CN104120160B

CN104120160B - 一种小球藻抗氧化肽的制备方法

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Publication number: CN104120160B
Application number: CN201410255322.0A
Authority: CN
Inventors: 张拥军; 王爽; 张高帆; 苏东洋; 朱丽云
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: Anhui Hanfang Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2014-06-10
Filing date: 2014-06-10
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2034-06-10
Also published as: CN104120160A

Abstract

本发明公开了一种小球藻抗氧化肽的制备方法，以小球藻为原料，利用稀碱溶胀结合超声波工艺，对小球藻进行破壁处理获得可溶性蛋白质，小球藻蛋白用生物酶法进行水解，获得了抗氧化效果明显的小球藻抗氧化肽。本发明还公开了超低温处理、高压处理结合稀碱溶胀与超声波的处理工艺能提高水溶性蛋白质的得率，并且能进一步提高水解产物的抗氧化能力。本发明所得产品纯度高，抗氧化活性强。

Description

一种小球藻抗氧化肽的制备方法

(一)技术领域

本发明涉及一种小球藻抗氧化肽的制备方法。

(二)背景技术

自由基(Free radicals)是人体生命活动中各种生化反应的中间代谢产物，由于其单电子的结构而表现出极其活泼的不稳定性，在生物体内主要包括超氧阴离子自由基(O₂ ^-·)、过氧化氢(H₂O₂)、羟基自由基(·OH)、氧有机自由基(RO·)、有机过氧基(ROO·)、活性氧(ROS)、脂自由基(L·)和脂过氧基(LOO·)等。具有活性的自由基对一般的组织和生物膜都可产生不同程度的危害，因此自由基在生理、病理上的作用机理受到了广泛的关注，越来越多的学者投入相关的研究中。

存在在人体内的氧自由基主要有两个方面的来源：外源性和内源性。“外源性自由基”是由紫外线或环境污染等外来因素引发；“内源性自基”一般是在生物新陈代谢的过程中，由人体内生化反应所产生。在机体正常代谢活动中，机体内抗氧化系统能将自由基的产生和清除维持在平衡状态。但外界的逆境环境或机体的衰老导致的抗氧化系统功能的下降会引发自由基的过量积累，过量的自由基会给机体造成不可逆转的氧化损伤，造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老，形成恶性循环，引发包括心脏病、老年痴呆症、癌症、糖尿病、帕金森病、阿尔茨海默病和动脉粥样硬化在内的多种疾病。

近年来,随着海洋资源的不断开发，海洋生物资源也大量地被列入研究行列中，海洋资源成为了新能源开发不可或缺的一部分。人们在对海洋生物的研究中，不断地从海洋生物中发现一些具有抗氧化活性的化合物，多糖、蛋白质、多肽乃至氨基酸都出现不同程度的抗氧化活性。海洋生物抗氧化物质可通过各种途径清除内源性和外源性自由基,具有抗氧化作用强、种类多、结构复杂、副作用低等特点。从海洋生物中寻找新的天然抗氧化活性物质、新的抗衰老药物已成为海洋药物研究的重要目标之一。

地球上有3万多种不同的微藻，分布在淡水和海洋里，在各种土壤(包括酷暑和寒冷的荒芜环境)里也都有微藻存在。人类最初对微藻的利用是简单的动物饲料，后来开始出现部分微藻食品或者保健品，但是这些产品对微藻这种天然高效能源的利用率还有待提高。近几十年来，人们逐渐注重微藻生物活性物质的研究和开发。微藻所含有的活性成分具有重要经济价值，在医药、保健品、饲料、化工和环保等方面有广泛的应用，微藻中含有大量蛋白质，优质的人工微藻蛋白质含量普遍可以达到50％以上。微藻蛋白质提取物具有一定的抗氧化性，这些提取物在一定条件下水解后的产物具有更高效的抗氧化特性。从海洋藻类中提取天然抗氧化药物的研究有待进行。

来源于天然蛋白质的水解抗氧化肽近年来逐渐成为研究热点。Suetsuna等从酪蛋白的胃蛋白酶酶解物中发现了具有自由基清除活性的肽。等在文章中指出，WIP酶解物在分子量小于6kD的时候具有较明显的抗氧化活性。Hernández-Ledesma等在做β-乳球蛋白和α-乳清蛋白水解产物的抗氧化性的过程中，对商业蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和Corlose PP)进行了详细的对比，在结论中表示，Corlose PP蛋白酶的水解产物具有较高的抗氧化活性，其抗氧化组分分子量小于3kD。ZengWeiCai等使用凝胶过滤层系、高效液相色谱等分离手段在牛毛中提取了一种大小为18.7kDa的多肽，具有显著的抗氧化能力，能有效防止油脂的氧化。Seung-Jae Lee等利用反相高效液相色谱在鸭子皮肤中提取了一种大小为941Da的抗氧化肽，具有保护肝脏免受酒精损害的活性，该多肽在细胞环境中能够参与细胞凋亡的相关途径的调节。Zhang Yufeng^[28]等在罗非鱼鱼皮中提取出两种抗氧化肽，氨基酸序列分别为Glu-Gly-Leu(317Da)和Tyr-Gly-Asp-Glu-Tyr(645Da)，并指出multifect neutral和properaseE两种酶可以作为高抗氧化性肽制备用酶。

自然界中微藻有3万多种，但目前被人类利用开发的只有十余种。小球藻(Chlorella pyrenoidosa FACHB5)是一类普生性单细胞藻类。小球藻具有生态分布广、可快速生长和繁殖、易于培养等优点，是地球上动植物中唯一能在20h增长4倍的生物，具有很高的应用价值。以小球藻酶水解抑菌肽作为天然防腐剂用于食品中来达到抑菌的目的，不但在食品加工业将有广阔的应用前景，并且在环境保护等方面做出了一定贡献。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种以小球藻为原料制备抗氧化肽的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种小球藻抗氧化肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)小球藻干粉加入蒸馏水混匀，所述蒸馏水的体积用量以小球藻干粉质量计为20mL/g，4℃下搅拌1～3h，得到小球藻混合液，在不断搅拌下向小球藻混合液中加入NaOH，使NaOH的质量终浓度为1～4％(优选1％)，得到碱性混合液，然后将碱性混合液在4℃下超声破壁处理1～2h，调pH值为7.0(通常加稀盐酸调pH值)，离心分离，取上清液，加入体积为上清液体积4倍的体积分数95％的乙醇，搅拌1～10分钟后，静置5～6小时，再次离心，弃去上清液，取沉淀用蒸馏水清洗，然后用少量蒸馏水溶解，浓缩、冷冻干燥制得小球藻蛋白；

(2)小球藻蛋白加0.5mol/L的PBS缓冲液配成6mg/mL浓度的底物溶液，按酶与底物的质量比([E]/[S])＝1:25分别加入复合蛋白酶、复合风味蛋白酶、中性蛋白酶或碱性蛋白酶，在各种酶的最佳反应温度和反应pH条件下，进行酶解反应，反应0.5～5h，然后将酶解液升温至90～95℃反应15～30min，结束酶解反应，所得反应液浓缩至原体积的1/4，冷冻干燥，制得棕黄色的小球藻抗氧化肽。

进一步，本发明所述步骤(1)中，所述离心分离优选在2000～4000rpm下离心10～20分钟。

所述步骤(1)中，所述超声破壁处理一般在20～30KHz的超声条件下进行。

所述步骤(2)中，复合风味蛋白酶的反应条件为pH值6.0，反应温度50℃；碱性蛋白酶的反应条件为pH值8.0，反应温度55℃；复合蛋白酶的反应条件为pH值6.0，反应温度50℃；中性蛋白酶的反应条件为pH值6.0，反应温度45℃。所述反应条件中pH值可通过配制相应pH值的PBS缓冲液来进行调节。

所述步骤(2)中，优选加入复合风味蛋白酶进行酶解反应，反应条件为pH值6.0，反应温度50℃，酶解反应的时间优选5小时。

进一步，本发明所述步骤(1)中，优选在碱性提取前经超低温或高压均质处理，具体的，所述步骤(1)优选按以下之一的步骤操作：

(1-a)小球藻干粉加入蒸馏水混匀，所述蒸馏水的体积用量以小球藻干粉质量计为20mL/g，4℃下搅拌1～3h，得到小球藻混合液，小球藻混合液在-70℃下冷冻12h，再于30℃下解冻至4℃，在不断搅拌下向解冻后的小球藻混合液中加入NaOH，使NaOH的质量终浓度为1～4％(优选1％)，得到碱性混合液，然后将碱性混合液在4℃下超声破壁处理1～2h，调pH值为7.0(通常加稀盐酸调pH值)，离心分离，取上清液，加入体积为上清液体积4倍的体积分数95％的乙醇，搅拌1～10分钟后，静置5～6小时，再次离心，弃去上清液，取沉淀用蒸馏水清洗，然后用少量蒸馏水溶解，浓缩、冷冻干燥制得小球藻蛋白；

(1-b)小球藻干粉加入蒸馏水混匀，所述蒸馏水的体积用量以小球藻干粉质量计为20mL/g，4℃下搅拌1～3h，得到小球藻混合液，小球藻混合液加入高压均质机中，调节压力至100MPa，处理15～20次(每次处理时间0.1～3秒)，然后在4℃、不断搅拌下向高压均质后的小球藻混合液中加入NaOH，使NaOH的质量终浓度为1～4％(优选1％)，得到碱性混合液，然后将碱性混合液在4℃下超声破壁处理1～2h，调pH值为7.0(通常加稀盐酸调pH值)，离心分离，取上清液，加入体积为上清液体积4倍的体积分数95％的乙醇，搅拌1～10分钟后，静置5～6小时，再次离心，弃去上清液，取沉淀用蒸馏水清洗，然后用少量蒸馏水溶解，浓缩、冷冻干燥制得小球藻蛋白。

本发明所用的复合风味蛋白酶为商品化酶，可直接从市场上获得。本发明复合风味蛋白酶购自无锡联合恒洲化工有限公司，最佳反应条件为pH6.0，50℃，标称活力500LAPU/g。

本发明以小球藻为原料，利用稀碱溶胀结合超声波的处理工艺，对小球藻进行破壁处理获得可溶性蛋白质，进而用生物酶法对蛋白质进行水解，获得了抗氧化效果明显的活性肽。同时对比了超低温处理、高压处理结合稀碱溶胀与超声波的处理工艺，考察后期的水解产物的抗氧化效果，发现超低温处理以及高压处理能提高水溶性蛋白质的得率，并且能进一步提高水解产物的抗氧化能力。由于小球藻具有细胞壁异常坚固，壁内蛋白含量高的特点，发明的技术要点在于同时控制前处理工艺和酶解工艺条件，可显著改善小球藻蛋白酶解后的活性肽的抗氧化能力，获得抗氧化效果好的活性肽。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

(1)针对小球藻细胞壁异常坚固的特点，首先通过一种比较温和的破壁方式，可以避免高温对原料所造成的营养损失等不良影响，也是使细胞破裂较为彻底的方法，即在稀碱条件下利用超声波产生的空化作用、机械作用加速细胞壁的破碎，促进胞内物质的溶出。如果结合在-70℃冷冻处理、再在室温缓慢融化的超低温冷冻的方法，可进一步使小球藻异常坚固的细胞壁变得松脆，提高蛋白质的溶出效率，其蛋白质含量可达10％以上，比传统的热水浸提得到的蛋白质提高了6.03倍，比稀碱结合超声浸提得到的蛋白质提高了1.37倍，比单独稀碱浸提得到的蛋白质提高了1.79倍。另外，将高压均质处理与稀碱结合超声浸提的方法结合，也可以有效提高蛋白质的溶出效率，蛋白质含量比稀碱结合超声浸提提高了1.54倍。整个工艺过程简单方便，可使小球藻有效破壁，具有能耗低、效率高、不破坏有效成分等优点。

(2)本发明所得产品纯度高，抗氧化活性强。采用稀碱结合超声浸提工艺获得的小球藻蛋白质，在复合风味蛋白酶作用下，在小球藻蛋白质底物浓度为6mg/ml时，按[E]/[S]＝1:25加入蛋白酶，在pH6.0，50℃条件下酶解5h再沸水浴15min后，获得的活性肽对超氧自由基的清除率达43.36％。如果在前期小球藻破壁处理时结合在-70℃的超低温冷冻处理，最终在相同条件下酶解获得的水解产物，其对超氧自由基的清除率可达72.47％，比传统的热水浸提得到的水解产物的清除率提高了2.04倍，比单独碱液浸提得到的水解产物的清除率提高了2.48倍。如果在前期小球藻破壁处理时结合在超高压处理，最终在相同条件下酶解获得的水解产物，其对超氧自由基的清除率可达64.73％。且工艺条件温和，绿色环保，符合保健食品的生产要求。

本发明所获得的抑菌肽来自天然小球藻材料，原料易得成本低，安全无毒。

(四)附图说明

图1 Folin-Phonel法测蛋白质含量的标准曲线图。

图2邻苯三酚还原性标准曲线图。

图3四种酶水解小球藻蛋白不同时间的水解度曲线图。

图4四种酶水解小球藻蛋白不同时间所得多肽溶液对DPPH自由基的清除率曲线图。

图5四种酶水解小球藻蛋白不同时间所得多肽溶液对超氧阴离子自由基的清除率曲线图。

图6四种酶水解小球藻蛋白不同时间所得多肽溶液对羟基自由基的清除率曲线图。

图7复合风味蛋白酶水解小球藻蛋白不同时间的水解度曲线图。

图8复合风味蛋白酶水解小球藻蛋白不同时间所得多肽溶液对DPPH自由基的清除率曲线图。

图9复合风味蛋白酶水解小球藻蛋白不同时间所得多肽溶液对超氧阴离子自由基的清除率曲线图。

图10复合风味蛋白酶水解小球藻蛋白不同时间所得多肽溶液对羟基自由基的清除率曲线图。

图11复合风味蛋白酶水解小球藻蛋白不同时间的多肽溶液的还原性曲线图。

图12复合风味蛋白酶水解小球藻蛋白后不同浓度水解肽溶液的抗氧化活性柱状图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

1 小球藻蛋白的提取工艺

1.1 材料与试剂

小球藻干粉，来自浙江省杭州华丹农产品有限公司；Bio-Rad Protein Assay试剂盒，购自Bio-Rad Laboratories Inc；硫酸铜，硫酸钾，硫酸，硼酸，氢氧化钠，95％乙醇，混合指示液(2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液临用时混合)。

1.2 实验仪器

酶联免疫检测仪(Model-550)，美国Bio-Rad公司；高速冷冻离心机(5415R)，德国Eppendorf公司；电子天平(BS224S)；凯氏定氮仪(KDY-9820)AL04型电子天平、HH-2型水浴锅、DHG-9240A型鼓风干燥箱、DL-5M离心机(配更换转头)、SANYO超低温冰箱。

1.3 实验方法

1.3.1 提取液中蛋白含量测定

采用Bio-Rad Protein Assay法，按试剂盒说明操作，每个样本设3个平行孔。同时以标准牛血清蛋白的质量浓度(分别为0.05mg/mL，0.1mg/mL，0.2mg/mL，0.3mg/mL，0.4mg/mL，0.5mg/mL)为横坐标，OD₅₉₅值为纵坐标绘制蛋白质标准曲线，作为定量的依据。

1.3.2 小球藻蛋白质的提取

取小球藻粉200g，以料液比1:20(m/v)加入4000ml蒸馏水，4℃环境下搅拌1h，得小球藻混合液，向小球藻混合液中缓慢加入NaOH至其终浓度为1wt％，并不断搅拌，得到碱性混合液；在4℃环境下，碱性混合液用超声破壁处理60min，超声条件为20～30KHz，然后用0.5M盐酸调pH至7.0；在4000rpm下离心20min，取上清液；加入4倍上清液体积的体积分数95％乙醇溶液，持续搅拌1min，静置5h；在2000rpm下离心10min，弃去上清，取沉淀用150mL蒸馏水溶解后浓缩至70mL，再冷冻干燥得到小球藻蛋白16.44g。按照步骤1.3.1，与蛋白质标准曲线对比，测定提取得到的小球藻蛋白中蛋白质含量。小球藻蛋白的蛋白质得率如下计算：(小球藻蛋白中蛋白质含量×小球藻蛋白质量/原料小球藻粉的质量)×100％

2 制备小球藻抗氧化活性肽的工艺研究

2.1 实验材料和仪器

2.1.1 实验材料

复合风味蛋白酶(无锡联合恒洲化工有限公司，pH6.0，50℃，标称活力500LAPU/g)，碱性蛋白酶(无锡联合恒洲化工有限公司，pH8.0，55℃，标称活力2.4AU-A/g)，复合蛋白酶(无锡联合恒洲化工有限公司，pH6.0，50℃，标称活力1.5AU-N/g)，中性蛋白酶(无锡联合恒洲化工有限公司，pH6.0，45℃，标称活力0.8AU-N/g)。

DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、邻苯三酚(即焦性没食子酸)、Tris(三羟甲基氨基甲烷)、水杨酸、FeSO₄、铁氰化铁、三氯乙酸(TCA)、无水Na₂CO₃、乙醇、HCl、NaOH、Folin-Phenol试剂等均为分析纯试剂；配制0.5mg/ml BSA(牛血清蛋白)溶液；配制10％(w/v)的三氯乙酸(TCA)溶液；

福林试剂A液：20.000g无水Na2CO3和4.000gNaOH溶于去离子水并定容至1000ml；福林试剂B液：1.000g酒石酸钾钠溶于去离子水并定容至100ml；福林试剂C液：0.500gCuSO4·5H2O溶于100ml去离子水；福林试剂D液：48ml福林试剂A溶液与1ml福林试剂B液和1ml福林试剂C液的混合液(当天配制，当天使用)；福林试剂E液： Folin-Phenol试剂；

2.1.2 主要仪器

CT14RD高速冷冻离心机、UV1000紫外分光光度计、Tank 60Liter PE超纯水机、GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱、电子天平等。

2.2 实验方法

2.2.1 小球藻溶液的水溶性蛋白质总量的测定

取四支1.5ml离心管，并标号0、1、2、3。其中，0号管中加入蒸馏水1.0ml，1、2和3三支管中准确加入0.6％未酶解的小球藻蛋白的溶液1.0ml，在12000rpm的速度下离心10min，分别对上清液作一定的稀释，取稀释液0.50ml加入到四支15ml试管中，分别加入4ml福林试剂D液，于室温下静置10min，然后加福林试剂E液0.5ml并混匀，于40℃下保温20min，室温冷却，在680nm下测定各管溶液的吸光度，0号为空白组。根据Folin-Phonel法测蛋白的标准曲线图(图1)和稀释倍数算出水溶性蛋白质总量。

Folin-Phonel法测蛋白的标准工作曲线按以下方法得到：利用浓度梯度为0、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml BSA(牛清白蛋白)溶液来制作测定蛋白质的标准曲线，做三个平行。按2.2.1中自“分别取上清液0.50ml加入到四支15ml试管中……测定吸光度”类似步骤进行操作。根据光度值可以看出，在0～0.4mg/ml BSA范围内，吸光值与BSA溶液浓度具有较好的线性关系(标准曲线见图1)，回归方程为y＝1.7030x+0.0225，相关系数R^2＝0.9999。

2.2.2 小球藻溶液中TCA可溶性短肽的含量测定

取四支1.5ml离心管，并标号0、1、2、3。其中，0号管中加入蒸馏水0.5ml，1、2、3三支离心管中分别准确加入0.6％浓度酶解前或酶解后的小球藻溶液0.5ml，所有四支管均加入0.5ml10wt％TCA溶液，摇匀后离心(12000rpm，10min)，以下按2.2.1自“分别对上清液作一定的稀释，取稀释液0.50ml加入到四支15ml试管中……测定吸光度”进行操作。根据Folin-Phonel法测蛋白的标准曲线和稀释倍数，算出TCA可溶性短肽含量。

2.2.3 水解度测定

水解度(degree of hydrolysis，DH)是理解和衡量蛋白水解程度和效果的重要参数，且对于建立生物大分子的功能、生物活性以及感官特性与水解作用之间的关系具有重要作用。目前有很多测定蛋白质水解度的方法，主要是根据四个原则：①测定自由α-氨基、②测定可溶性蛋白、③滴定释放的质子以及④通过渗透压测定法测定蛋白溶液的冰点。本实验根据测定可溶性蛋白质的原理来测定小球藻蛋白质的水解度。蛋白质经过不同蛋白酶的水解，形成不同长度的短肽，溶解性增加，然后通过可溶性蛋白(含短肽)的含量变化来衡量蛋白质水解的程度。本实验运用Folin-Phonel法对可溶性蛋白质含量进行测定，小球藻的水解度可用下式来计算：

DH＝(水解后的多肽浓度-水解前的多肽浓度)/水解前总水溶性蛋白浓度×100％

水解前或水解后的多肽浓度根据2.2.2测得，水解前总的水溶蛋白质含量根据2.2.1测得。

2.2.4 不同蛋白酶对小球藻蛋白的酶解反应

取按步骤1.3.2的实验方法获得的小球藻蛋白各3g，加0.5mol/L的PBS缓冲液配成6mg/mL的底物溶液，按酶与底物的质量比[E]/[S]＝1:25分别加入复合风味蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶和中性蛋白酶，在各种酶的最佳反应温度和反应pH条件下(复合风味蛋白酶：pH6.0，50℃；碱性蛋白酶：pH8.0，55℃；复合蛋白酶：pH6.0，50℃；中性蛋白酶：pH6.0，45℃)，酶解反应分别为0.25、0.5、1、2、3、4、5h时，分别取酶解液在95℃钝酶15min结束酶解反应，得到酶解产物多肽溶液，分别测定各多肽溶液的抗氧化活性及小球藻蛋白质的水解度，水解度的测定方法按照上述步骤2.2.3，抗氧化活性的测定方法见以下2.2.5。

2.2.5 小球藻抗氧化肽的抗氧化测定方法

2.2.5.1 DPPH自由基清除率测定

取按照步骤2.2.4制得的多肽溶液0.2mL于试管中，分别加入2mLDPPH溶液(无水乙醇配制，0.1mmol/L)，再加入1.9mL水。混匀反应体系,避光反应30min，后于分光光度计517nm处测定吸光值。以水代替样品溶液、无水乙醇代替DPPH溶液，作空白实验调零用。每个试样作三个平行样，取其平均值。DPPH自由基清除率依下面公式计算:

DPPH清除率(％)＝[1-(A₁-A₂)/A₀]×100

其中：A₀为对照实验(水代替样品溶液)的吸光值，A₁为样品实验的吸光值，A₂为样品干扰实验(无水乙醇代替DPPH溶液)的吸光值。

2.2.5.2 超氧自由基清除率测定

取0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(PH8.2)5ml，置于25℃水浴中预热20min，分别加入4ml按照步骤2.2.4制得的多肽溶液，25℃水浴中预热20min，再加入3mmol/L25℃水浴中预热20min的邻苯三酚(焦性没食子酸)溶液1ml，混匀后于25℃水浴中准确反应5min，加入10mol/L HCl 1ml终止反应，于320nm处测定吸光值，空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品。每个试样作三个平行样，取其平均值。超氧自由基清除率依下面公式计算：

超氧自由基清除率(％)＝[1-(样品实验组吸光值-样品本色对照组吸光值)]/无样品对照组吸光值×100

2.2.5.3 羟基自由基清除率测定

于试管中分别加入按照步骤2.2.4制得的多肽溶液2ml，9mmol/L水杨酸-乙醇2ml，9mmol/L FeSO₄2ml，最后加入2ml8.8mmol/L H₂O₂启动反应，37℃反应15min，以蒸馏水为空白对照，在510nm下测量各待测液的吸光值。每个试样作三个平行样，取其平均值。

羟基自由基清除率依下面公式计算

OH·清除率(％)＝[1-(A_X-A_X0)/A₀]×100

式中：A₀—对照(蒸馏水)实验吸光值，A_X—样品液的吸光值，A_X0—背景实验吸收值(反应体系中无H₂O₂)。

2.2.5.4 还原性测定

分别加入按照步骤2.2.4制得的多肽溶液0.2mL，加入0.2mol/LpH6.6的PBS缓冲溶液0.5mL，混合均匀，加入质量分数为1％的铁氰化铁溶液0.5mL，在50℃恒温水浴中保持20min，迅速冷却并加入体积分数为10％的三氯乙酸溶液0.5mL。离心取上清液1.0mL，依次加入1.7mL蒸馏水和0.5mL的0.1％的三氯化铁溶液，充分混合均匀后10min于700nm波长下测定溶液吸光度。每个试样作三个平行样，取其平均值。

以邻苯三酚(焦性没食子酸)为标准品制还原性标准曲线。配置浓度分别为1.6、3.2、4.8、6.4、8.0、9.6、11.2、14.4mg/ml的邻苯三酚溶液，方法同上述步骤，于700nm波长下测定溶液吸光度，以吸光度为纵轴，邻苯三酚溶液浓度为横轴，绘制邻苯三酚还原性标准曲线，如图2所示。以多肽溶液的吸光度与邻苯三酚还原性标准曲线对比，计算得到多肽溶液的还原性相当于邻苯三酚溶液的浓度。

2.3 实验结果

2.3.1 四种酶对小球藻蛋白水解产物的抗氧化活性筛选

2.3.1.1 四种酶对小球藻蛋白在不同水解时间的水解度见图3。

由图3可知，小球藻蛋白浓度为6mg/mL时，四种酶对小球藻蛋白的水解程度，随时水解时间的延长不断呈上升趋势，其中复合风味蛋白酶对小球藻蛋白的水解程度最大，碱性蛋白酶的水解程度最小。在5h时，复合蛋白酶、复合风味蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶对小球藻蛋白的水解度分别为26.25％、28.05％、27.15％、22.84％。

2.3.1.2 四种酶对小球藻蛋白不同水解时间的多肽溶液对DPPH自由基清除率见图4。

由图4可知，复合蛋白酶对小球藻蛋白水解30min时的酶解产物对DPPH自由基的清除率最高，在水解其它时刻，复合蛋白酶、复合风味蛋白酶和中性蛋白酶对小球藻蛋白的水解产物的DPPH自由基清除率相近，均优于碱性蛋白酶。

2.3.1.3 四种酶对小球藻蛋白不同水解时间的多肽溶液对超氧阴离子自由基清除率见图5。

由图5可知，在水解2h之前，复合蛋白酶、复合风味蛋白酶和中性蛋白酶的酶解产物对超氧阴离子自由基的清除率相近，均优于碱性蛋白酶；水解2h以后，中性蛋白酶和复合蛋白酶随着水解时间的延长，其水解产物对超氧阴离子自由基的清除率不断呈现下降趋势，其中中性蛋白酶水解产物的清除率下降的更明显；而复合风味蛋白酶对小球藻蛋白的水解产物在2h以后对超氧阴离子自由基的清除率呈上升趋势，至3h时达到最大为91.61％，之后曲线略有回落且趋于平缓。碱性蛋白酶在整个水解过程，其水解产物对超氧阴离子自由基的清除率变化不大。

2.3.1.4 四种酶对小球藻蛋白不同水解时间的多肽溶液对羟基自由基清除率见图6。

由图6可知，复合蛋白酶和中性蛋白酶在0.5h之前的酶解产物对羟基自由基的清除率随时间延长不断增加至最高，分别为85.36％和72.45％，随后随着时间的延长出现不断下降趋势，至4h时下降到最小值后又出现上升趋势。复合风味蛋白酶在0.5h之前的酶解产物对羟基自由基的清除率随时间延长不断增加至最高达92.08％，随后随着时间的延长出现缓慢下降趋势，至3h时下降到最小值66.79％，而后又不断呈上升趋势。碱性蛋白酶在整个水解过程，其水解产物对羟基自由基的清除率呈先降再升再降再升的趋势，但整个水解产物对羟基自由基的清除率均不高。

综合对比上述3个抗氧化指标，其中复合风味蛋白酶对3个抗氧化指标的作用效果最优，接下来选取复合风味蛋白酶进一步增大水解时间，增加四个指标评价其水解产物的抗氧化能力。

2.3.2 复合风味蛋白酶对小球藻蛋白水解产物的抗氧化活性

2.3.2.1 复合风味蛋白酶对小球藻蛋白在不同水解时间的水解度见图7。

由图7可知，随着时间的延长，复合风味蛋白酶对小球藻蛋白的水解度不断增加，但水解到4h时增加幅度变少，到24h时水解度增加幅度不大。

2.3.2.2 复合风味蛋白酶对小球藻蛋白不同水解时间的多肽溶液对DPPH自由基清除率见图8。

由图8可知，复合蛋白酶对小球藻蛋白水解30min时的酶解产物对DPPH自由基的清除率达到较高水平，随后其清除效果趋于平缓，到5h时清除率略有升高，随后出现下降趋势。

2.3.2.3 复合风味蛋白酶对小球藻蛋白不同水解时间的多肽溶液对超氧阴离子自由基清除率见图9。

如图9所示，复合风味蛋白酶对小球藻蛋白的水解产物对超氧阴离子自由基的清除率随时间延长不断呈上升趋势至3h时达到较高值为84.51％，之后曲线略有回落，到5h时清除率又上升至86.45％，然后又出现下降趋势。

2.3.2.4 复合风味蛋白酶对小球藻蛋白不同水解时间的多肽溶液对羟基自由基清除率见图10。

如图10所示，复合风味蛋白酶在0.5h时的酶解产物对羟基自由基的清除率已达较高水平88.41％，随后随着时间的延长出现非常缓慢下降趋势，至3h时下降到最小值81.04％，而后又不断呈上升趋势但曲线平缓。

2.3.2.5 复合风味蛋白酶对小球藻蛋白不同水解时间的还原性见图11。

如图11所示，复合风味蛋白酶在1h之前的酶解产物的还原性随时间延长不断增加至19.83mg/mL，随后随着时间的延长增长平稳，至3h以后缓慢上升到20.51mg/mL，而后呈缓慢下降趋势。

综合上述结果，底物浓度为6mg/mL时，复合风味蛋白酶对小球藻蛋白水解5h时，4个抗氧化指标的效果最优，接下来选取复合风味蛋白酶的水解时间为5h时，对不同浓度底物的抗氧化效果进行检测。

2.3.3 复合风味蛋白酶对不同浓度底物水解产物的抗氧化活性

按照步骤2.2.4进行操作，取1.3.2的实验方法获得的小球藻蛋白各3g，加0.5mol/L、pH＝6.0的PBS缓冲液配成6mg/mL的底物溶液，按酶与底物的质量比[E]/[S]＝1:25加入复合风味蛋白酶，在pH6.0，50℃下酶解反应5h，取酶解液在95℃钝酶15min结束酶解反应，所得反应液，浓缩至原体积的1/4，冷冻干燥，制得酶解产物为棕黄色的小球藻抗氧化肽0.43g。取小球藻抗氧化肽分别配成0.20、0.22、0.25、0.30、0.35、0.44、0.59、0.89、1.77mg/mL的水解肽溶液，分别测定各水解肽溶液的抗氧化活性，抗氧化活性的测定方法按照步骤2.2.5进行。不同浓度水解肽溶液的抗氧化活性结果如图12所示。

由图12可知，复合风味蛋白酶对小球藻蛋白水解产物的抗氧化性呈浓度依赖性，当水解肽溶液浓度达1.77mg/mL时，水解产物对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率接近V_C(0.5mg/mL)的作用效果，随着水解肽溶液浓度的下降，对各自由基的清除效果不断下降，当水解肽溶液浓度为0.2mg/mL时，水解产物对各自由基的清除率仍在较高水平。

自由基是人体生命活动中多种生化反应的中间代谢产物，其中超氧阴离子自由基是具有代表性的自由基，它在各种致病过程中都是重要的介导因素，与癌症、机体炎症、组织过氧化、蛋白质交联变性、DNA损伤和细胞信号转导等都有着直接的关系。超氧阴离子自由基不仅自身具有毒性，而且可以经过一系列反应生成其它活性氧自由基，进一步对生物体产生损伤作用，且停留时间较长。超氧阴离子自由基是生物活性最高的氧中心自由基之一，它在生命过程和化学反应中作为电子受体，形成不同的活性氧自由基链中的第一个自由基，经过一系列反应生成其它的氧自由基。和其它的活性氧相比，超氧阴离子自由基不是很活泼，但其寿命长，危害大，捕获超氧阴离子自由基进行研究具有重要的意义。因此，以下各实施例和比较例中选择水解产物对超氧阴离子自由基的清除率考察其抗氧化活性。

实施例2

取小球藻粉20g，以料液比1:20(m/v)加入400ml蒸馏水，4℃环境下搅拌1h；将小球藻悬浊液缓放入超低温冰箱中，-70℃环境下冷冻12h；然后于30℃下解冻至4℃，向解冻后的小球藻混合液中缓慢加入NaOH至其终浓度为1％，并不断搅拌，得到碱性混合液；在4℃环境下，碱性混合液用超声破壁处理60min，超声条件为30KHz，然后用0.5M盐酸调pH至7.0；在4000rpm下离心20min，取上清液；加入4倍上清液体积的体积分数95％乙醇溶液，持续搅拌1min，静置5h；在2000rpm下离心10min，弃去上清，取沉淀用50mL蒸馏水溶解后浓缩至30mL左右，冷冻干燥后得到小球藻蛋白2.26g。然后取小球藻蛋白，按照实施例1的步骤2.3.3进行操作，计算小球藻蛋白的得率及不同浓度水解肽溶液对超氧阴离子自由基的清除率，见下表1、表2所示。

表1 不同处理工艺小球藻蛋白质得率

表2 不同处理工艺小球藻蛋白质酶解产物对超氧自由基的清除率

由表1及表2可知，小球藻的破壁处理工艺对小球藻内可溶性蛋白质的提取率及后期酶解产物的抗氧化效果影响很大，超低温结合稀碱与超声波处理工艺可使小球藻内为可溶性蛋白质的提取率增加。同时可使其酶解产物对超氧阴离子自由基的清除率在较低浓度仍具有较高效果，与稀碱与超声波处理相比，前处理增加超低温处理工艺可使小球藻内可溶性蛋白质的提取率增加1.37倍，超氧阴离子自由基清除率在水解肽溶液浓度为0.20mg/mL时，增加1.95倍。

实施例3

取小球藻粉20g，以料液比1:20(m/v)加入400ml蒸馏水，4℃环境下搅拌1h；将小球藻悬浊液缓慢倒入高压均质机中，调节压力至100MPa，重复20次，然后在4℃环境中，向高压均质处理后的小球藻混合液中缓慢加入NaOH至其终浓度为1％，并不断搅拌，得到碱性混合液；在4℃环境下，碱性混合液用超声破壁处理60min，超声条件为30KHz，然后用 0.5M盐酸调pH至7.0；在4000rpm下离心20min，取上清液；加入4倍上清液体积的体积分数95％乙醇溶液，持续搅拌1min，静置5h；在2000rpm下离心10min，弃去上清，取沉淀用50mL蒸馏水溶解后浓缩至30mL左右，冷冻干燥后得到小球藻蛋白2.54g。然后取小球藻蛋白，按照实施例1的步骤2.3.3进行操作，计算小球藻蛋白的得率及不同浓度水解产物对超氧阴离子自由基的清除率，见下表3、表4所示。

表3 不同处理工艺小球藻蛋白质得率

表4不同处理工艺小球藻蛋白质酶解产物对超氧自由基的清除率

由表3及表4可知，小球藻的破壁处理工艺对小球藻内可溶性蛋白质的提取率及后期酶解产物的抗氧化效果影响很大，高压均质结合稀碱与超声波处理工艺可使小球藻内为可溶性蛋白质的提取率大大增加。同时其酶解产物对超氧阴离子自由基的清除率在较低浓度仍具有较好效果，与稀碱与超声波处理相比，前处理增加高压均质处理工艺可使小球藻内可溶性蛋白质的提取率增加1.54倍，超氧阴离子自由基清除率在水解肽溶液浓度为0.20mg/mL时，增加1.50倍。

比较例1

取小球藻粉20g，加700mL水混合均匀，采用沸水浴抽提，提取时间3h，离心，取上清液，加入4倍上清液体积的体积分数95％乙醇溶液，持续搅拌1min，静置5h；在2000rpm下离心10min，弃去上清，取沉淀用50mL蒸馏水溶解后浓缩至30mL左右，冷冻干燥后得到小球藻蛋白0.37g。然后取小球藻蛋白，按照实施例1的步骤2.3.3进行操作，计算小球藻蛋白的得率及不同浓度水解产物对超氧阴离子自由基的清除率，见下表5、表6所示。

表5 不同处理工艺小球藻蛋白质得率

表6 不同处理工艺小球藻蛋白质酶解产物对超氧自由基的清除率

由表5可知，小球藻的破壁处理工艺对小球藻内可溶性蛋白质的提取率影响很大。热水抽提时，小球藻内可溶性蛋白质的溶出率较低。与热水抽提相比，稀碱与超声波处理处理工艺可使小球藻内可溶性蛋白质的提取率增加4.39倍。由表6可知，热水抽取获得的蛋白质，其水解产物对超氧阴离子自由基的清除率在不同浓度下均低于稀碱溶胀与超声波结合的处理工艺。

比较例2

称取小球藻粉20g，以料液比1:20(m/v)加入400ml蒸馏水，4℃环境下搅拌1h；在4℃环境中，向小球藻溶液中缓慢加入NaOH至其浓度为2％，并不断搅拌；升温到60℃，提取2h后，将PH调至7，在4000rpm下离心20min，取上清液；加入4倍上清液体积的体积分数95％乙醇溶液，持续搅拌1min，静置5h；在2000rpm下离心10min，弃去上清，取沉淀用50mL蒸馏水溶解后浓缩至30mL左右，冷冻干燥后得到小球藻蛋白1.26g。然后取小球藻蛋白，按照实施例1的步骤2.3.3进行操作，计算小球藻蛋白的得率及不同浓度水解产物对超氧阴离子自由基的清除率，见下表7、表8所示。

表7 不同处理工艺小球藻蛋白质得率

表8 不同处理工艺小球藻蛋白质酶解产物对超氧自由基的清除率

由表7可知，小球藻的破壁处理工艺对小球藻内可溶性蛋白质的提取率影响很大。碱液提取时，小球藻内可溶性蛋白质的溶出率为6.29％。但与稀碱与超声波处理处理工艺相比，后者可使小球藻内可溶性蛋白质的提取率增加1.31倍。由表8可知，碱液提取获得的蛋白质，其水解产物对超氧阴离子自由基的清除率在不同浓度下均低于稀碱溶胀与超声波结合的处理工艺，说明碱液高温下提取虽然比热水抽取获得更多的可溶性蛋白，但其对超氧阴离子自由基的清除率明显降低。

Claims

1.一种小球藻抗氧化肽的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)小球藻干粉加入蒸馏水混匀，所述蒸馏水的体积用量以小球藻干粉质量计为20mL/g，4℃下搅拌1～3h，得到小球藻混合液，小球藻混合液在-70℃下冷冻12h，再于30℃下解冻至4℃，在不断搅拌下向解冻后的小球藻混合液中加入NaOH，使NaOH的质量终浓度为1～4％，得到碱性混合液，然后将碱性混合液在4℃下超声破壁处理1～2h，调pH值为7.0，离心分离，取上清液，加入体积为上清液体积4倍的体积分数95％的乙醇，搅拌1～10分钟后，静置5～6小时，再次离心，弃去上清液，取沉淀用蒸馏水清洗，然后用少量蒸馏水溶解，浓缩、冷冻干燥制得小球藻蛋白；

(2)小球藻蛋白加0.5mol/L的PBS缓冲液配成6mg/mL浓度的底物水溶液，按酶与底物的质量比1:25加入复合蛋白酶、复合风味蛋白酶、中性蛋白酶或碱性蛋白酶，在各种酶的最佳反应温度和反应pH条件下，进行酶解反应，反应0.5～5h，然后将酶解液升温至90～95℃反应15～30min，结束酶解反应，所得反应液浓缩至原体积的1/4，冷冻干燥，制得小球藻抗氧化肽。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，复合风味蛋白酶的反应条件为pH值6.0，反应温度50℃；碱性蛋白酶的反应条件为pH值8.0，反应温度55℃；复合蛋白酶的反应条件为pH值6.0，反应温度50℃；中性蛋白酶的反应条件为pH值6.0，反应温度45℃。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，向底物水溶液中加入复合风味蛋白酶进行酶解反应，反应条件为pH值6.0，反应温度50℃。

4.如权利要求1～3之一所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，酶解反应的时间为5小时。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)按以下步骤操作：

小球藻干粉加入蒸馏水混匀，所述蒸馏水的体积用量以小球藻干粉质量计为20mL/g，4℃下搅拌1～3h，得到小球藻混合液，小球藻混合液加入高压均质机中，调节压力至100MPa，处理15～20次，然后在4℃、不断搅拌下向高压均质后的小球藻混合液中加入NaOH，使NaOH的质量终浓度为1～4％，得到碱性混合液，然后将碱性混合液在4℃下超声破壁处理1～2h，调pH值为7.0，离心分离，取上清液，加入体积为上清液体积4倍的体积分数95％的乙醇，搅拌1～10分钟后，静置5～6小时，再次离心，弃去上清液，取沉淀用蒸馏水清洗，然后用少量蒸馏水溶解，浓缩、冷冻干燥制得小球藻蛋白。