CN103343154A - 一种大豆抗疲劳生物活性肽的制备 - Google Patents

Abstract

一种大豆抗疲劳生物活性肽的制备属于植物蛋白的提取加工技术，该方法以高变性豆粕为原料，加水配成混合液，将混合液进行超声预处理，向处理后的混合液中加入中性蛋白酶进行酶解，得到酶解液，酶解后采用膜分离技术对酶解液进行超滤处理，得到肽含量高、分子量小于5kDa生物活性肽，然后采用阴离子交换层析及反相高效液相色谱进行分离纯化，最后冷冻干燥得到大豆抗疲劳生物活性肽；本发明制得的产品能够使小鼠运动后具有较高的抗氧化酶活性和较低的丙二醛（MDA）含量，结果说明大豆肽通过清除体内产生的自由基和抑制脂质过氧化物的生成，减少因脂质氧化带来的细胞损伤，起到抗疲劳作用。

Description

一种大豆抗疲劳生物活性肽的制备

技术领域

本发明属于植物蛋白的提取加工技术，主要涉及一种大豆抗疲劳生物活性肽的制备。

背景技术

大豆经过压榨或浸提后的豆粕含有45%左右的蛋白质。大豆蛋白中氨基酸的含量较为均衡，除蛋氨酸含量略低外，其他人体所必需的氨基酸含量均较高。目前豆粕主要用于饲料，这样大大浪费了大豆蛋白资源，所以需要通过生物技术等方法使豆粕中的大豆蛋白得到充分利用。大豆肽即大豆蛋白经酶水解后得到的相对分子质量在5 000以下的低聚肽混合物，其氨基酸的组成与大豆蛋白基本相同，其中必需氨基酸含量丰富。大豆肽具有易消化吸收、液体黏性小、持水性好、营养全面和受热不凝固等诸多特性，尤其是具有抗氧化、抗疲劳增强肌肉运动能力等非特异性作用。

目前有关大豆肽体外抗氧化能力已经被人们所认可，但在国内关于大豆肽在体内抗氧化能力的研究很少，而且有关大豆肽抗疲劳能力的研究也很少。已有研究者证实利用抗氧化物质饲喂实验小鼠具有抗疲劳的功效。目前大豆抗疲劳活性肽的制备大多数采用酶解水解法，几乎没有采用超声波辅助酶解制备抗疲劳活性肽。现有的制备抗疲劳活性肽技术存在成本高，产品的抗疲劳活性低、纯度低等问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种大豆抗疲劳生物活性肽的制备方法，达到提高产品抗疲劳活性的目的。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种大豆抗疲劳生物活性肽的制备，以高变性豆粕为原料，加水配成底物浓度为6-10%的混合液，将混合液进行超声预处理，所述的超声功率300-500W，超声时间10-30min，超声温度45-55℃；向处理后的混合液中加入中性蛋白酶进行酶解，得到酶解液，所述的酶解时间3-5h，加酶量28000-36000U/g底物；酶解后采用膜分离技术对酶解液进行超滤处理，得到肽含量高、分子量小于5 kDa生物活性肽，后采用阴离子交换层析及反相高效液相色谱进行分离纯化，最后冷冻干燥得到大豆抗疲劳生物活性肽。

所述的最优底物浓度为8%。

所述的超声预处理优选参数为：超声功率390W，超声时间12min，超声温度48℃。

所述的酶解工艺优选参数为：酶解时间4h，加酶量32000U/g底物。

本方法以高变性豆粕为原料，采用超声辅助酶解法制备大豆抗疲劳生物活性肽。由于超声波的空化效应和强化传质作用，使蛋白质的结构改变，利于后续酶解。纯化的产品能够使小鼠运动后具有较高的抗氧化酶活性和较低的丙二醛（MDA）含量，结果说明大豆肽通过清除体内产生的自由基和抑制脂质过氧化物的生成，减少因脂质氧化带来的细胞损伤，起到抗疲劳作用。

附图说明

附图 本发明总工艺路线图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明具体实施例进行详细描述，

一种大豆抗疲劳生物活性肽的制备，以高变性豆粕为原料，加水配成底物浓度为6-10%的混合液，将混合液进行超声预处理，所述的超声功率300-500W，超声时间10-30min，超声温度45-55℃；向处理后的混合液中加入中性蛋白酶进行酶解，得到酶解液，所述的酶解时间3-5h，加酶量28000-36000U/g底物；酶解后采用膜分离技术对酶解液进行超滤处理，得到肽含量高、分子量小于5 kDa生物活性肽，后采用阴离子交换层析及反相高效液相色谱进行分离纯化，最后冷冻干燥得到大豆抗疲劳生物活性肽。

所述的最优底物浓度为8%。

所述的超声预处理优选参数为：超声功率390W，超声时间12min，超声温度48℃。

所述的酶解工艺优选参数为：酶解时间4h，加酶量32000U/g底物。

 

实施例1：超声预处理最佳参数的筛选试验

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

1.2 主要仪器设备

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

高变性豆粕→加水配成溶液→超声预处理→酶解→灭酶→冷却→调pH酸性→离心→上清液→冷冻干燥→抗氧化活性肽

1.3.2 二苯代苦味酰基（DPPH）自由基清除率的测定

取水解液1.00 mL，加入4.00 mL 100 μmol·L-1 DPPH乙醇溶液混匀，避光放置30 min，以原溶剂调零，在517 nm处测定吸光度记为A_i；同法取1.00 mL溶剂加入4.00 mL 100 μmol·L-1 DPPH溶液混匀，测定吸光度记为A_c；取1.00 mL水解液加入4.00 mL的溶剂混匀，测定吸光度记为A_j。按照以下公式计算DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率(%) = [1-(A_i-A_j)/ A_c]×100

2 结果与讨论

2.1 试验因素水平编码表

在单因素试验的基础上，采用响应面分析以超声预处理时间、功率、温度为试验因素，以水解物DPPH自由基清除率为指标，设计三因素三水平的二次回归方程来拟合因素和指标（响应值）之间的函数关系，采用响应面分析法确定超声预处理高变性豆粕的最优工艺参数。其试验因素水平选取见表2-1。

表2-1 响应面试验因素水平表

2.2 响应面试验安排及试验结果

本试验应用响应面优化法进行过程优化。以X₁、X₂、X₃为自变量，以DPPH自由基清除率Y为响应值，响应面试验方案及结果见表2-2。

表2-2 响应面设计与试验结果

以X ₁、X ₂、X ₃分别表示功率、时间、温度，以Y表示响应值(DPPH自由基清除率)。试验数据经SAS8.0软件进行二次回归分析，得到回归方程： 

Y=57.53+4.33125X ₁-3.51125X ₂-1.425X ₃+1.86625X ₁ X ₁+5.9725X ₁ X ₂-3.025X ₁ X ₃-

2.65875X ₂ X ₂+1.97X ₂ X ₃-4.50625X ₃ X ₃

通过方差分析来验证模型及各参数的显著度见表2-3。

表2-3 响应面方差分析

从方差分析可看出，模型Pr >F小于0.05，表明该模型是显著的。同时模型中的参数X ₁、X ₂、X ₁ X ₂、X ₃ X ₃都是极显著的(Pr >F小于0.01)，X ₁ X ₃、X ₂ X ₂都是显著的(Pr >F小于0.05)。模型失拟项(Lack of Fit)表示模型预测值与实际值不拟合的概率。表3-5中模型失拟项Pr >F为0.0598>0.05。因此，模型失拟项不显著，说明模型中不需要引入更高次数的项，模型选择合适；模型的相关系数R²为0.9703，大于0.9，模型拟合程度很好；同时，变异系数(CV)值为3.43，说明模型方程能够很好的反映真实的试验值。所以，可以用该模型来分析响应值(DPPH自由基清除率)的变化。

从响应面分析法，得到DPPH自由基清除率预测值最大时的条件：超声功率393.776 W、时间11.5011 min、温度48.385 ℃，该条件下得到DPPH自由基清除率为61.12%。为检验响应面法所得结果的可靠性，采用上述优化条件进行试验，同时考虑到实际操作情况，将超声条件修正为超声功率390 W、时间12 min、温度48 ℃，然后在中性蛋白酶最佳条件下进行水解，测得水解物DPPH自由基清除率为64.28%，与回归方程预测值基本吻合，这表明模型是合理有效的。

 

实施例2：酶解工艺最佳参数的筛选试验

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

1.2 主要仪器设备

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

高变性豆粕→加水配成溶液→超声预处理→酶解→灭酶→冷却→调pH酸性→离心→上清液→冷冻干燥→抗氧化活性肽

1.3.2 二苯代苦味酰基（DPPH）自由基清除率的测定

取水解液1.00 mL，加入4.00 mL 100 μmol·L-1 DPPH乙醇溶液混匀，避光放置30 min，以原溶剂调零，在517 nm处测定吸光度记为A_i；同法取1.00 mL溶剂加入4.00 mL 100 μmol·L-1 DPPH溶液混匀，测定吸光度记为A_c；取1.00 mL水解液加入4.00 mL的溶剂混匀，测定吸光度记为A_j。按照以下公式计算DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率(%) = [1-(A_i-A_j)/ A_c]×100

2 结果与讨论

2.1 试验因素水平编码表

根据单因素试验，采用三因素三水平正交设计，进一步讨论底物浓度、水解时间和加量酶的最佳组合。试验以DPPH自由基清除率为指标确定出最佳的水解条件。正交试验设计如表2-1所示。

表2-1 正交试验设计方案

2.2 响应面试验安排及试验结果

正交试验结果如表2-2所示，方差分析见表2-3。

由表2-2中对水解物DPPH自由基清除率的极差分析可知，在中性蛋白酶水解豆粕的反应过程中，各试验因素对豆粕酶解作用的影响大小次序为：酶解时间＞加酶量＞底物浓度。

表2-2 正交试验设计与结果

由表2-3对DPPH自由基清除率的方差分析可知，在上述三个因素中，酶解时间对水解影响极显著(Pr >F小于0.01)，加酶量影响显著(Pr >F小于0.05)，底物浓度影响不显著(Pr >F大于0.05)。

表2-3 正交试验方差分析

通过对DPPH自由基清除率的极差和方差分析还可得出用中性蛋白酶水解豆粕的最佳工艺组合为A₂B₂C₂，即底物浓度8%、时间为4 h、加酶量32 000 U/g底物。此组合不在试验设计中，试验设计中的最佳工艺组合为A₂B₂C₃，即底物浓度8%、时间为4 h、加酶量36 000 U/底物。在上述两个条件中，加酶量不同，所以有必要作验证试验。按上面优选工艺A₂B₂C₂，平行水解3次，得到水解物的DPPH自由基清除率为47.16%，表明试验所确定的最佳工艺为较优工艺。

 

实施例3：小鼠的抗疲劳试验

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

1.2 主要仪器设备

1.3 试验方法

1.3.1 小鼠的饲养与样本采集

将体重均为18g左右的60只小鼠随机分为2组：空白对照组和大豆肽组。其中大豆肽物组以0.5g/kg·d进行灌胃，对照组灌胃同体积的生理盐水。各组小鼠均饲养在20-25℃环境中。连续灌胃大豆肽30d后，最后一次灌胃30min后，在对照组和大豆肽组各取15只小鼠，直接处死，迅速取其肝脏待测。再将各组剩下的15只小鼠取出，在水温30℃左右，不负重游泳90min，捞出小鼠擦干，立即处死取其肝脏待测。

1.3.2 小鼠肝脏超氧化物歧化酶(SOD)活性测定

SOD酶活测定采用黄嘌呤氧化酶法，用生理盐水洗去肝脏残留血液，滤纸拭干后，准确称量其质量，加生理盐水配制成10%的组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液加生理盐水稀释成1%的匀浆，按照试剂盒操作说明进行测定。

1.3.3 小鼠肝脏谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性测定

GSH-PX酶活测定采用二硫代二硝基苯甲酸染色法，用生理盐水洗去肝脏残留血液，滤纸拭干后，准确称量其质量，加生理盐水配制成10%的组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液加生理盐水稀释成0.25%的匀浆，按照试剂盒操作说明进行测定。

1.3.4 小鼠肝脏丙二醛(MDA)含量测定

MDA含量测定采用硫代巴比妥酸比色分析法，用生理盐水洗去肝脏残留血液，滤纸拭干后，准确称量其质量，加生理盐水配制成10%的组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液，按照试剂盒操作说明进行测定。

2 结果与讨论

通过对小鼠运动前后肝脏抗氧化酶活性和丙二醛含量的测定，可以知道运动过程中消耗体内的抗氧化物质、生成过多的自由基，造成抗氧化酶活性降低、丙二醛含量升高；用具有抗疲劳活性的大豆肽灌胃小鼠，在运动后大豆肽组比对照组具有较高的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，较低的丙二醛含量，说明大豆肽可能是通过清除体内产生的自由基和抑制脂质过氧化物的生成，减少因脂质氧化带来的细胞损伤，延缓疲劳的产生、起到抗疲劳作用。

Claims (4)

1.一种大豆抗疲劳生物活性肽的制备，其特征在于：以高变性豆粕为原料，加水配成底物浓度为6-10%的混合液，将混合液进行超声预处理，所述的超声功率300-500W，超声时间10-30min，超声温度45-55℃；向处理后的混合液中加入中性蛋白酶进行酶解，得到酶解液，所述的酶解时间3-5h，加酶量28000-36000U/g底物；酶解后采用膜分离技术对酶解液进行超滤处理，得到肽含量高、分子量小于5 kDa生物活性肽，后采用阴离子交换层析及反相高效液相色谱进行分离纯化，最后冷冻干燥得到大豆抗疲劳生物活性肽。

2.根据权利要求1所述的一种大豆抗疲劳生物活性肽的制备，其特征在于所述的最优底物浓度为8%。

3.根据权利要求1所述的一种大豆抗疲劳生物活性肽的制备，其特征在于所述的超声预处理优选参数为：超声功率390W，超声时间12min，超声温度48℃。

4.根据权利要求1所述的一种大豆抗疲劳生物活性肽的制备，其特征在于所述的酶解工艺优选参数为：酶解时间4h，加酶量32000U/g底物。

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