CN107028933B - 四氢穗花杉双黄酮在制备蛋白质n-乙酰葡萄糖胺修饰抑制剂中的应用 - Google Patents

四氢穗花杉双黄酮在制备蛋白质n-乙酰葡萄糖胺修饰抑制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了四氢穗花杉双黄酮在制备蛋白质N‑乙酰葡萄糖胺修饰抑制剂中的应用，四氢穗花杉双黄酮作用受体为N‑乙酰葡萄糖胺转移酶；四氢穗花杉双黄酮通过与UDP结合口袋内His920，Thr922和Lys842形成氢键，同时与尿嘧啶结合口袋附近的Asn557残基形成氢键，进而占据N‑乙酰葡萄糖胺转移酶的UDP结合口袋，抑制N‑乙酰葡萄糖胺转移酶活性。通过体外及细胞内的OGT抑制活性分析发现，四氢穗花杉双黄酮具有较好的OGT抑制活性，能够有效抑制蛋白质的O‑GlcNAc修饰。同时四氢穗花杉双黄酮不会影响细胞内蛋白质的其他糖基化修饰，说明四氢穗花杉双黄酮是特异性OGT抑制剂。

Description

四氢穗花杉双黄酮在制备蛋白质N-乙酰葡萄糖胺修饰抑制剂 中的应用
技术领域
本发明涉及四氢穗花杉双黄酮的新应用，具体涉及四氢穗花杉双黄酮在制备蛋白质N-乙酰葡萄糖胺修饰抑制剂中的应用，其对N-乙酰葡萄糖胺转移酶(OGT)的抑制作用。
背景技术
N-乙酰葡萄糖胺修饰(O-GlcNAc修饰)是一种普遍存在于胞内的蛋白质翻译后修饰，这种单糖修饰能够调节细胞质，线粒体和细胞核内多种蛋白质的功能。研究表明，O-GlcNAc糖基化修饰与几乎所有重大疾病和重要的生理病理过程相关。目前，细胞内已发现超过3000种蛋白能够发生O-GlcNAc修饰。
N-乙酰葡萄糖胺转移酶(OGT)通过将底物糖供体尿嘧啶二磷酸-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)上的N-乙酰葡萄糖胺部分，转移到底物蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基上，调控蛋白质的O-GlcNAc修饰。OGT存在于几乎所有的哺乳动物细胞内。OGT基因在生物体内组成型表达，敲除OGT基因都会导致生物体正常生理功能的变化，引起死亡。目前OGT与底物糖功能的共结晶已经得到解析，对其活性口袋与底物作用的氨基酸残基也得到了确认。既然OGT的活性与包括神经退行性疾病、糖尿病、癌症等一系列疾病的发生发展密切相关，那么通过化学手段抑制OGT活性，将有望调节这些生理过程。
四氢穗花杉双黄酮(L01)是一种天然产物，是穗花杉双黄酮的衍生物，化学名为：(2S)-8-(5-((S)-5,7-二羟基-4-氧代苯并二氢吡喃-2-基)-2-羟基苯)-5,7-二羟基-2-(4-羟基苯)苯并二氢吡喃-4-酮，结构式如下：
Figure BDA0001283614850000021
四氢穗花杉双黄酮来源于印度草药打印果，已报道的生物活性包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤等，但其分子机制不明。
发明内容
本发明旨在提供四氢穗花杉双黄酮在制备OGT抑制剂，抑制蛋白质O-GlcNAc修饰中的应用。
四氢穗花杉双黄酮在制备蛋白质N-乙酰葡萄糖胺修饰抑制剂中的应用，四氢穗花杉双黄酮作用受体为N-乙酰葡萄糖胺转移酶；四氢穗花杉双黄酮通过占据N-乙酰葡萄糖胺转移酶的UDP结合口袋抑制其活性。
进一步地，四氢穗花杉双黄酮通过与UDP结合口袋内His920，Thr922和Lys842形成氢键，同时与尿嘧啶结合口袋附近的Asn557残基形成氢键，进而占据N-乙酰葡萄糖胺转移酶的UDP结合口袋，抑制N-乙酰葡萄糖胺转移酶活性。
本发明的有益效果为：通过体外及细胞内的OGT抑制活性分析发现，四氢穗花杉双黄酮具有较好的OGT抑制活性，能够有效抑制蛋白质的O-GlcNAc修饰。同时四氢穗花杉双黄酮不会影响细胞内蛋白质的其他糖基化修饰，说明四氢穗花杉双黄酮是特异性OGT抑制剂。
附图说明
图1是UDP荧光法检测不同浓度的四氢穗花杉双黄酮在体外对OGT活性的抑制效果，进一步计算获得IC50值。
图2是UDP荧光法检测浓度固定，作用时间不同的四氢穗花杉双黄酮在体外对OGT活性的抑制效果。
图3是四氢穗花杉双黄酮与OGT蛋白结合的Autodock结果示意图。
图4是不同浓度四氢穗花杉双黄酮处理COS7细胞，利用Westernblot检测细胞内蛋白质的O-GlcNAc糖基化改变。
图5是浓度固定，作用时间不同的四氢穗花杉双黄酮处理COS7细胞，利用Westernblot检测细胞内蛋白质的O-GlcNAc糖基化改变。
图6是UDP荧光法检测不同浓度的四氢穗花杉双黄酮在体外对ppGalNAcT2酶活性的抑制效果。
图7是凝集素印迹法检测四氢穗花杉双黄酮对COS7细胞内蛋白其他糖基化修饰的影响。使用生物素标记的凝集素分别为：(A)sWGA；(B)ConA；(C)DBA；(D)JAC；(E)PNA；(F)RCA；(G)SBA；(H)UEA；(I)LL；(J)VVL。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从化学试剂公司购买。
实施例1：通过UDP发光法检测四氢穗花杉双黄酮在体外对OGT的抑制活性。
合成一个带有17个氨基酸的CKII3K肽段(氨基酸：KKKYPGGSTPVSSANMM)，采用UDP发光法在无细胞体系中检测OGT抑制剂活性。UDP发光法实验：用于该实验的UDP-Glo糖基转移酶活性检测试剂盒从Promega(目录号V6961)购买，实验步骤主要按照UDP-Glo实验产品说明书要求进行。
1.UDP发光法检测不同浓度的四氢穗花杉双黄酮在体外对OGT活性的抑制效果：测定IC50值的四氢穗花杉双黄酮作用浓度分别为0.025、0.076、0.23、0.69、2.1、6.2、18.5、56、167、500μM。实验中使用白色384孔板，利用荧光酶标仪检测。该实验以125μM CKII3K肽段为OGT受体，细胞外实验体系包含以下组分：pH7.4条件下，300nM大肠杆菌表达的His标签的OGT蛋白，125μM的CKII3K肽段，对应浓度的四氢穗花杉双黄酮和100μM的UDP-GlcNAc溶解在1×OGT反应缓冲液中。按照UDP-Glo试剂盒说明书要求，该反应体系在常温下孵育1小时后，加入等体积的UDP-Glo核苷酸检测试剂，混匀后在室温下孵育1小时。利用荧光酶标仪读取荧光发光值，数据由Microsoft Excel和Prism 6(Graphpad)软件分析，用蛋白抑制率对化合物剂量对数作图求出IC50值。
结果如附图1所示(数据表示为平均值±s.e.m.，n＝3)，随着四氢穗花杉双黄酮浓度的增加，OGT酶活性出现相应的降低，这说明四氢穗花杉双黄酮以浓度依赖方式在胞外抑制OGT的糖基转移酶活性，经计算其IC50值为21.8μM。
2.UDP发光法检测浓度固定，作用时间不同的四氢穗花杉双黄酮在体外对OGT活性的抑制效果：四氢穗花杉双黄酮浓度50μM，实验中使用白色384孔板，利用荧光酶标仪检测。该实验以125μM CKII3K肽段为OGT受体，细胞外实验体系包含以下组分：pH7.4条件下，300nM大肠杆菌表达的His标签的OGT蛋白，125μM的CKII3K肽段，50μM的四氢穗花杉双黄酮和100μM的UDP-GlcNAc溶解在1×OGT反应缓冲液中。按照UDP-Glo试剂盒说明书要求，该反应体系在常温下孵育时间在0、10、20、30、40、50、60分钟，然后加入等体积的UDP-Glo核苷酸检测试剂，混匀后在室温下孵育1小时。利用荧光酶标仪读取荧光发光值，数据由MicrosoftExcel和Prism 5(Graphpad)软件分析。
结果如附图2所示(数据表示为平均值±s.e.m.，n＝3)，随着四氢穗花杉双黄酮作用时间的增加，OGT酶活性出现相应的降低，这说明四氢穗花杉双黄酮以时间依赖方式在胞外抑制OGT的糖基转移酶活性。
实施例2：使用Autodock软件模拟计算四氢穗花杉双黄酮与OGT蛋白的结合模式。
OGT(PDB:3PE3)蛋白结构由蛋白质数据库Protein Data Bank(PDB)中获得。化合物的三维结构利用Chembio3D Ultra 11.0进行能量优化获得最优构象。使用AutoDockTools软件对蛋白文件和小分子配体(四氢穗花杉双黄酮)进行预处理，并使用AutoDock4.0软件的Lamarckian Genetic Algorithm(GA)算法进行分子对接计算，对接结果用AutoDockTools软件显示。在分子对接过程中，收集100个构象，考虑溶剂化效应，介电常数取基于距离的模式，与网格计算有关的其它参数取为默认值。配体每次允许移动最大距离为0.1nm；最大角度为180.00度；对小分子中需要自由旋转的化学键均匀许自由旋转；优化时极小化1000步。在此基础上综合考虑复合物能量与结构因素确定四氢穗花杉双黄酮与OGT蛋白的结合模式。
结果如附图3所示，四氢穗花杉双黄酮可以很好的模拟天然底物UDP与OGT蛋白形成相互作用，模拟UDP的磷酸基团的His920，Thr922和Lys842形成氢键，同时与尿嘧啶结合口袋附近的Asn557残基形成氢键。综上所述，四氢穗花杉双黄酮可以很好的占据OGT蛋白的UDP结合口袋，抑制OGT蛋白的糖基转移酶活性。
实施例3：通过Westernblot法检测四氢穗花杉双黄酮在细胞内对OGT的抑制活性。
1.利用不同浓度四氢穗花杉双黄酮处理COS7细胞，利用Westernblot检测细胞内蛋白质的O-GlcNAc糖基化改变：4小时葡萄糖饥饿后，将COS7细胞接种于6孔培养板培养(2×105个/孔)，分别加入溶于终浓度为0、10、50、100、150μM的四氢穗花杉双黄酮。药物作用6小时后收集细胞样品，以1×106/50μl细胞裂解液(6M尿素、2M硫脲、65mM DTT、4％CHAPS、40mM Trisbase)低温裂解，离心，取蛋白上清，按照1：1体积比混合2×样品缓冲，100℃煮沸样品5分钟，12％SDS-PAGE电泳并转膜，使用O-GlcNAc修饰抗体(CTD110.6，CST公司)检测目的蛋白，ECL显色法检测目的蛋白在细胞中的表达量(附图4)。从图中可以看出，随着四氢穗花杉双黄酮作用浓度升高，细胞内蛋白质的O-GlcNAc修饰水平降低，说明四氢穗花杉双黄酮可以在细胞内以浓度依赖方式抑制OGT活性，并降低细胞内蛋白质的O-GlcNAc修饰水平。
2.浓度固定，作用时间不同的四氢穗花杉双黄酮处理COS7细胞，利用Westernblot检测细胞内蛋白质的O-GlcNAc糖基化改变：将COS7细胞接种于6孔培养板(2×105个/孔)，加入终浓度为50μM的四氢穗花杉双黄酮，药物作用时间分别为0、2、4、6、8小时，收集细胞样品后，以1×106/50μl细胞裂解液(6M尿素、2M硫脲、65mM DTT、4％CHAPS、40mM Trisbase)低温裂解，离心，取蛋白上清，按照1：1体积比混合2×样品缓冲，100℃煮沸样品5分钟，12％SDS-PAGE电泳并转膜，使用O-GlcNAc修饰抗体(RL2，Abcam公司)检测目的蛋白，ECL显色法检测目的蛋白在细胞中的表达量(附图5)。使用GAPDH蛋白为内参。从图中可以看出，随着四氢穗花杉双黄酮作用时间延长，细胞内蛋白质的O-GlcNAc修饰水平降低，说明四氢穗花杉双黄酮可以在细胞内以时间依赖方式抑制OGT活性，并降低细胞内蛋白质的O-GlcNAc修饰水平。
实施例4：检测四氢穗花杉双黄酮作为OGT抑制剂的特异性。
1.通过UDP发光法检测四氢穗花杉双黄酮在体外对多肽半乳糖胺转移酶2(ppGalNAcT2)的抑制活性。合成一个带有9个氨基酸的EA2肽段(氨基酸序列为STTPAPTTK)。实验中使用白色384孔板，利用荧光酶标仪检测。该实验以EA2肽段为ppGalNAcT2受体，实验体系包含以下组分：pH7.4条件下，2ng/μL大肠杆菌表达的His标签的ppGalNAcT2蛋白，100μM的EA2肽段，对应浓度的四氢穗花杉双黄酮和100μM UDP-GalNAc溶解在1×ppGalNAcT2反应缓冲液中。按照UDP-Glo试剂盒说明书要求，该反应体系在常温下孵育1小时后，加入等体积的UDP-Glo核苷酸检测试剂，混匀后在室温下孵育1小时。利用荧光酶标仪读取荧光发光值，数据由Microsoft Excel和Prism 6(Graphpad)软件分析，用蛋白抑制率对化合物剂量对数作图求出IC50值。
结果如附图6所示(数据表示为平均值±s.e.m.，n＝3)，随着四氢穗花杉双黄酮浓度的增加，ppGalNAcT2酶活性虽然出现相应的降低，但四氢穗花杉双黄酮作用浓度已经远远大于OGT酶活性测定中所使用的浓度，这说明四氢穗花杉双黄酮在相近浓度下不能抑制ppGalNAcT2酶活性，经计算其IC50值大于500μM，表明四氢穗花杉双黄酮不能抑制其他与OGT作用机制相似的糖基转移酶。
2.凝集素印迹法检测四氢穗花杉双黄酮对COS7细胞内蛋白其他糖基化修饰的影响：4小时葡萄糖饥饿后，将COS7细胞接种于6孔培养板(2×105个/孔)，分别终浓度为50μM的四氢穗花杉双黄酮(使用50μM的OSMI-1为对照)，药物作用6小时后收集细胞样品后，以1×106/50μl细胞裂解液(6M尿素、2M硫脲、65mM DTT、4％CHAPS、40mM Trisbase)低温裂解，离心，取蛋白上清，按照1：1体积比混合2×样品缓冲，100℃煮沸样品5分钟，12％SDS-PAGE电泳并转膜，使用生物素标记的凝集素(sWGA，ConA，DBA，JAC，PNA，RCA，SBA，UEA，LL，VVL)检测目的蛋白质糖基化修饰改变，利用HRP标记链霉亲和素在ECL发光液作用下发光显影，使用GAPDH蛋白为内参。
结果如附图7所示，sWGA凝集素的功能与O-GlcNAc修饰抗体类似，故四氢穗花杉双黄酮与已报道的OGT抑制剂OSMI-1均能使sWGA的显影条带减弱，说明四氢穗花杉双黄酮能够抑制胞内蛋白的O-GlcNAc修饰。但其他凝集素的条带在四氢穗花杉双黄酮和OSMI-1的作用下没有出现明显变化，说明四氢穗花杉双黄酮不会影响蛋白质的其他糖基化修饰，是一种特异性的OGT酶抑制剂。

Claims (2)

1.四氢穗花杉双黄酮在制备体外蛋白质N-乙酰葡萄糖胺修饰抑制剂中的应用，其特征在于，四氢穗花杉双黄酮作用受体为N-乙酰葡萄糖胺转移酶；四氢穗花杉双黄酮通过占据N-乙酰葡萄糖胺转移酶的UDP结合口袋抑制其活性。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，四氢穗花杉双黄酮通过与UDP结合口袋中的His920，Thr922和Lys842形成氢键，同时与尿嘧啶结合口袋附近的Asn557残基形成氢键，进而占据N-乙酰葡萄糖胺转移酶的UDP结合口袋，抑制N-乙酰葡萄糖胺转移酶活性。
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