CN104434987B - 一种美洲大蠊的超高压提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种美洲大蠊的超高压提取方法，包括如下步骤：（1）取美洲大蠊粉末，加入水或浓度为50%～90%乙醇溶液，超高压提取1～5次，每次5～20min，即得提取液，其中，超高压提取的压强为100‑800MPa，温度为20～80℃；（2）过滤步骤（1）的提取液，得上清液，浓缩，得浓缩液；（3）将步骤（2）的浓缩液冷藏24～48h，去除上层油脂，离心，得上清液，浓缩，干燥，粉碎，即可。本发明超高压提取方法可以有效提取美洲大蠊的有效成分，收率高，操作简便，应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及一种美洲大蠊的超高压提取方法。
背景技术
美洲大蠊（Periplaneta americana）为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，其入药始载于《神农本草经》，其中把它列为中品，谓“味：咸、寒；治：血瘀证坚寒热、破积聚、喉咽闭、内寒无子”。近些年来随着我国对传统中医药资源研究开发的重视，有些学者其进一步研究并取得了可喜的成就，以美洲大蠊醇提物纯化制成的产品“康复新液”，在烧伤、烫伤等外伤创面的治疗上取得的良好疗效。
美洲大蠊的有效成分有氨基酸、肽类、蜚蠊酮以及微量元素等。目前，美洲大蠊的提取通常采用浸提法、回流提取法、闪式提取法等常规方法，如专利号：ZL200610021993.6，发明名称：“美洲大蠊提取物、含该提取物的药物组合物及其制备方法”的专利中公开了一种美洲大蠊提取的制备方法，包括如下步骤：a、取美洲大蠊粉碎，加石油醚，在温度5～20℃下浸泡，过滤，滤渣挥干；b、取步骤a所得滤渣，采用水提醇沉或醇提水沉法提取，静置；静置后的药液，弃上层油脂，过滤，得下层药液；其中，水提醇沉法中醇沉时，加入的乙醇浓度为：75～95%w/w；或，醇提水沉法时，加入的乙醇浓度为：60～80%w/w；c、所得b步骤所得药液，浓缩至相对密度为1.20～1.25，得清膏；d、按每1000g美洲大蠊使用40～60ml甘油的用量取甘油，与c步骤所述的清膏混合，即得美洲大蠊提取物。然而，现有提取方法难以有效保留氨基酸和肽等有效成分。
超高压提取(u ltrah igh-pressure ex traction,UHPE)，也称超高冷等静压提取，是指用100～1000MPa的流体静压力作用于提取溶剂和中药的混合液上，并在预定压力下保持一段时间，使植物细胞内外压力达到平衡后迅速卸压。由于细胞内外渗透压力忽然增大，细胞膜的结构发生变化，使得细胞内的有效成分能够穿过细胞的各种膜而转移到细胞外的提取液中，达到提取中药有效成分的目的。超高压提取可以有效提取黄酮类、皂苷类、多糖类和生物碱类等有效成。
目前，未见采用超高压方法提取美洲大蠊的报道。
发明内容
本发明提供了一种新的美洲大蠊的超高压提取方法。
本发明美洲大蠊的超高压提取方法，包括如下步骤：
（1）取美洲大蠊粉末，以水或浓度为50%～90%乙醇溶液为溶剂，超高压提取1～5次，每次5～20min，即得提取液，其中，超高压提取的压强为100-800MPa，温度为20～80℃；
（2）过滤步骤（1）的提取液，得上清液，浓缩，得浓缩液；
（3）将步骤（2）的浓缩液冷藏24～48h，去除上层油脂，离心，得上清液，浓缩，干燥，粉碎，即可。
步骤（1）中，美洲大蠊粉末的粒度为20～80目。
步骤（1）中，所述溶剂的用量为美洲大蠊的6～10倍（v/w）。优选地，所述溶剂的用量为美洲大蠊的6～8倍（v/w）。
步骤（1）中，所述乙醇溶液的浓度为65%～75%。优选地，所述乙醇溶液的浓度为70%。
步骤（1）中，所述超高压提取的次数为2～3次，提取时间为15～20min。
步骤（1）中，所述超高压提取的压强为200～600MPa。
步骤（1）中，所述超高压提取的温度为55～70℃。优选地，所述超高压提取的温度为60℃或70℃。
步骤（2）中，所述上清液浓缩至相对密度为1.05～1.25（50℃测）。
步骤（3）中，所述冷藏的温度为0～15℃。
步骤（3）中，所述离心的温度为5～15℃，转速10000r/min。
本发明还提供了前述方法制备的美洲大蠊提取物，以及所述提取物在制备促伤口愈合的药物以及治疗烧伤或烫伤的药物中的用途。
目前通常采用的浸提、回流提取、闪式提取方法，制得的美洲大蠊提取物有效成分含量低，其中，氨基酸含量最高仅为8.6%（专利申请号：201310030233.1）。
而本发明采用超高压提取方法，可以高效提取美洲大蠊的有效成分，收率高，制得的提取物中，氨基酸含量最高可达19.4%，显著高于现有方法制得的美洲大蠊提取物，低聚肽含量最高可达31.2%，促进创面愈合的效果显著，可以治疗烧伤和烫伤，具有良好的应用前景。
附图说明
图1氨基酸的标准图谱
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1本发明美洲大蠊的超高压提取方法
称取美洲大蠊1000g，粉碎，加入6倍量（v/w）60%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至300MPa，循环加压5次，每次5min，温度为40℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于60℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.05（50℃测），浓缩液于0℃冷藏24小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为5℃，转速10000r/min。离心后上清液于60℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为本发明美洲大蠊提取物452g。
实施例2本发明美洲大蠊的超高压提取方法
称取美洲大蠊1000g，粉碎，加入7倍量（v/w）75%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至400MPa，循环加压3次，每次10min，温度为50℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于70℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.08（50℃测），浓缩液于5℃冷藏36小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为10℃，转速10000r/min。离心后上清液于70℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为本发明美洲大蠊提取物465g。
实施例3本发明美洲大蠊的超高压提取方法
称取美洲大蠊1000g，粉碎，加入8倍量（v/w）70%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至400MPa，循环加压3次，每次15min，温度为60℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于75℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.10（50℃测），浓缩液于10℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为15℃，转速10000r/min。离心后上清液于75℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为本发明美洲大蠊提取物491g。
实施例4本发明美洲大蠊的超高压提取方法
称取美洲大蠊1000g，粉碎，加入10倍量（v/w）80%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至500MPa，循环加压2次，每次20min，温度为45℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于80℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.20（50℃测），浓缩液于15℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为8℃，转速10000r/min。离心后上清液于80℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为本发明美洲大蠊提取物432g。
实施例5本发明美洲大蠊的超高压提取方法
称取美洲大蠊1000g，粉碎，加入8倍量（v/w）50%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至600MPa，循环加压2次，每次10min，温度为80℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于75℃减压浓缩无乙醇味，相对密度为1.18（50℃测），浓缩液于7℃冷藏36小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为5℃，转速10000r/min。离心后上清液于75℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为本发明美洲大蠊提取物416g。
实施例6本发明美洲大蠊的超高压提取方法
称取美洲大蠊1000g，粉碎，加入6倍量（v/w）65%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至500MPa，循环加压3次，每次5min，温度为30℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于70℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.07（50℃测），浓缩液于12℃冷藏24小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为12℃，转速10000r/min。离心后上清液于70℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为本发明美洲大蠊提取物457g。
实施例7本发明美洲大蠊的超高压提取方法
称取美洲大蠊1000g，粉碎，加入8倍量（v/w）75%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至200MPa，循环加压3次，每次20min，温度为55℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于65℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.16（50℃测），浓缩液于6℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为10℃，转速10000r/min。离心后上清液于65℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为本发明美洲大蠊提取物481g。
实施例8本发明美洲大蠊的超高压提取方法
称取美洲大蠊1000g，粉碎，加入6倍量（v/w）85%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至400MPa，循环加压4次，每次10min，温度为20℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于60℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.21（50℃测），浓缩液于5℃冷藏36小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为8℃，转速10000r/min。离心后上清液于60℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为本发明美洲大蠊提取物446g。
实施例9本发明美洲大蠊的超高压提取方法
称取美洲大蠊1000g，粉碎，加入6倍量（v/w）65%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至400MPa，循环加压2次，每次15min，温度为70℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于80℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.25（50℃测），浓缩液于3℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为6℃，转速10000r/min。离心后上清液于80℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为本发明美洲大蠊提取物472g。
实施例10本发明美洲大蠊的超高压提取方法
称取美洲大蠊1000g，粉碎，加入8倍量（v/w）水，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至400MPa，循环加压2次，每次15min，温度为70℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于75℃减压浓缩，相对密度为1.10（50℃测），浓缩液于10℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为10℃，转速10000r/min。离心后上清液于80℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为本发明美洲大蠊提取物439g。
实施例11本发明美洲大蠊的超高压提取方法
称取美洲大蠊1000g，粉碎，加入8倍量60%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至150MPa，循环加压3次，每次5min，温度为65℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于70℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.12（50℃测），浓缩液于12℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为15℃，转速10000r/min。离心后上清液于70℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为美洲大蠊提取物305g。
实施例12本发明美洲大蠊的超高压提取方法
称取美洲大蠊1000g，粉碎，加入8倍量70%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至100MPa，循环加压3次，每次5min，温度为65℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于70℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.15（50℃测），浓缩液于5℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为5℃，转速10000r/min。离心后上清液于70℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为美洲大蠊提取物268g。
实施例13本发明美洲大蠊的超高压提取方法
称取美洲大蠊1000g，粉碎，加入8倍量80%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至700MPa，循环加压3次，每次5min，温度为65℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于70℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.09（50℃测），浓缩液于15℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为10℃，转速10000r/min。离心后上清液于70℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为美洲大蠊提取物254g。
实施例14本发明美洲大蠊的超高压提取方法
称取美洲大蠊1000g，粉碎，加入8倍量90%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至800MPa，循环加压3次，每次5min，温度为65℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于70℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.06（50℃测），浓缩液于8℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为6℃，转速10000r/min。离心后上清液于70℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为美洲大蠊提取物221g。
参比实施例1
称取美洲大蠊1000g，粉碎，加入8倍量70%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至900MPa，循环加压2次，每次60min，温度为60℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于70℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.10（50℃测），浓缩液于5℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为10℃，转速10000r/min。离心后上清液于70℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为美洲大蠊提取物176g。
参比实施例2
称取美洲大蠊1000g，粉碎，加入8倍量95%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至400MPa，循环加压2次，每次60min，温度为65℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于70℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.10（50℃测），浓缩液于8℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为10℃，转速10000r/min。离心后上清液于70℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为美洲大蠊提取物169g。
参比实施例3
称取美洲大蠊1000g，粉碎，加入8倍量70%乙醇，于柔性容器装袋密封。置于超高压提取器中,升压至400MPa，循环加压3次，每次60min，温度为65℃，卸压，开盖取样，过滤。滤液于70℃减压浓缩至无乙醇味，相对密度为1.15（50℃测），浓缩液于12℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为5℃，转速10000r/min。离心后上清液于70℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为美洲大蠊提取物143g。
参比实施例4
称取美洲大蠊1000g，粉碎，加入70%的乙醇回流提取3次，每次分别加入8倍、6倍、6倍，过滤，滤液于70℃减压回收乙醇。回收至无乙醇味，相对密度为1.05（50℃测），浓缩液于0℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为10℃，转速10000r/min。离心后上清液于75℃减压浓缩、干燥、粉碎，即为美洲大蠊提取物125g。
参比实施例5
称取美洲大蠊1000g，碎成粉，加入95%的乙醇回流提取3次，每次分别加入8倍、6倍、6倍，过滤，滤液于70℃减压回收乙醇。回收至无乙醇味，相对密度为1.05（50℃测），浓缩液于5℃冷藏48小时，将上层油脂用滤纸吸去，将下层液于高速冷冻离心机里离心，温度为10℃，转速10000r/min。离心后上清液于75℃减压浓缩、干燥、粉碎。即为美洲大蠊提取物73g。
实验例1各种方法制备的美洲大蠊提取物中低聚肽和氨基酸含量的检测
一、实验方法
取实施例1～14和参比实施例1～5制备的美洲大连提取物，分别按照如下方法测定提取物中低聚肽和氨基酸的含量：
低聚肽：指含2～10个氨基酸残基的肽，其相对分子量在3000以下，具有可直接被消化道吸收、转运速度快、耗能低和不易饱和等特点。
Ⅰ、低聚肽的含量测定方法
1、试剂试药：
牛血清白蛋白国药集团化学试剂有限公司
碱性铜试液、福林酚试液均按照《中国药典》2010年版有关项下配制
2.仪器：
UV2450岛津紫外可见分光光度计
3、试验方法：
采用福林酚比色法测定提取物中低聚肽的含量。精密量取牛血清白蛋白对
照品溶液(0.245g·L－1)0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL分别置试管中，加水至1.0mL，加碱性铜试液5.0mL，摇匀，室温放置10min。快速加入福林酚试液0.5mL，立即混匀，置30℃水浴中准确反应30min，取出，放冷，照紫外-可见分光光度法，在650nm的波长处测定吸光度，以牛血清白蛋白加入量为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(Y)绘制标准曲线，回归方程为Y=2.9345X+0.0367(r=0.9994)，牛血清白蛋白加入量在0.04736～0.23680mg线性关系良好。
供试品的测定：称取取实施例1～14和参比实施例1～5制备的美洲大连提取物，加水定容至25ml，摇匀，超声提取20min，放置，吸取上清液2.0ml，置10ml容量瓶 中，加入19%三氯乙酸溶液至10ml，摇匀，放置10min，离心15min，精密量取上清液1ml至50ml 容量瓶中，加水至刻度，摇匀，取供试品1ml，碱性铜试液5.0mL，摇匀，室温放置10min。快速加入福林酚试液0.5mL，立即混匀，置30℃水浴中准确反应30min，取出，放冷，照紫外-可见分光光度法，在650nm的波长处测定吸光度。带入回归方程计算样品中低聚肽含量。
Ⅱ、氨基酸的含量测定方法（方法来源：食品中氨基酸的测定方法GB/T5009.124—2003）
1.原理
食品蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。
2.试剂
全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。
2.1 浓盐酸：优级纯。
2.2 6mol/L盐酸：浓盐酸与水1：1混合而成。
2.3 苯酚：需重蒸馏。
2.4 混合氨基酸标准液（仪器制造公司出售）：0.0025mol/L
2.5 缓冲液：
2.5.1 pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠（Na3C6H5O7.2H2O）和16.5ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.2。
2.5.2 pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节至pH至3.3。
2.5.3 pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。
2.5.4 pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠（优级纯）加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。
2.6 茚三酮溶液
2.6.1 pH5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂（LiOH.H2O）168g，加进冰乙酸（优级纯）279ml，加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠调节pH至5.2。
2.6.2 茚三酮溶液：取150ml二甲基亚砜（C2H6OS）和乙酸锂溶液（2.6.1）50ml加进4g水合茚三酮（C9H4O3.H2O）和0.12g还原茚三酮（C18H10O6.2H2O）搅拌至完全溶解。
2.7 高纯氮气：纯度99.99%。
2.8 冷冻剂：市售食盐与冰按1：3混合
3.仪器和设备
3.1 真空泵
3.2 恒温干燥箱
3.3 水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30ml。用往离子水冲洗干净并烘干。
3.4 真空干燥器（温度可调节）
3.5 日本日立(Hitachi,Japan)L-8900型全自动氨基酸分析仪 天美(中国)科学仪器有限公司
4.检测方法
4.1试样处理
样品采集后用匀浆机打成匀浆（或者将样品尽量粉碎）于低温冰箱中冷冻保存，分析用时将其解冻后使用。
4.2分析步骤
4.2.1称样
正确称取一定量样品，精确到0.0001g。均匀性好的样品如奶粉等，使样品蛋白质含量在10～20mg范围内；均匀性差的样品如鲜肉等，为减少误差可适当增大称样量，测定前再稀释。将称好的样品防于水解管中。
4.2.2水解
在水解管内加6mol/L盐酸10～15ml（视样品蛋白质含量而定），含水量高的样品（如牛奶）可加进等体积的浓盐酸，加进新蒸馏的苯酚3～4滴，再将水解管放进冷冻剂中，冷冻3～5min，再接到真空泵的抽气管上，抽真空（接近0psi），然后充进高纯氮气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在110±1℃的恒温干燥箱内，水解22h后，取出冷却。
打开水解管，将水解液过滤后，用往离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到50ml容量瓶内，用往离子水定容。吸取滤液1ml于5ml容量瓶内，用真空干燥器在40～50℃干燥，残留物用1～2ml水溶解，再干燥，反复进行两次，最后蒸干，用1mlpH2.2的缓冲液溶解，供仪器测定用。
4.2.3测定
正确吸取0.200ml混合氨基酸标准，用pH2.2的缓冲液稀释到5ml，此标准稀释浓度为5.00nmol/50μL，作为上机测定用的氨基酸标准，用氨基酸自动分析仪以外标法测定样品测定液的氨基酸含量。
4.2.4结果计算
按下式计算
式中：
X—试样氨基酸的含量，单位为克每100克（g/100g）；
C—试样测定液中氨基酸含量，单位为纳摩尔每50微升（nmol/50ul）；
F—试样稀释倍数；
V—水解后试样定容体积，单位为毫升（ml）；
M—氨基酸分子量；
m1—试样质量，单位为克（g）；
—折算成每毫升试样测定的氨基酸含量，单位为微摩尔每升（μmol/L）；
109—将试样含量有纳克（ng）折算成克（g)的系数。
十六种氨基酸分子量：
天冬氨酸：133.1；苏氨酸：119.1；丝氨酸：105.1;谷氨酸:147.1;脯氨酸:155.1;甘氨酸:75.1;丙氨酸:89.1;缬氨酸:117.2;蛋氨酸:149.2;异亮氨酸:131.2;亮氨酸:131.2;酪氨酸:181.2;苯丙氨酸:165.2;组氨酸:155.2；赖氨酸：146.2；精氨酸：174.2
计算结果表示为：试样氨基酸含量在1g/100g以下，保留两位有效数字；含量在1g/100g以上，保留三位有效数字。
精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的12%。
4.2.5标准图谱
标准图谱如图1所示。
二、实验结果
实验结果如表1所示：
表1各提取物的含量和收率
| 编号 | 低聚肽含量（%） | 氨基酸含量（%） | 收率（%） |
| 实施例1 | 24.1 | 12.3 | 45.2 |
| 实施例2 | 29.3 | 18.6 | 46.5 |
| 实施例3 | 31.2 | 19.4 | 49.1 |
| 实施例4 | 23.9 | 15.2 | 43.2 |
| 实施例5 | 21.6 | 11.1 | 41.6 |
| 实施例6 | 27.1 | 16.5 | 45.7 |
| 实施例7 | 23.8 | 11.9 | 48.1 |
| 实施例8 | 27.4 | 16.7 | 44.6 |
| 实施例9 | 28.5 | 17.8 | 47.2 |
| 实施例10 | 21.5 | 11.5 | 43.9 |
| 实施例11 | 14.1 | 8.4 | 30.5 |
| 实施例12 | 12.8 | 7.6 | 26.8 |
| 实施例13 | 12.2 | 7.3 | 25.4 |
| 实施例14 | 11.6 | 7.0 | 22.1 |
| 参比实施例1 | 9.8 | 6.3 | 17.6 |
| 参比实施例2 | 9.4 | 5.8 | 16.9 |
| 参比实施例3 | 8.6 | 4.6 | 14.3 |
| 参比实施例4 | 7 | 3.9 | 12.5 |
| 参比实施例5 | 3.6 | 2.1 | 7.3 |
如表1所示，采用超高压提取方法处理美洲大蠊，超高压的压力、时间、次数等参数在本发明范围内时，低聚肽含量高于11%，氨基酸含量高于7%，收率均高于20%；其中，乙醇浓度为65～75%，压力为200～600MPa，提取温度为55～70℃，提取次数为2～3次，提取时间为15～20min时（详见实施例3、7、9），收率高，制得的美洲大蠊提取物中，低聚肽和氨基酸含量高；乙醇浓度为70%，压力为400MPa，提取温度为60℃，提取次数为3次，提取时间为15min时（详见实施例3），收率最高，制得的美洲大蠊提取物中，低聚肽和氨基酸含量最高。
超高压的压力、时间、次数等参数在本发明范围以外时，低聚肽含量低于10%，氨基酸含量高于4%，收率不高于18%；采用其他的提取方法，如，回流提取，低聚肽含量低于8%，氨基酸的含量低于4%，收率不高于12.5%。
实验结果说明，本发明超高压提取方法可以有效地提取美洲大蠊中的氨基酸和低聚肽，收率高，显著优于其他提取方法。
实验例2本发明超高压提取方法的参数优选
1、试验方法
预实验结果表明，乙醇浓度、提取压力、提取温度和提取时间对于美洲大蠊低聚肽的含量有较大影响。使用L9（34）正交试验的方法，以不同提取工艺制备的样品中低聚肽的含量为评价指标，低聚肽的检测方法同实验例1。
其余条件同实施例1，对乙醇浓度、提取压力、提取温度、提取时间进行考察，以确定最优工艺。因素水平见表2：
表2因素水平
按照实验设计，分别进行提取样品制备，采用实验例1的方法测定低聚肽含量。根据测定结果进行直观分析和方差分析。
2、实验结果
结果见表3、表4：
表3试验数据及分析
表4方差分析结果
| 方差来源 | 偏差平方和 | 自由度 | F值 | F临界值 | 显著性 |
| A | 15.14 | 2 | 130.98 | F<sub>0.05（2,2）</sub>=19 | ** |
| B | 29.54 | 2 | 255.60 | F<sub>0.01（2,2）</sub>=99 | ** |
| C | 0.12 | 2 | |||
| D | 2.07 | 2 |
如表3～4所示，乙醇浓度和提取压力对于美洲大蠊提取物中低聚肽的含量有显著影响；在表2所述的参数范围内，工艺A2B2C3D3为最佳提取条件，即70%乙醇，400MPa压力，70℃温度，循环加压2次，每次20min。
实验例3本发明提取物对小鼠实验性烫伤的影响
1、实验方法
取体重18～22g小鼠50只，雌雄各半，按性别与体重随机分为5组，分别为NS对照组，美洲大蠊提取物给药组（实施例2、参比实施例4制备的美洲大蠊提取物），湿润烧伤膏（汕头市美宝制药有限公司，涂于烧、烫、灼伤等创面，厚度薄于1mm）对照组。
将小鼠置于固定器内，小鼠右后足跖部位置于预先调至55℃恒温水浴中15秒，此后每隔半小时各组小鼠分别于右足跖部涂药1次，共给药3次，4.5小时后将小鼠脱颈椎处死，于同一部位剪下两足跖部，用精密扭力天平称重，以每鼠右足重减去左足重量为肿胀度，将对照组和给药组的肿胀程度进行比较和统计学处理。
2、实验结果
结果见表5：
表5提取物对小鼠验性烫伤的影响(X±SD)
*:P<0.05,**:P<0.01与对照组比较
如表5所示，与对照组相比，本发明方法制备的美洲大蠊提取物和阳性药物均可以显著降低热水烫伤致小鼠足跖的肿胀度(P<0.05)，而参比实施例4制备的美洲大连提取物组与对照组无显著差异。
实验结果说明，本发明提取物对烫伤有较好的保护作用。
实验例4本发明提取物对小鼠实验性烧伤的影响
1、实验方法
取体重18～22g小鼠60只，雌雄各半。将中间挖空2cm×2cm的石棉纸置于小鼠背上，用微量移液器吸取100uL无水乙醇滴于20mg棉球上，置于暴露处，点火燃烧造成Ⅱ度烧伤模型。按性别与烧伤面积随机分为5组，分别为NS对照组，美洲大蠊提取物给药组（实施例2、参比实施例4制备的美洲大蠊提取物），湿润烧伤膏（汕头市美宝制药有限公司，涂于烧、烫、灼伤等创面，厚度薄于1mm）对照组。
各组分别涂药，连续涂30d，Bid，换药前将创面清洗干净。观测小鼠烧伤面积和愈合情况，给药9天与15天，分别用数码相机拍照，用IPP5.1图像分析软件包测量各组动物烧伤面积。将所测结果进行t检验。
2、实验结果
实验结果见表6：
表6提取物对小鼠验性烧伤的影响(X±SD)
*:P<0.05,**:P<0.01与对照组比较
如表5所示，与对照组相比，本发明方法制备的美洲大蠊提取物可以有效减少小鼠的创面结痂面积，缩短创面愈合时间，其中，剂量为0.4g/ml时，与对照组存在显著性差异（P<0.01），优于阳性药物湿润烧伤膏和参比实施例4制备的美洲大连提取物。
实验结果说明，本发明提取物可以有效促进创面愈合，对烧伤的疗效确切。
综上，本发明超高压提取方法可以有效提取美洲大蠊的有效成分，收率高，制得的提取物氨基酸和低聚肽含量高，可以有效促进创面愈合，治疗烧伤和烫伤，应用前景良好。
Claims (13)
1.一种美洲大蠊的超高压提取方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)取美洲大蠊粉末，以水或浓度为50％～90％乙醇溶液为溶剂，在温度为20～80℃，压强为200～600MPa条件下，超高压提取2～5次，每次5～20min，即得提取液；所述溶剂的用量为美洲大蠊的6～10倍v/w；
(2)过滤步骤(1)的提取液，得上清液，浓缩，得浓缩液；
(3)将步骤(2)的浓缩液冷藏24～48h，去除上层油脂后，离心，得上清液，浓缩，干燥，粉碎，即可；所述冷藏的温度为0～15℃。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，美洲大蠊粉末的粒度为20～80目。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，所述溶剂的用量为美洲大蠊的6～8倍v/w。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，所述乙醇溶液的浓度为65％～75％。
5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于：所述乙醇溶液的浓度为70％。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，所述超高压提取的次数为2～3次，提取时间为15～20min。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，所述超高压提取的压强为200～400MPa。
8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，所述超高压提取的温度为55～70℃。
9.根据权利要求8所述的提取方法，其特征在于：所述超高压提取的温度为60℃或70℃。
10.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(2)中，所述上清液浓缩至相对密度在50℃测为1.05～1.25。
11.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤(3)中，所述离心的温度为5～15℃，转速10000r/min。
12.权利要求1～11任意一项所述方法制备的美洲大蠊提取物。
13.权利要求12所述美洲大蠊提取物在制备促伤口愈合的药物或制备治疗烧伤或烫伤的药物中的用途。
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