纯化前还包括浓缩的步骤；
优选地，将所述醇提液和醇沉滤液合并后减压浓缩掉无醇味溶液体积的1/2-2/3得到浓缩液，离心后得到粗提液；
优选地，将所述浓缩液静置12h以上再进行离心处理；
优选地，所述浓缩液静置温度为0-10℃；
优选地，所述减压浓缩的温度为40-60℃，优选为50℃；
优选地，所述离心的转速为5000-8000r/min，时间为30-60min。
进一步的，使用树脂进行纯化；
优选地，将所述粗提液通过大孔树脂，再经过水和有机溶剂洗脱后得到纯化液；
优选地，所述粗提液与大孔树脂的体积比为1:1-3，优选为1:2；
优选地，所述有机溶剂优选为乙醇溶剂，更优选包括10％-30％(v/v)的乙醇溶剂，进一步优选包括20％(v/v)的乙醇溶剂；
优选地，上样速度为0.5-1.0BV/h；
优选地，使用纯化水水洗1.5-2.5BV后使用20％(v/v)的乙醇溶剂洗脱3.0-4.0BV，收集流出液；
优选地，将流出液进行减压浓缩，至体积为上样体积时停止浓缩，得到所述纯化液；
优选地，所述减压浓缩的温度为40-60℃，优选为50℃；
优选地，所述树脂包括HB16、HB60或LX-D4。
进一步的，还包括对得到的美洲大蠊多肽溶液进行贮存的步骤；
优选地，通过向美洲大蠊多肽溶液加入防腐剂进行贮存；
优选地，所述防腐剂包括苯氧乙醇、聚六亚甲基双胍、山梨酸钾、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯或尼泊金丙酯中的一种或多种；
优选地，所述贮存的温度为20-25℃。
另外，本发明还提供了应用上述的制备方法制备得到的美洲大蠊多肽溶液。
与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明提供的美洲大蠊多肽溶液的制备方法，包括将预处理后的美洲大蠊依次经过醇提、酶解、水提和纯化后，得到所述美洲大蠊多肽溶液。其中，利用醇提法对预处理后的美洲大蠊进行提取，能够将其体内原有的大部分多肽提取出来，然后再利用生物酶解法对虫体中的大分子蛋白、多肽进行切割分解，进行进一步的提取，极大的提高了美洲大蠊中多肽的提取效率。并且，通过醇提和酶解的组合，既将美洲大蠊体内原有的抗菌多肽分离出来，又得到了酶解的小分子多肽，可以较大程度的提高其药用价值的可用度。最后经纯化处理，使得制备得到的美洲大蠊多肽溶液具有更高的纯度。该方法操作简单、成本较低，适于工业上推广应用。
本发明提供的美洲大蠊多肽溶液，应用本发明提供的制备方法制备得到，其有效成分为多肽。该美洲大蠊多肽溶液中含有美洲大蠊体内原有抗菌肽，同时又含有酶解的小分子肽，整体易于吸收利用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的美洲大蠊多肽溶液的制备流程图，其中虚线框内每步需要保留虫渣。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，提供了一种美洲大蠊多肽溶液的制备方法，包括将预处理后的美洲大蠊依次经过醇提、酶解、水提和纯化后，得到所述美洲大蠊多肽溶液。
本发明提供的美洲大蠊多肽溶液的制备方法中，利用醇提法对预处理后的美洲大蠊进行提取，能够将其中的大部分多肽提取出来，然后再利用生物酶解法对虫体中的大分子蛋白、多肽进行切割分解，进行进一步的提取，极大的提高了美洲大蠊中多肽的提取效率。并且，通过醇提和酶解的组合，既将美洲大蠊体内原有的抗菌多肽分离出来，又得到了酶解的小分子多肽，可以较大程度的提高其药用价值的可用度。能够进一步提高多肽的提取效率。最后经纯化处理，使得制备得到的美洲大蠊多肽溶液具有更高的纯度。该方法操作简单、成本较低，适于工业上推广应用。
在一些优选的实施方式中，所述预处理包括粉碎处理和/或脱脂处理。
粉碎处理能够将增加美洲大蠊提取原料与提取试剂的接触面积，有效提高提取效率。
脱脂处理能够提前将可能提取到的非目标产物分离出去，有效提高提取物纯度，同时也便于后续的分离纯化。
需要说明的是，本发明中的“和/或”表示“和”或者“或”，具体地预处理可以单独包括粉碎处理，或者单独包括脱脂处理，或者同时包括粉碎处理和脱脂处理。当同时包括粉碎处理和脱脂处理时，优先进行粉碎处理，然后再进行脱脂处理。
优选地，所述粉碎处理包括将干燥的美洲大蠊粉碎至＜60目，得到的美洲大蠊粉碎物可以具有相同的粒径，也可以粒径不同，本发明对此不作限定。
优选地，所述脱脂处理包括将美洲大蠊置于有机溶剂中进行脱脂，优选置于有机溶剂中24-30h进行脱脂。通过24-30小时的脱脂处理，使脱脂更彻底，非目标产物分离效果更好。
优选地，所述有机溶剂的用量为美洲大蠊重量的4-6倍，优选为5倍；
优选地，所述脱脂次数为2-4次，优选为3次。
通过对有机溶剂用量及脱脂次数的限定，能够在保证脱脂效果的基础上有效节约成本。
优选地，所述有机溶剂包括乙酸乙酯。
在一些优选的实施方式中，所述醇提包括将预处理后的美国大蠊置于有机溶剂中，在70-80℃的条件下浸提7h以上，固液分离后收集醇提液；其中温度例如可以为，但不限于70℃、72℃、74℃、76℃、78℃或80℃，时间例如可以为，但不限于7h、7.5h、8h、8.5h等。优选浸提的温度为80℃，浸提的时间为8h。
本实施方式利用多肽在热环境下溶解度更高的特性，通过对醇提的温度和时间进行限定，能够进一步提高多肽的提取效率。
优选地，所述浸提的次数为1-3次，优选为2次。
需要进行说明的是，多次浸提指的是，将固液分离后的虫渣置于有机溶剂中，在70-80℃的条件下浸提7h以上，固液分离后收集清液，如此循环。
优选地，所述有机溶剂优选包括70％-80％(v/v)的乙醇溶剂，更优选包括80％(v/v)的乙醇溶剂；
优选地，所述有机溶剂的用量为美洲大蠊重量的4-6倍，优选为5倍。
在一些优选的实施方式中，所述酶解包括向醇提过的虫渣中加入胰蛋白酶溶液进行浸提，将酶灭活后固液分离，收集酶解液。
优选地，浸提的温度为35-45℃，浸提的时间为1.5-2.5h；优选浸提的温度为40℃，浸提的时间为2h。
胰蛋白酶在合适的温度下进行酶解时，能够保证胰蛋白酶保持较高的活性，提高酶解效率。
优选地，所述胰蛋白酶溶液的用量为虫渣质量的4-6倍，优选为5倍。
优选地，所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的含量为0.2％-0.4％(w/v)，优选为0.3％(w/v)。
优选地，所述酶灭活的温度为75-85℃，时间为0.5-1.5h；优选酶灭活的温度为80℃，时间为1h。
通过选择合适的温度对胰蛋白酶进行灭活，既能够保证了酶的灭活效果，又避免导致目标产物多肽的失活。
在一些优选的实施方式中，所述水提包括向酶解后的虫渣中加入水，浸提后固液分离，得到水提液。
通过水提提取酶解后虫渣中可能未酶解的多肽，能够进一步提高多肽的提取效率。
优选地，所述水提的温度为75-85℃，时间为2.5-3.5h；优选水提的温度为80℃，时间为3h。
通过对水提的温度和时间进行进一步的限定，能够在保证水提效率的前提下避免目标多肽失活，有效节约成本提高提取效率。
优选地，所述水的用量为虫渣质量的4-6倍，优选为5倍。
在一些优选的实施方式中，在纯化前还包括将酶解得到的酶解液和水提得到的水提液混合并加入乙醇溶剂，过滤后得到醇沉滤液。
通过醇沉法能够将目标多肽溶于乙醇溶液，无用的杂质则形成沉淀，能够有效去除杂质，保留目标多肽。
优选地，所述乙醇溶液加入后的终浓度为75％-85％，例如可以为，但不限于75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％(v/v)或85％，优选为80％。
优选地，加入乙醇溶液后静置15h以上，然后过滤后得到醇沉滤液。
通过静置一定的时间，能够使醇沉反应更彻底，杂质去除效率更高。
在一些优选的实施方式中，在纯化前还包括浓缩的步骤。
浓缩可以去除美洲大蠊多肽醇沉滤液中的乙醇溶液以及部分水分，减少浓缩液体积，提高了美洲大蠊多肽的纯化效率。
优选地，将所述醇提液和醇沉滤液合并后减压浓缩掉无醇味溶液体积的1/2-2/3得到浓缩液，离心后得到粗提液。
优选地，将所述浓缩液静置12h以上再进行离心处理。
优选地，所述浓缩液静置温度为0-10℃；
优选地，所述减压浓缩的温度为40-60℃，例如可以为，但不限于40℃、45℃、50℃、55℃或60℃，优选为50℃。
优选地，所述离心的转速为5000-8000r/min，例如可以为，但不限于5000r/min、5500r/min、6000r/min、6500r/min、7000r/min、7500r/min或8000r/min；时间为30-60min，例如可以为，但不限于30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min。
在一些优选的实施方式中，使用树脂进行纯化；
优选地，将所述粗提液通过大孔树脂，再经过水和有机溶剂洗脱后得到纯化液。
优选地，所述粗提液与大孔树脂的体积比为1:1-3，优选为1:2。
优选地，所述有机溶剂优选包括乙醇溶剂，更优选包括10％-30％的乙醇溶剂，例如可以为，但不限于10％、15％、20％、25％或30％，进一步优选包括20％的乙醇溶剂。
优选地，上样速度为0.5-1.0BV/h，例如可以为，但不限于0.5BV/h、0.6BV/h、0.7BV/h、0.8BV/h、0.9BV/h或1.0BV/h。
优选地，使用纯化水水洗1.5-2.5BV后使用20％(v/v)的乙醇溶剂洗脱3.0-4.0BV，收集流出液。
优选地，将流出液进行减压浓缩，至体积为上样体积时停止浓缩，得到所述纯化液。
需要说明的是，在本实施方式中，“至体积为上样体积”指的是将流出液进行减压浓缩至流出液的体积为上样前的体积，该体积可以与上样前的体积相同或基本相同，基本相同指的是上下相差不大于5％。
优选地，所述减压浓缩的温度为40-60℃，例如可以为，但不限于40℃、42℃、45℃、48℃或50℃，优选为50℃。
优选地，所述树脂包括HB16、HB60或LX-D4。
在一些优选的实施方式中，还包括对得到的美洲大蠊多肽溶液进行贮存的步骤。
优选地，通过向美洲大蠊多肽溶液加入防腐剂进行贮存。
通过添加防腐剂，能够有效延长美洲大蠊多肽的保质期限，便于储存，节约成本。
优选地，所述防腐剂包括苯氧乙醇、聚六亚甲基双胍、山梨酸钾、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯或尼泊金丙酯中的一种或多种。
需要说明的是，“一种或多种”指的是本发明所使用的防腐剂可以仅包含单独的苯氧乙醇、单独的聚六亚甲基双胍、单独的山梨酸钾、单独的尼泊金甲酯、单独的尼泊金乙酯或单独的尼泊金丙酯；或者包含上述各防腐剂中的两种，例如包含苯氧乙醇和聚六亚甲基双胍、尼泊金甲酯和尼泊金乙酯；或者包含上述各防腐剂中的三种或三种以上，例如包含聚六亚甲基双胍、山梨酸钾和尼泊金甲酯，或者同时包含苯氧乙醇、聚六亚甲基双胍、山梨酸钾、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯和尼泊金丙酯。
优选地，所述贮存的温度为20-25℃，例如可以为，但不限于20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃。在常温下对防腐剂处理后的美洲大蠊多肽溶液进行贮存即可。
具体地，本发明提供的美洲大蠊多肽溶液的制备方法可以包括如下步骤：
(1)原料预粉碎：干美洲大蠊经粉碎机粉碎成＜60目的粉末。
(2)脱脂：加入美洲大蠊干粉5B量的有机溶剂，搅拌均匀后室温静置24h以上，将清液排除，虫渣继续加入5B量的有机溶剂进行脱脂，共脱脂3次后，保留脱脂虫渣。
(3)醇提：加入美洲大蠊干粉5B量乙醇度为80％的乙醇溶液，于80℃保温浸提7h以上，固液分离，收集清液并保留虫渣，虫渣继续加入5B量乙醇溶液重复浸提一次，固液分离后将两次醇提液合并，虫渣保留用于下一步。
(4)酶解：向已经醇提过的虫渣中加入美洲大蠊干粉5B量的纯化水和0.3％的胰蛋白酶，搅拌均匀后于40℃保温浸提2h，再升温至80℃并保温1h以灭活胰蛋白酶，固液分离，收集酶解液并保留虫渣。
(5)水提：虫渣继续加入美洲大蠊干粉5B量的纯化水于80℃保温浸提3h，固液分离，将虫渣排废，浸提液和酶解液合并；向酶解合并液中添加乙醇至溶液乙醇度达到80％并静置15h以上，过滤后得醇沉滤液。
(6)粗提液制备：将醇提液与醇沉滤液合并后于50℃减压浓缩，溶液无醇味后再浓缩约1/3体积，停止浓缩，将浓缩液低温静置12h以上，再经过离心处理，即得粗提液。
(7)树脂纯化：将粗提液按照料液与树脂体积约为1:2、以(0.5-1.0)BV/h的流速上柱，使用纯化水水洗2.0BV后使用20％乙醇洗脱(3.0-4.0)BV，收集所有流出液。将流出液于50℃减压浓缩至浓缩液体积与上柱液体积基本一致时，停止浓缩。浓缩液离心后得到多肽纯化液。
(8)多肽纯化液的贮存：纯化液中按照重量百分比添加防腐剂后，室温贮存。
根据本发明的第二个方面，还提供了应用上述的制备方法制备得到的美洲大蠊多肽溶液。
本发明提供的美洲大蠊多肽溶液，应用本发明提供的制备方法制备得到，其有效成分为多肽。该美洲大蠊多肽溶液中含有美洲大蠊体内原有抗菌肽，同时又含有酶解的小分子肽，整体易于吸收利用。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
本实施例提供的一种美洲大蠊多肽溶液的制备方法，包括如下步骤(如图1所示)：
(1)原料预粉碎：美洲大蠊干燥虫体经粉碎机粉碎后过60目筛网，得美洲大蠊粉末。
(2)脱脂：取500g美洲大蠊粉末于500ml锥形瓶中，加入2500ml乙酸乙酯，充分摇匀后静置24h，过滤，将清液排除，虫渣继续加入2500ml乙酸乙酯，充分摇匀后静置24h脱脂，过滤，虫渣继续加入乙酸乙酯脱脂，共脱脂3次后，得美洲大蠊脱脂虫渣。
(3)醇提：向美洲大蠊脱脂虫渣中加入2500ml 80％乙醇溶液，于80℃保温浸提8h，过滤，收集清液，虫渣继续加入2500ml 80％乙醇溶液重复浸提一次，过滤后将两次醇提液合并，虫渣保留用于下一步。
(4)酶解：向上步所得虫渣中加入2500ml的纯化水和1.5g(0.3％)的胰蛋白酶，搅拌均匀后于40℃保温浸提2h，再升温至80℃并保温1h以灭活胰蛋白酶，过滤，收集酶解液。
(5)水提：虫渣继续加入2500ml的纯化水于80℃保温浸提3h，过滤，虫渣排废，浸提液和酶解液合并；向酶解合并液中添加乙醇至溶液乙醇度达到80％并静置18h以上，过滤后得醇沉滤液。
(6)粗提液制备：将醇提液与醇沉滤液合并后于50℃减压浓缩，溶液无醇味后再浓缩约1/3体积，停止浓缩，最终体积3520ml，将浓缩液低温静置20h，再分次经5000r/min，离心30min，将清液混合，即得粗提液。
(7)树脂纯化：将粗提液以(0.5-1.0)BV/h的流速上约8000ml的树脂柱，上柱结束后使用纯化水水洗约15000ml后使用20％乙醇洗脱约30000ml(流速不变)，收集所有流出液，共约53000ml。将流出液于50℃减压浓缩至浓缩液体积约3500ml时停止浓缩，使用少量纯化水冲洗旋转蒸发仪后，冲洗液与浓缩液合并，最终得浓缩液3470ml。浓缩液分次离心后，将清液合并，得到多肽纯化液。
(8)多肽纯化液的贮存：纯化液中按照体积添加0.3％山梨酸钾后，室温贮存。
实施例2
本实施例提供的一种美洲大蠊多肽溶液的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料预粉碎：美洲大蠊干燥虫体经粉碎机粉碎后过70目筛网，得美洲大蠊粉末。
(2)脱脂：取500g美洲大蠊粉末于500ml锥形瓶中，加入2000ml乙酸乙酯，充分摇匀后静置24h，过滤，将清液排除，虫渣继续加入2000ml乙酸乙酯，充分摇匀后静置30h脱脂，过滤，虫渣继续加入乙酸乙酯脱脂，共脱脂2次后，得美洲大蠊脱脂虫渣。
(3)醇提：向美洲大蠊脱脂虫渣中加入2000ml 70％乙醇溶液，于70℃保温浸提7h，过滤，收集清液，虫渣继续加入2000ml 70％乙醇溶液重复浸提一次，过滤后将两次醇提液合并，虫渣保留用于下一步。
(4)酶解：向上步所得虫渣中加入2000ml的纯化水和1.5g(0.2％)的胰蛋白酶，搅拌均匀后于35℃保温浸提1.5h，再升温至75℃并保温0.5h以灭活胰蛋白酶，过滤，收集酶解液。
(5)水提：虫渣继续加入2000ml的纯化水于75℃保温浸提2.5h，过滤，虫渣排废，浸提液和酶解液合并；向酶解合并液中添加乙醇至溶液乙醇度达到75％并静置15h以上，过滤后得醇沉滤液。
(6)粗提液制备：将醇提液与醇沉滤液合并后于40℃减压浓缩，溶液无醇味后再浓缩约1/2体积，停止浓缩，将浓缩液低温静置12h，再分次经6000r/min，离心40min，将清液混合，即得粗提液。
(7)树脂纯化：将粗提液以(0.5-1.0)BV/h的流速上约8000ml的树脂柱，上柱结束后使用纯化水水洗约12000ml后使用10％乙醇洗脱约24000ml(流速不变)，收集所有流出液。将流出液于40℃减压浓缩至浓缩液体积约上样体积时停止浓缩，使用少量纯化水冲洗旋转蒸发仪后，冲洗液与浓缩液合并。浓缩液分次离心后，将清液合并，得到多肽纯化液。
(8)多肽纯化液的贮存：纯化液中按照体积添加0.3％有效浓度的聚六亚甲基双胍后，室温贮存。
实施例3
本实施例提供的一种美洲大蠊多肽溶液的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料预粉碎：美洲大蠊干燥虫体经粉碎机粉碎后过65目筛网，得美洲大蠊粉末。
(2)脱脂：取500g美洲大蠊粉末于500ml锥形瓶中，加入3000ml乙酸乙酯，充分摇匀后静置24h，过滤，将清液排除，虫渣继续加入3000ml乙酸乙酯，充分摇匀后静置28h脱脂，过滤，虫渣继续加入乙酸乙酯脱脂，共脱脂4次后，得美洲大蠊脱脂虫渣。
(3)醇提：向美洲大蠊脱脂虫渣中加入3000ml 75％乙醇溶液，于75℃保温浸提7h，过滤，收集清液，虫渣继续加入3000ml 75％乙醇溶液重复浸提一次，过滤后将两次醇提液合并，虫渣保留用于下一步。
(4)酶解：向上步所得虫渣中加入3000ml的纯化水和1.5g(0.4％)的胰蛋白酶，搅拌均匀后于45℃保温浸提2.5h，再升温至85℃并保温1.5h以灭活胰蛋白酶，过滤，收集酶解液。
(5)水提：虫渣继续加入3000ml的纯化水于85℃保温浸提3.5h，过滤，虫渣排废，浸提液和酶解液合并；向酶解合并液中添加乙醇至溶液乙醇度达到75％并静置15h以上，过滤后得醇沉滤液。
(6)粗提液制备：将醇提液与醇沉滤液合并后于60℃减压浓缩，溶液无醇味后再浓缩约1/2体积，停止浓缩，将浓缩液低温静置12h，再分次经8000r/min，离心60min，将清液混合，即得粗提液。
(7)树脂纯化：将粗提液以(0.5-1.0)BV/h的流速上约8000ml的树脂柱，上柱结束后使用纯化水水洗约20000ml后使用30％乙醇洗脱约32000ml(流速不变)，收集所有流出液。将流出液于60℃减压浓缩至浓缩液体积约上样体积时停止浓缩，使用少量纯化水冲洗旋转蒸发仪后，冲洗液与浓缩液合并。浓缩液分次离心后，将清液合并，得到多肽纯化液。
(8)多肽纯化液的贮存：纯化液中按照体积添加0.3％苯氧乙醇后，室温贮存。
对比例1
本对比例提供的一种美洲大蠊多肽溶液的制备方法，与实施例1的区别在于，不包括醇提的步骤。
对比例2
本对比例提供的一种美洲大蠊多肽溶液的制备方法，与实施例1的区别在于，不包括酶解的步骤。
对比例3
本对比例提供的一种美洲大蠊多肽溶液的制备方法，与实施例1的区别在于，不包括水提的步骤。
对比例4
本对比例提供的一种美洲大蠊多肽溶液的制备方法，与实施例1的区别在于，不包括纯化的步骤。
实验例
验证应用上述各实施例和对比例提供的制备方法得到的美洲大蠊多肽溶液的提取率以及外观(目视)。其中，提取率的获取过程如下：
1.溶液多肽含量的检测：参照《中国药典》(2015年版)四部通则“0731蛋白质含量测定法：福林酚法(Lowry法)方法一”检测。具体如下：
试剂：碱性铜试液配制：
甲液：氢氧化钠10g，碳酸钠50g，纯化水400ml混合溶解；
乙液：硫酸铜0.25g，纯化水30ml溶解；酒石酸钾0.5g，纯化水50ml溶解；合并两种溶液；
临用前将甲乙两液混合，加入纯化水至500ml，即配制成碱性铜试液。
(1)对照品溶液的制备：精密称取22.4mg牛血清白蛋白对照品(BSA)置50ml容量瓶中，加入纯化水溶解至刻度，摇匀，配成0.448mg/ml的牛血清白蛋白对照品溶液。
(2)线性范围考察：精密吸取BSA对照品溶液0(空白)、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于10ml玻璃具塞试管中，加入纯化水至1.0ml，加5.00ml碱性铜试液混匀后放置10min，然后快速加入福林酚试剂4.0ml，快速摇匀，室温静置30min后，用紫外分光光度法测定其在500nm波长处的吸光度，以多肽浓度X为横坐标，吸光度Y为其纵坐标，制作BSA的标准曲线。
(3)量取适量美洲大蠊浓缩液于10ml玻璃具塞试管中，加入纯化水至1.0ml，加5.00ml碱性铜试液混匀后放置10min，然后快速加入福林酚试剂4.0ml，快速摇匀，室温静置30min后，用紫外分光光度法测定其在500nm波长处的吸光度，根据吸光度来计算样品浓度，从而计算收率。
2.收率＝(多肽浓度*浓缩液体积)/美洲大蠊干粉称量*100％。
最终实验结果如下表所示：
Figure BDA0002617995930000161
Figure BDA0002617995930000171
根据上述结果可知，应用本发明实施例1-3提供的提取方法提取得到的美洲大蠊多肽溶液的提取率和溶液状态均高于各对比例，说明应用本发明提供的美洲大蠊多肽溶液的制备方法，提取率更高、制备得到的美洲大蠊多肽溶液具有更高的纯度。
其中，实施例2较实施例1相比，虫渣颗粒虽小了，但获取的符合要求的虫渣量减少了，另外醇提溶液浓度较低、酶浓度较低、导致整体提取率相对较低，脱脂次数少导致提取液有油脂存在，影响外观和收率。实施例3较实施例1相比，脱脂次数多、醇提浓度较低、酶浓度较高导致收率略微降低，脱脂次数多、离心时间较长、纯化洗脱多增加了提取周期，故整体提取低较实施例1略低，周期长，其他无影响。由此说明，应用本发明优选的制备条件对美洲大蠊进行多肽溶液的提取，提取率更高、制备得到的美洲大蠊多肽溶液具有更高的纯度。
对比例1缺少醇提步骤，只是无体内天然肽，收率较实施例低(无醇提+纯化损失)；对比例2缺少酶解步骤，收率较实施例降低幅度较大(无酶解导致收率低+纯化损失)；对比例3缺少水提步骤，收率较实施例降低幅度也较大(无水提较无醇提损失差不多+纯化损失)；对比例4缺少纯化步骤，收率较实施例大(无纯化损失，收率最高)，但溶液浑浊。由此可知，只有应用本发明提供的美洲大蠊多肽溶液的制备方法，才能够有更高的提取率及更高的纯度。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种美洲大蠊多肽溶液的制备方法，其特征在于，包括将预处理后的美洲大蠊依次经过醇提、酶解、水提和纯化后，得到所述美洲大蠊多肽溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述预处理包括粉碎处理和/或脱脂处理；
优选地，所述粉碎处理包括将干燥的美洲大蠊粉碎至＜60目；
优选地，所述脱脂处理包括将美洲大蠊置于有机溶剂中进行脱脂；
优选地，将美洲大蠊置于有机溶剂中24-30h进行脱脂；
优选地，所述有机溶剂的用量为美洲大蠊重量的4-6倍，优选为5倍；
优选地，所述有机溶剂包括乙酸乙酯；
优选地，所述脱脂次数为2-4次，优选为3次。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述醇提包括将预处理后的美国大蠊置于有机溶剂中，在70-80℃的条件下浸提7h以上，固液分离后收集醇提液；
优选地，所述浸提的次数为1-3次，优选为2次；
优选地，所述浸提的温度为80℃，浸提的时间为7-8h，优选为8h；
优选地，所述有机溶剂为乙醇溶液，优选包括70％-80％(v/v)的乙醇溶剂，更优选包括80％(v/v)的乙醇溶剂；
优选地，所述有机溶剂的用量为美洲大蠊重量的4-6倍，优选为5倍。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解包括向醇提过的虫渣中加入胰蛋白酶溶液进行浸提，将酶灭活后固液分离，收集酶解液；
优选地，浸提的温度为35-45℃，浸提的时间为1.5-2.5h；
优选地，浸提的温度为40℃，浸提的时间为2h；
优选地，所述胰蛋白酶溶液的用量为虫渣质量的4-6倍，优选为5倍；
优选地，所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的含量为0.2％-0.4％(w/v)，优选为0.3％(w/v)；
优选地，所述酶灭活的温度为75-85℃，时间为0.5-1.5h；
优选地，所述酶灭活的温度为80℃，时间为1h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水提包括向酶解后的虫渣中加入水，浸提后固液分离，得到水提液；
优选地，所述水提的温度为75-85℃，时间为2.5-3.5h；
优选地，所述水提的温度为80℃，时间为3h；
优选地，所述水的用量为虫渣质量的2-4倍，优选为3倍。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在纯化前还包括将酶解得到的酶解液和水提得到的水提液混合并加入乙醇溶液进行醇沉，过滤后得到醇沉滤液；
优选地，所述乙醇溶液加入后的终浓度为75％-85％(v/v)，优选为80％(v/v)；
优选地，加入乙醇溶液后静置15h以上，然后过滤后得到醇沉滤液。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，在纯化前还包括浓缩的步骤；
优选地，将所述醇提液和醇沉滤液合并后减压浓缩掉无醇味溶液体积的1/2-2/3得到浓缩液，离心后得到粗提液；
优选地，将所述浓缩液静置12h以上再进行离心处理；
优选地，所述浓缩液静置温度为0-10℃；
优选地，所述减压浓缩的温度为40-60℃，优选为50℃；
优选地，所述离心的转速为5000-8000r/min，时间为30-60min。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，使用树脂进行纯化；
优选地，将所述粗提液通过大孔树脂，再经过水和有机溶剂洗脱后得到纯化液；
优选地，所述有机溶剂优选为乙醇溶剂，更优选包括10％-30％(v/v)的乙醇溶剂，进一步优选包括20％(v/v)的乙醇溶剂；
优选地，上样速度为0.5-1.0BV/h；
优选地，使用纯化水水洗1.5-2.5BV后使用20％(v/v)的乙醇溶剂洗脱3.0-4.0BV，收集流出液；
优选地，将流出液进行减压浓缩，至体积为上样体积时停止浓缩，得到所述纯化液；
优选地，所述减压浓缩的温度为40-60℃，优选为50℃；
优选地，所述树脂包括HB16、HB60或LX-D4。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括对得到的美洲大蠊多肽溶液进行贮存的步骤；
优选地，通过向美洲大蠊多肽溶液加入防腐剂进行贮存；
优选地，所述防腐剂包括苯氧乙醇、聚六亚甲基双胍、山梨酸钾、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯或尼泊金丙酯中的一种或多种；
优选地，所述贮存的温度为20-25℃。
10.应用权利要求1-9任一项所述的制备方法制备得到的美洲大蠊多肽溶液。
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