CN103083363A - 一种美洲大蠊提取物的制备方法及其新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种美洲大蠊提取物的制备方法，它包括如下步骤：（1）取美洲大蠊粗粉，加水，美洲大蠊粗粉与水的质量体积比为25：6~14，在电压80~120伏特条件下闪式提取2~3次，每次1~3min，得提取液；（2）离心步骤（1）所得提取液，得上清，浓缩，即得美洲大蠊提取物。本发明还公开了该方法制备的美洲大蠊提取物。本发明方法既可以有效保留美洲大蠊的营养成分，又可以显著提高收率，操作简便，具有较强的实际应用价值。

Description

一种美洲大蠊提取物的制备方法及其新用途
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及一种美洲大蠊提取物的制备方法。
背景技术
美洲大蠊（Periplaneta americana）为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，其入药始载于《神农本草经》，其中把它列为中品，谓“味：咸、寒；治：血瘀证坚寒热、破积聚、喉咽闭、内寒无子”。近些年来随着我国对传统中医药资源研究开发的重视，有些学者其进一步研究并取得了可喜的成就，以美洲大蠊醇提物纯化制成的产品“康复新液”，在烧伤、烫伤等外伤创面的治疗上取得的良好疗效。从美洲大蠊醇提物纯化精制而成的“心脉隆注射液”，具强心升压，改善微循环，兴奋呼吸，利尿，增加心、脑、肺、肾的血流量，其主治：右心衰，也可治急慢性心衰，失血性休克，低血压，室性早搏，病窦性综合症，心脑缺血性疾病。
目前，美洲大蠊的提取通常采用浸提法，如专利号：ZL200610021993.6，发明名称：“美洲大蠊提取物、含该提取物的药物组合物及其制备方法”的专利中公开了一种美洲大蠊提取的制备方法，包括如下步骤：a、取美洲大蠊粉碎，加石油醚，在温度5~20℃下浸泡，过滤，滤渣挥干；b、取步骤a所得滤渣，采用水提醇沉或醇提水沉法提取，静置；静置后的药液，弃上层油脂，过滤，得下层药液；其中，水提醇沉法中醇沉时，加入的乙醇浓度为：75~95%w/w；或，醇提水沉法时，加入的乙醇浓度为：60~80%w/w；c、所得b步骤所得药液，浓缩至相对密度为1.20~1.25，得清膏；d、按每1000g美洲大蠊使用40~60ml甘油的用量取甘油，与c步骤所述的清膏混合，即得美洲大蠊提取物。然而，该提取方法难以有效保留氨基酸和大分子蛋白质等有效成分，同时，收率也较低，仅为23%。
发明内容
本发明提供了一种美洲大蠊提取物的新制备方法。
本发明美洲大蠊提取物的制备方法，它包括如下步骤：
（1）取美洲大蠊粗粉，加水，美洲大蠊粗粉与水的质量体积比为25：6~14，在电压80~120伏特条件下闪式提取2~3次，每次1~3min，得提取液；
（2）离心步骤（1）所得提取液，得上清，浓缩，即得美洲大蠊提取物。
优选地，步骤（1）中，所述美洲大蠊粗粉与水的质量体积比为25：10~12。
进一步优选地，所述美洲大蠊粗粉与水的质量体积比为25：12。
优选地，步骤（1）中，所述闪式提取的电压为80伏特。
优选地，步骤（1）中，所述闪式提取的次数为2次。
优选地，步骤（1）中，所述闪式提取的时间为2~3min。
进一步优选地，所述提取时间为3min。
优选地，步骤（2）中，所述离心的转速为4000r/min，离心时间为30min。
优选地，步骤（2）中，所述浓缩采用冷冻干燥的方法。所述冷冻干燥的方法是：预冻24小时后，冷冻干燥48小时。
本发明还提供了前述方法制备的美洲大蠊提取物。
用本发明闪式提取方法制备美洲大蠊提取物，有效的保留了氨基酸、蛋白质等有效成分，收率高达47.59%，是专利号：ZL200610021993.6的专利公开的方法的2倍，并且操作简便，成本低廉，具有良好的应用价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
试验仪器和材料
仪器：UV1100紫外可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；酶标仪（美国Thermo公司）；Mili-Q超纯水处理仪（美国密理博公司）；恒温干燥箱（上海森杏实验有限公司，DGG-9240）；BP211D电子天平（德国Sartorius公司）；电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司,DZKW-4）；DL-360超声波清洗器；高速台式离心机（TGL-16G）；ALPHR1-4LSC冷冻干燥仪(Christ)；电磁炉；96孔酶标板（NUNC MaxiSorp）；蒸发皿；闪式提取器（型号JHBE-50型）。
材料：美洲大蠊药材；谷氨酸对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：G-025-110305）；茚三酮（天津市瑞金特化学品有限公司，批号：110518）；100T/96样考马斯亮蓝试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20110719）；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化亚锡均为分析纯。
吸水率测定方法:
称取美洲大蠊药材3份，每份100g，分别加入8倍量水，浸泡至透心，滤出全部未被吸收的水液，根据以下公式计算吸水率：
吸水率=吸水量/药材重量×100%=（加水量－滤出水的量）÷药材重量×100%
计算得到美洲大蠊药材的吸水率为140%，故在之后试验中补足吸水率140％进行试验。
实施例1  提取方法的初步筛选
根据参考文献以及常用中药提取方法，确定从渗漉法、冷浸法、超声法、回流法、闪式提取法五种方法中初筛适宜美洲大蠊药材有效成分提取的方法。根据参考文献，目前美洲大蠊药材的提取溶媒主要有水和不同浓度的乙醇，首先进行预试验，以美洲大蠊药材提取液中的氨基酸含量、蛋白质含量、干膏收率为指标，使用综合加权评分法，对五种提取方法的提取效果进行综合加权评分。最终优选出闪式提取法为最佳提取方法，进一步对闪式提取法进行工艺参数的筛选试验。
预试验得知乙醇浓度越高时，氨基酸和蛋白质的提取率越低，所以在考察提取方法时，除渗漉法以乙醇为溶媒外，其余方法均以水为提取溶媒。具体提取方法如下：
渗漉法：称取美洲大蠊药材粗粉25g，加20倍量60%的乙醇，静置16小时，以3ml/min的速度渗滤，提取液备用。
冷浸法：称取美洲大蠊药材粗粉25g，加10倍量的水，静置提取两次，每次24小时，离心，合并滤液。
超声法：称取美洲大蠊药材粗粉25g，加入10倍量的水，超声提取两次，每次30分钟，离心，合并滤液，备用。
回流法：称取美洲大蠊药材粗粉25g，加10倍量的水，回流提取两次，每次30分钟，离心，合并滤液，备用。
9061
闪式提取法：称取美洲大蠊药材粗粉25g，加10倍量的水，80伏特电压下闪式提取两次，每次2分钟，离心，合并滤液，备用。
试验以美洲大蠊药材提取液中的氨基酸含量、蛋白质含量、干膏收率为指标，使用综合加权评分法，对五种提取方法的提取效果进行综合加权评分。其中氨基酸、蛋白质等大类成分是药效成分，最为重要，故给予各0.35的权重系数，满分各为35分，干膏收率能侧面反映出固体成分的提取率，给予0.3的权重系数，满分为30分，总和为100分。考察结果如表1所示：
表1  不同提取方法考察结果
由表1可以看出，闪式提取法的综合评分最高，其中，干膏收率显著高，氨基酸含量显著高。
实验证明，闪式提取方法制备的美洲大蠊提取物氨基酸含量高，干膏收率高，提取时间短，综合考察显著优于其他提取方法。
下面对美洲大蠊闪式提取法进行参数优化：
实施例2  本发明闪式提取工艺的优化
预试验结果显示，提取次数对提取效率影响不大，所以确定闪式提取次数为两次，电压强度、溶剂用量、提取时间三个因素对提取效率影响较大，故对三个因素进行参数优化，筛选出最佳提取工艺。
1设计因素水平表
根据预试验，确定电压强度、溶剂用量、提取时间三个因素的考察范围，按L9(34)进行正交试验筛选出闪式提取美洲大蠊药材有效成分的最佳工艺，设计见表2。
表2  因素水平表
Figure BDA00002781056500051
2样品溶液制备
称取美洲大蠊药材粗粉25g，按表2的方案进行试验，离心，滤过，合并滤液，定容至1000ml。
3含量测定
取续滤液，按下述方法进行氨基酸含量测定、蛋白质含量测定、干膏收率测定。
⑴氨基酸的测定方法
根据预实验，确定以紫外-可见分光光度法测定提取液中氨基酸含量。
①对照品溶液的制备
取谷氨酸对照品适量，精密称定，加PBS液（pH=7.2~7.4），配制成1mg/ml的对照品母液。
②供试品溶液的制备
取0.3ml提取液（根据预实验所得结果），置于25ml容量瓶中，依次加入1.0ml PBS液（pH=7.2~7.4），0.5ml2%的茚三酮溶液，在沸水浴中加热15分钟，冷却后加纯水定容，即得。
标准曲线的绘制
取谷氨酸对照品母液，稀释10倍作为工作溶液，再取工作溶液2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5ml于一组25ml容量瓶中，各加1.0ml PBS缓冲液（pH=7.2~7.4），0.5ml2%的茚三酮溶液，在沸水浴中加热15分钟，冷却后加纯水定容，放置10分钟后，以不同浓度标准品的吸光度对应浓度绘制标准曲线，得到一元线性方程：Y=21.47X+0.1413，r2=0.9977，在0.008～0.022mg/ml范围内呈良好线性关系。
氨基酸的测定
取对照品或供试品置于25ml容量瓶中，加入1.0ml PBS液（pH=7.2~7.4），0.5ml2%的茚三酮溶液，在沸水浴中加热15分钟，冷却后加纯水定容。以相应试剂为空白，参照紫外-可见分光光度法，在570nm处测定吸光度。根据标准曲线换算出样品谷氨酸含量，并按以下公式由测定的谷氨酸含量计算样品总氨基酸含量：(W--氨基酸总量，%；C--根据标准曲线查得的谷氨酸量，mg；L1--试液总量，ml；L2--测定用试样量，ml；M--试样质量，g；m--试样干物率，%；测得此物干物率为92.11%)。
⑵蛋白质的测定方法
以各种方法的提取液为样品母液，按考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒说明书项下操作，分别配制空白液、蛋白标准液、样品测定液。精密吸取每类溶液3份于3个酶标板孔中，每孔200μl，放入酶标仪中测定各孔吸光度，按以下公式计算蛋白质含量。
Figure BDA00002781056500062
⑶干膏的测定方法
取250ml提取液置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴挥干，残渣于105℃烘箱干燥3小时，移置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量。由残渣重量与相应药材重量计算干膏收率。
4实验结果
以氨基酸含量、蛋白质含量和干膏收率为评价指标，采用加权评分法筛选最佳提取方法。评价指标中氨基酸和蛋白质含量较干膏收率重要，制定氨基酸含量、蛋白质含量、干膏收率的权重系数分别为0.35、0.35、0.3，综合评分=35×（氨基酸含量÷三种提取方法中氨基酸含量最大者）+35×（蛋白质含量÷三种方法中蛋白质含量最大者）+30×（干膏收率÷三种方法中干膏收率最大者），结果见表3~4。
表3闪式提取试验结果
Figure BDA00002781056500063
Figure BDA00002781056500071
如表3可以看出，编号1、5、9、14~15、18和22~24的工艺制备的美洲大蠊提取物氨基酸含量、蛋白质和干膏收率三个指标中一个或者多个较差，整体得分低于80分；其余编号的工艺制备的美洲大蠊提取物氨基酸含量、蛋白质和干膏收率均较高，整体得分高于80分，其中，以编号2和3的效果最优。
实验结果说明，在本发明工艺范围内，即电压强度为80~120伏，溶剂用量为美洲大蠊粗粉的6~14倍，提取时间为1~3min，能够制得质量优良的美洲大蠊提取物；本发明较优的工艺为：压强度为80伏，溶剂用量为美洲大蠊粗粉的10~12倍，提取时间为2~3min；本发明最较优的工艺为：压强度为80伏，溶剂用量为美洲大蠊粗粉的12倍，提取时间为3min。
实施例3  本发明美洲大蠊药材纯化工艺研究
1、美洲大蠊药材提取液的除杂工艺研究
取实施例2筛选的最优条件（压强度为80伏，溶剂用量为美洲大蠊粗粉的12倍，提取时间为3分）提取美洲大蠊药材得到的药液，预实验结果表明，滤布、滤纸等过滤方法不能有效过滤美洲大蠊药材提取液，经考察后确定以离心方法作为美洲大蠊药材提取液除杂的方法，其中离心时间、离心转速对离心效果影响较为明显，转速越大相应离心效率越高，因此以转速4000r/分钟对离心时间进行单因素考察，以滤液澄清度与滤渣紧密度为考察指标进行评价，结果见表6。
表6离心时间考察结果表(n=3)
Figure BDA00002781056500081
结果表明，以4000r/min离心30分钟后滤液澄清且转移滤液时滤渣紧密不易掉落入转移液中，离心效果最优。
2冷冻干燥法浓缩制备美洲大蠊药材有效成分
2.1冷冻干燥时间的考察
按照实施例2筛选的最优条件提取美洲大蠊药材得到的药液，经步骤1考察后确定的最佳方法纯化提取液，合并离心的上清液，定容至1000ml，取200ml提取液于蒸发皿中预冻24小时。将预冻好的样品置于冷冻干燥机中，选择不同时间点观察样品干燥情况，确定冷冻干燥的时间，结果见表7。
表7冷冻干燥时间考察结果表(n=3)
Figure BDA00002781056500082
结果表明，以200ml分装美洲大蠊药材提取液进行冷冻干燥时，冷冻干燥的最优冻干时间为48小时。
2.2美洲大蠊药材提取物冻干粉收率测定
按照实施例2筛选的最优条件提取美洲大蠊药材得到的药液，经步骤1考察后确定的最佳方法纯化提取液，合并提取液，定容至1000ml，取200ml的溶液三份于蒸发皿中预冻24小时。将预冻好的样品置于冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，取出冻干粉末，称重，计算收率，结果见表8。
表8冷冻干燥收率考察结果表(n=3)
Figure BDA00002781056500083
结果表明，美洲大蠊药材提取物冻干粉的平均收率为47.59%。
本发明用闪式提取法提取美洲大蠊提取物，可有效保留氨基酸等有效成分，收率高，具有良好的应用前景。

Claims (11)

1.一种美洲大蠊提取物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
（1）取美洲大蠊粗粉，加水，美洲大蠊粗粉与水的质量体积比为25：6~14，在电压80~120伏特条件下闪式提取2~3次，每次1~3min，得提取液；
（2）离心步骤（1）所得提取液，得上清，浓缩，即得美洲大蠊提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述美洲大蠊粗粉与水的质量体积比为25：10~12。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述美洲大蠊粗粉与水的质量体积比为25：12。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述闪式提取的电压为80伏特。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述闪式提取的次数为2次。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述闪式提取的时间为2~3min。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述提取时间为3min。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述离心的转速为4000r/min，离心时间为30min。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述浓缩采用冷冻干燥的方法。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述冷冻干燥的方法是：预冻24小时后，冷冻干燥48小时。
11.权利要求1~10任意一项所述方法制备的美洲大蠊提取物。
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