CN104341485A

CN104341485A - 美洲大蠊总蛋白的提取方法

Info

Publication number: CN104341485A
Application number: CN201410379560.2A
Authority: CN
Inventors: 王达宾; 苏柘僮; 熊永爱; 邹俊波; 姜小东; 郭华
Original assignee: CHENGDU BAICAO HEJI TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHENGDU BAICAO HEJI TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-08-02
Filing date: 2014-08-04
Publication date: 2015-02-11

Abstract

本发明提供了美洲大蠊总蛋白的提取方法，它包括如下操作步骤：取美洲大蠊药材，粉碎，以水为溶剂，于25～55℃下以闪式提取1～3次，每次加水10～22倍量，1～3min/次，提取电压为50～110V，水的pH为6～10。本发明通过对提取方法的筛选，最终得到了美洲大蠊的最佳闪式提取方法，能够保证较高的蛋白质收率基础上，缩短提取时间，为工业化大生产提供了可能。

Description

美洲大蠊总蛋白的提取方法

技术领域

本发明涉及美洲大蠊总蛋白的提取方法。

背景技术

美洲大蠊(Periplaneta americana Linnaeus)为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫。已有研究指出经提取、纯化而得的美洲大蠊蛋白具有良好的对抗四氯化碳所致小鼠急性肝损伤作用，本研究前期工作基础亦证实美洲大蠊的水闪式提取物药效明显，提示了闪式提取法应用于该活性部位制备过程的潜质，因此本研究拟以总蛋白含量为指标，对闪式提取法与传统提取方法展开比较，并应用闪式提取法对提取工艺进行单因素考察，以确定主要因素与水平，继而采用正交设计法优选闪式提取工艺，为动物药蛋白类热不稳定活性成分的提取建立技术平台。

中国专利申请：CN 103083363 A，公开了美洲大蠊提取物的制备方法，它是采用闪式提取方法进行提取的，其中，出膏率平均为47.59％，蛋白质含量可以达到约15mg/g。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提取效果更优异的美洲大蠊总蛋白的提取方法。

本发明提供了美洲大蠊总蛋白的提取方法，它包括如下操作步骤：

取美洲大蠊，粉碎，以水为溶剂，于25～55℃下以闪式提取1～3次，每次加水10～22倍量，1～3min/次，提取电压为50～110V，水的pH为6～10。

进一步地，提取温度为45～55℃，优选为45℃。

进一步地，闪式提取为1min/次，提取电压70V。

优选地，提取次数为3次。

进一步地，每次加水量为16～20倍。

优选地，每次加水量为20倍。

中国专利申请：CN 103083363 A中，并未提及任何关于溶剂pH与提取效果之间的关联。然而，本发明在研究中意外地发现，提取溶剂的pH对提取效果也有显著影响，因此，本发明中还对溶剂pH进行了考察：

进一步地，水的pH为8.3～9.3。在此条件下，提取效果优于纯水。

优选地，水的pH为8.8。

本发明通过对提取方法的筛选，最终得到了美洲大蠊的最佳闪式提取方法，能够保证较高的蛋白质收率基础上，缩短提取时间，为工业化大生产提供了可能。

本发明经实验验证，所得美洲大蠊闪式提取物中总蛋白质的含量和出膏率均明显优于专利号CN 103083363 A的专利公开方法所制备的美洲大蠊闪式提取样品。

具体实施方式

实施例1 本发明提取方法

取美洲大蠊药材，粉碎，以水溶溶剂，于45℃下以闪式提取3次，每次加水20倍量，1min/次，提取电压为70V，水的pH为9.3。

实施例2 本发明提取方法

取美洲大蠊药材，粉碎，以水溶溶剂，于45℃下以闪式提取3次，每次加水20倍量，1min/次，提取电压为70V，水的pH为8.8。

实施例3 提取方法的筛选

1 材料

美洲大蠊药材(购自云南腾冲，经生药教研室卢先明教授鉴定为蜚蠊科大蠊属昆虫美洲大蠊Periplaneta americana L.),考马斯亮蓝G250(成都市科龙化工试剂厂，批号20120924)。

JHBE-50T型闪式提取器(河南金鼐科技发展有限公司)，UV-1700型紫外-可见分光光度计(岛津制作所分析计测事业部)。

2 方法与结果

2.1 总蛋白含量测定方法

2.1.1 供试品溶液的制备方法

取药材适量，按各法提取，合并滤液。2.3项下滤液定容至500mL，作为储备液，精密吸取水提储备液8mL定容至25mL，作为供试品溶液；2.4项下滤液定容至1000mL，作为储备液，精密吸取水提储备液5或10mL定容至25mL，作为供试品溶液。

2.1.2 标准曲线的建立

以A₅₉₅为纵坐标，BSA浓度为横坐标，回归方程为y＝0.0041x+0.1500(r＝0.9995)，在30.69～153.45μg，其浓度与吸光度之间线性关系良好。

2.1.3 供试品溶液含量测定

精密吸取供试品液各1mL，按2.4.2显色，测定A₅₉₅。通过标准曲线计算总蛋白含量。

2.2 出膏率测定

按照2.1.1项下方法制备储备液，各取100mL置蒸发皿中，水浴挥干，105℃常压干燥至恒重，称定质量，计算出膏率。

2.3 提取工艺的单因素考察

药材全虫与最粗粉的前处理均为45℃烘干。提取后过滤、离心、合并滤液，分别按2.1.1、2.1.4项下方法制备供试品溶液并测定总蛋白含量，另按2.2项下方法测定出膏率。以总蛋白含量与出膏率为提取工艺考察的评价指标。

2.3.1 提取方法的确定

取最粗粉约25g，加入10倍量水，于25℃分别按闪式提取法(3min/次，70V)、回流提取法(1h/次)、搅拌提取法(12h/次)提取各2次。总蛋白含量和出膏率分别为19.03,7.74,6.01mg·g^-1和56.19％,46.64％,49.53％。闪式提取法能以最低的出膏率获得最高的总蛋白含量，符合制剂学减小剂量、提高疗效的要求。

2.3.2 溶剂种类的确定

取最粗粉约25g，分别加入10倍量纯水、碱水(pH＝9.0)、95％乙醇，于25℃按闪式提取法(3min/次，70V)提取2次。总蛋白含量和出膏率分别为19.03，19.80，10.17mg·g^-1和56.19％,56.63％,45.75％。以水为溶剂提取，总蛋白含量明显高于95％乙醇，因此后续研究以水为溶剂进行；而pH＝9的碱水又优于纯水，因此本发明拟对溶剂pH作出进一步考察。

2.3.3 药材投料状态的确定

取全虫和最粗粉适量，加入10倍量水，于25℃按闪式提取法(1min/次，70V)提取1次。总蛋白含量和出膏率分别为18.94,19.81mg·g^-1和52.06％,52.27％。两指标均接近，考虑到刀头的维护，后续研究以最粗粉投料。

2.3.4 提取次数考察

取最粗粉适量，加入10倍量水，于25℃按闪式提取法(1min/次，70V)各提取1,2,3,4次。随着提取次数的增加，总蛋白含量与出膏率有所增长，分别为19.01，19.13，19.77，19.83mg·g^-1和56.09％,56.21％,56.72％，56.74％，但逐渐趋于平稳,经3次提取总蛋白已基本提取完全。

2.3.5 提取温度考察

取最粗粉适量，分别于25,35,45,55℃下加入10倍量水，按闪式提取法(1min/次，70V)提取1次。在25-45℃，随着提取温度的升高，总蛋白含量与出膏率呈增长趋势，而在45-55℃呈下降趋势，分别为18.32，19.01，19.56，19.12mg·g^-1和55.17％,56.15％,56.34％，56.42％，推测在55℃左右某些蛋白的结构遭到破坏、产生絮凝，影响溶出。

2.3.6 提取时间考察

取最粗粉适量，加入10倍量水，于25℃按闪式提取法(各1,2,3,4min/次，70V)提取1次。结果提取时间不超过3min时，总蛋白含量与出膏率随时间增加而升高，而在4min略微下降，分别为18.47，19.13，19.69，19.44mg·g^-1和54.03％,56.11％,56.29％，56.47％，提示每次提取2-3min总蛋白可基本提取完全。

2.3.7 溶剂倍量考察

取最粗粉适量，分别加入10,14,18,22倍量水，于25℃按闪式提取法(1min/次，70V)提取1次。结果当溶剂倍量不超过18倍时，总蛋白含量与出膏率随其增加而显著升高，而在其达到22倍量时反而略微降低，分别为18.55，19.26，19.71，19.64mg·g^-1和52.09％,56.33％,56.68％，56.69％，提示料液比控制在1:18左右较为合理。

2.3.8 提取电压考察

取最粗粉适量，加入10倍量水，于25℃按闪式提取法(1min/次，各50,70,90,110V)提取1次。结果随着提取电压的升高，总蛋白含量与出膏率呈现先增后降的趋势，分别为18.63，19.81，19.49，19.42mg·g^-1和55.21％,56.56％,56.54％，56.72％，在70V时达到最高值，推测当提取电压超过70V时，刀头的高速转动可能造成提取液温度陡升，影响了总蛋白的溶出。该实验结果明显优于专利号CN 103083363 A的专利公开方法(80-120伏特电压下提取)所制备的美洲大蠊闪式提取样品。

2.3.9 溶剂pH考察

取最粗粉适量，分别加入10倍量pH＝6.3,7.3,8.3,9.3的水，于25℃按闪式提取法(1min/次，70V)提取1次。总蛋白和出膏率分别为：18.55，19.51，19.69，19.62mg·g^-1和55.55％,56.57％,56.82％，56.76％，从实验所得数据可知，总蛋白含量在pH＝8.33时最高，提示可控制溶剂pH在8.3～9.3。

单因素考察结果显示：各因素对总蛋白提取的影响顺序为提取次数>溶剂倍量>溶剂pH>提取电压>提取温度>提取时间，前三者作为主要因素，可选取较佳水平进一步优选提取工艺。

2.4 正交设计优选闪式提取工艺以总蛋白含量和出膏率为指标，固定次要因素水平为提取电压70V、提取温度45℃、提取时间2min，采用L₉(3⁴)正交表安排试验，因素水平表、试验结果及方差分析结果分别见表1～3。

表1 闪式提取工艺优选因素水平

表2 正交试验结果

表3 方差分析结果

F_0.05(2,2)＝19

根据直观分析结果可知各因素对美洲大蠊总蛋白得率影响程度为A＞C＞B，因而选定最佳提取工艺为A3C2B3；方差分析结果显示仅A因素具显著性影响，应选择提取3次作为最佳水平，且考虑到B因素会影响生产成本，因而选定最佳提取工艺为A3B1C2。按A3B3C2和A3B1C2分别进行验证，平行3份RSD＜3％，平均总蛋白含量分别为19.47,15.67mg·g^-1，平均出膏率为56.27％，49.89％，两法差异较大，确定提取3次、溶剂pH＝8.8、溶剂量20倍为最佳闪提工艺路线。

为了进一步说明本发明的有益效果，采用本发明同批次的原料，并使用CN 103083363 A最佳方案制备美洲大蠊闪式提取物。平行制备三份样品，测定提取物中总蛋白平均含量为16.59％，平均出膏率为50.33％。对比可见，本发明工艺无论是总蛋白含量还是出膏率，均优于CN 103083363 A。

Claims

1.美洲大蠊总蛋白的提取方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：提取温度为45～55℃，优选为45℃。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：闪式提取为1min/次，提取电压70V。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的提取方法，其特征在于：提取次数为3次。

5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：每次加水量为16～20倍。

6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于：每次加水量为20倍。

7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：水的pH为8.3～9.3。

8.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于：水的pH为8.8。