CN101669571A - 乳酸菌混菌发酵结合酶解法生产蛋白饲料源小肽工艺 - Google Patents

乳酸菌混菌发酵结合酶解法生产蛋白饲料源小肽工艺 Download PDF

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高学军
黄建国
严云勤
陈超
佟慧丽
王娜
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Abstract

本发明提供一种利用微生物发酵和酶解复合技术，采用常用蛋白饲料的乳酸菌混菌发酵结合酶解法生产蛋白饲料源小肽工艺。工艺流程：选择新鲜优质的豆粕、玉米蛋白粉、麦麸，使用粉碎机粉碎后过40目的筛子，称量后按比例进行混匀，称取一定量混合物，按5％蛋白质浓度与50℃去离子水混合，搅拌均匀，应用饱和Ca(OH)2调节pH为7.7，经封装置于55℃空气浴振荡器中，频率100r/min，萃取反应60min；利用微生物发酵和酶解复合技术采用常用蛋白饲料制得的小肽无苦味和异味，口感好，生产成本大大降低，小肽得率占蛋白质含量65％，蛋氨酸2.51％，提高1.67％，赖氨酸5.17％，提高1.76％，为其他蛋白饲料资源生产饲用小肽提供了有效的资料和数据。

Description

乳酸菌混菌发酵结合酶解法生产蛋白饲料源小肽工艺
(一)技术领域
本发明涉及生物技术，具体说就是一种乳酸菌混菌发酵结合酶解法生产蛋白饲料源小肽工艺。
(二)背景技术
100多年前，人们已经注意到了肽的吸收和转运(mathews，1987)。近十多年来，肽在奶牛体内的作用已引起科学界的高度重视，大量研究结果表明，蛋白质摄入后，并不完全水解成氨基酸，而是大部分以肽的形式吸收，同时发现，小肽被吸收的速度比同组成的氨基酸要快，且无饱和，无竞争性抑制。不仅如此，特定的小肽具有调节植物神经系统、活化细胞机能、提高泌乳能力和改善牛奶成分等生理活性。这些发现为开发奶牛饲料源小肽产品提供了理论依据。小肽是指含2个或者3个氨基酸残基的一类化合物。根据所发挥的功能把小肽分为两大类，即营养性小肽和功能性小肽。营养性小肽是指不具有特殊生理调节功能，只为蛋白质合成提供氮架的小肽；功能性小肽是指参与调节动物的某些生理活动或具有某些特殊作用的小肽，如免疫肽、抗菌肽、抗氧化肽、表皮生长因子等。
在国外，发达国家在小肽的研究、生产与应用方面已经取得了许多成果。国外对各类肽制品开发与应用方面的研究日益活跃，研究范围日益广泛，其中包括水解蛋白肽类产品开发的有酪蛋白肽、大豆肽、小麦肽、玉米肽、血蛋白肽、水产蛋白肽、海洋生物肽、胶原肽等。美国与日本在20世纪80年代相继研究出大豆多功能肽，并已成功地将大豆多功能肽用于饲料行业。目前，大豆多功能肽产品已在美国、日本等发达国家饲料行业中得到广泛开发和应用。
国内方面，我国科研人员也对小肽的生产和特性进行了研究。为了弥补我国在小肽研制和生产方面与国外的差距，“大豆低聚肽的开发与应用”等酶解肽项目被列入国家“九五”重点科技攻关项目，2002年被列入国家级重点新产品开发计划，并取得了良好的成果。
随着实验手段的现代化，奶牛对肽的营养由纯生理研究向营养研究发展取得了重大发展，生物活性肽的发现开创了动物营养的新纪元，但是在奶牛饲料对肽研究制备领域尚存在空白。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种利用微生物发酵和酶解复合技术，采用常用蛋白饲料的乳酸菌混菌发酵结合酶解法生产蛋白饲料源小肽工艺。本发明的目的是这样实现的：乳酸菌混菌发酵结合酶解法生产蛋白饲料源小肽，工艺流程如下：
(1)原料预处理：
步骤一：选择新鲜优质的豆粕、玉米蛋白粉、麦麸，使用粉碎机粉碎后过40目的筛子，称量后按比例进行混匀，混合比例按美国NRC营养标准中赖氨酸、蛋氨酸理论含量值并根据奶牛赖氨酸和蛋氨酸营养需要比例(100.00∶48.70)确定豆粕∶玉米蛋白粉∶麸皮＝15∶4∶1；
步骤二：称取一定量混合物，按5％蛋白质浓度与50℃去离子水混合，搅拌均匀，应用饱和Ca(OH)2调节pH为7.7，经封装置于55℃空气浴振荡器中，频率100r/min，萃取反应60min；
步骤三：浸提后溶液经121℃高温湿热灭菌15min，杀灭病原菌，钝化脂肪氧化酶和脲酶等成分；
(2)乳酸菌发酵：将菌种解冻复活，在种子培养基上接种，培养14h达对数生长期后接种至增殖培养基，接菌量5％：其中乳酸乳球菌3％、保加利亚乳杆菌2％，培养时间8h；当灭菌后蛋白浸提液温度降至40℃进行接菌，接菌量10％，温度37.5℃，湿度70％，恒温发酵36h；
(3)热处理：发酵后混合液经90℃、10min的热处理，杀灭微生物发酵菌群，并使蛋白质适度变性；
(4)酶解：
加酶水解：经热处理后的发酵液通过测定发酵液中蛋白质的含量配制成5％蛋白质浓度溶液，用4mol/L的NaOH调节pH值8.5，置于恒温水浴中，温度40℃，胰蛋白酶的用量按蛋白底物浓度比0.6％，胰酶1.5％，酶解4.5h，小肽得率65％，水解度29.1％。酶解过程中pH值应保持在6.5～7.0的范围内，出现异常时，用HCL及Ca(OH)2进行调解；酶失活处理：将酶水解液加热到80～85℃，恒温保持5min，使酶失活；
(5)产品的干燥：采用DZF-6030B型真空干燥箱在55℃进行真空浓缩至浓度30％～40％；后经FD-1B-55型真空冷冻干燥机干燥，获得小肽产品。
应用豆粕和玉米蛋白粉均已能工业化生产小肽，但是利用他们生产的小肽功能均不理想，豆粕缺乏含硫氨基酸(主要是蛋氨酸)，玉米蛋白粉缺乏赖氨酸和色氨酸，溶解性不好。本发明采用具备蛋白酶活力的乳酸乳球菌、保加利亚乳杆菌混菌发酵结合酶解法生产蛋白饲料源小肽，原料配比时根据美国NRC蛋白营养标准(2002)将豆粕和玉米蛋白粉进行配比，充分考虑赖氨酸、蛋氨酸比例，为了有效提高乳酸菌的代谢活力，添加一定比例的麸皮，通过微生物发酵作用使蛋白质转化增殖显著提高赖氨酸、蛋氨酸含量及改善二者比例；将发酵的蛋白饲料经复合酶解，控制水解度，使获得的小肽分子质量主要集中在300～800Da。利用微生物发酵和酶解复合技术采用常用蛋白饲料制得的小肽无苦味和异味，口感好，生产成本大大降低，小肽得率占蛋白质含量65％，蛋氨酸2.51％，提高1.67％，赖氨酸5.17％，提高1.76％，优于国内外类似产品，为其他蛋白饲料资源生产饲用小肽提供了有效的资料和数据。
(四)附图说明
图1为本发明的20μg/ml的标准衍生液HPLC结果；
图2为本发明的赖氨酸标准曲线；
图3为本发明的10μg/ml的标准衍生液HPLC结果；
图4为本发明的1ml饲料源蛋白小肽产品水解样HPLC结果；
图5为本发明的蛋氨酸标准曲线；
图6为本发明的蛋氨酸含量变化曲线：
图7为本发明的赖氨酸标准曲线图；
图8为本发明的赖氨酸含量变化曲线；
图9为本发明的不同蛋白酶酶解效果图；
图10为本发明的标准出峰曲线；
图11为本发明的水解液凝胶G-15洗脱图谱。
(五)具体实施方式
下面结合附图举例对本发明作进一步说明。
实施例1：结合图1-图11，本发明一种乳酸菌混菌发酵结合酶解法生产蛋白饲料源小肽工艺，工艺流程如下：
(1)原料预处理：
步骤一：选择新鲜优质的豆粕、玉米蛋白粉、麦麸，使用粉碎机粉碎后过40目的筛子，称量后按比例进行混匀，混合比例按美国NRC营养标准中赖氨酸、蛋氨酸理论含量值并根据奶牛赖氨酸和蛋氨酸营养需要比例(100.00∶48.70)确定豆粕∶玉米蛋白粉∶麸皮＝15∶4∶1；
步骤二：称取一定量混合物按5％蛋白质浓度与50℃去离子水混合，搅拌均匀，应用饱和Ca(OH)2调节pH为7.7，经封装置于55℃空气浴振荡器中，频率100r/min，萃取反应60min；
步骤三：浸提后溶液经121℃高温湿热灭菌15min，杀灭病原菌，钝化脂肪氧化酶和脲酶等成分；
(2)乳酸菌发酵：将菌种解冻复活，在种子培养基上接种，培养14h达对数生长期后接种至增殖培养基，接菌量5％：其中乳酸乳球菌3％、保加利亚乳杆菌2％，培养时间8h；当灭菌后蛋白浸提液温度降至40℃进行接菌，接菌量10％，温度37.5℃，湿度70％，恒温发酵36h；
(3)热处理：发酵后混合液经90℃、10min的热处理，杀灭微生物发酵菌群，并使蛋白质适度变性；
(4)酶解：
加酶水解：经热处理后的发酵液通过测定发酵液中蛋白质的含量配制成5％蛋白质浓度溶液，用4mol/L的NaOH调节pH值8.5，置于恒温水浴中，温度40℃，胰蛋白酶的用量按蛋白底物浓度比0.6％，胰酶1.5％，酶解4.5h，小肽得率65％，水解度29.1％。酶解过程中pH值应保持在6.5～7.0的范围内，出现异常时，用HCL及Ca(OH)2进行调解；酶失活处理：将酶水解液加热到80～85℃，恒温保持5min，使酶失活；
(5)产品的干燥：采用DZF-6030B型真空干燥箱在55℃进行真空浓缩至浓度30％～40％；后经FD-1B-55型真空冷冻干燥机干燥，获得小肽产品。
实施例2：结合图1-图11，本发明一种乳酸菌混菌发酵结合酶解法生产蛋白饲料源小肽工艺，所用原料为：胰酶(Amersco)、胰蛋白酶(Amersco)，豆粕、玉米蛋白粉、麸皮，乳酸乳球菌(实验室保藏具备蛋白酶活力)、保加利亚乳杆菌(实验室保藏具备蛋白酶活力)。
培养基：
种子培养基：乳酸乳球菌M17球菌半选择培养基；保加利亚乳杆菌使用MRS培养基。
增殖培养基：100g大麦芽根浸提液、蛋白胨10g、蔗糖10g、葡萄糖10g、pH7.0的磷酸盐缓冲液400ml，加蒸馏水至1L，调节pH值为6.8～7.0。113℃灭菌30min。
主要试剂：L-赖氨酸标准品(Amersco，色谱纯)，其他试剂均为国产分析纯；0.8mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH9.0)；含
Figure A20091007298900081
甲醇的0.01mol/L NaAC缓冲液(pH5.2)：称取2.50g无水乙酸钠，用水溶解后定容1000mL，冰乙酸调节pH至5.20。取0.01mol/L pH5.2NaAC缓冲液750mL与250mL色谱纯甲醇混合，经0.45mm微孔滤膜真空超滤，并超声波脱气；30mg/mLCDNB溶液(2，4-二硝基氯苯溶液)：称取2，4-二硝基氯苯3.0g，用甲醇溶解定容100mL，临用新配。其他试剂均为国产分析纯试剂。
指标测定方法：水分的测定：GB/T 14769；粗蛋白含量测定：GB/T 5009.5-85；可溶性氮(NSI)含量测定：GB 5511-1985附录A；酸溶性蛋白含量(TCA-NSI)测定：QB/T 2653-2004；水解度(DH)测定：按《植物蛋白功能原理与工艺》中茚三酮比色法测定；蛋白酶活力测定：按QB/T 1803-1993中福林-酚试剂法测定；乳酸菌酶活力测定：SB/T 10317-1999；蛋氨酸含量测定：按《粮油食品品质分析》中亚硝基铁氰化钠法测定；赖氨酸含量测定方法为自行设计，详见以下步骤：
(1)样品液的准备
本实验称取含蛋白质10～20mg的试样(约50～100mg，准确至0.1mg)按照GB/T 18246-2000中酸水解法进行水解。水解后，冷却，混匀，开管，过滤，用蒸馏水反复冲洗试管和滤纸，定容至50mL。用移液管吸取10mL滤液，置真空干燥箱中，60℃，抽真空，蒸发至干后加少量三蒸水重复蒸发至干1～2次，最后用1mL三蒸水溶解，供进一步的氨基酸衍生用。
(2)氨基酸标准样品的衍生
根据1mol赖氨酸与1molCDNB在碱性条件下生成1molDNP-LYS的衍生反应原理，确定衍生剂的理论用量(1mg赖氨酸需要1.39mgCDNB)。为了保证衍生化反应完全，应适当加入过量的衍生剂，经试验CDNB理论值的5倍量衍生化效果较好。
根据上述理论，准确吸取6份赖氨酸标准液各1mL，分别置于6个10mL具塞离心管中，再分别吸取pH9.0Na2CO3-NaHCO3缓冲液2mL，混匀后，按照CDNB理论值的5倍量分别加入，用微型漩涡混合仪混匀，置85℃恒温水浴锅中，避光暗反应1.5h，取出，冷却至室温，应用1mol/L盐酸调解pH值至7.0，用三蒸水稀释至50ml容量瓶中定容，混匀，配置成了相当于含赖氨酸分别为80μg/mL，60μg/mL，40μg/mL，20μg/mL，10μg/mL，2μg/mL的标准衍生液。
(3)氨基酸水解液的衍生
吸取样品液1mL，分别置于50mL具塞离心管中，再分别吸取pH9.0Na2CO3-NaHCO3缓冲液2mL，混匀后，加入CDNB溶液各0.4mL，混匀，其他步骤同2.3
(4)色谱条件
C18不锈钢分离柱YMC(5μm 4.6×150mm)；流动相，含
Figure A20091007298900091
Figure A20091007298900092
甲醇的0.01mol/L pH5.2NaAC缓冲液；检测波长，350nm；柱温，24℃；流速，0.8mL/min；外标法定量；实验用水均系本实验室SZ-93自动双重纯水蒸馏器制备。
衍生化后的试剂经0.22μm微孔滤膜过滤后在本实验色谱条件下直接上样，体积10μl，进行含量测定。3结果
(5)氨基酸标准样品衍生后峰形的鉴别
用标准2，4-二硝基酚(DNP-OH)、DNP-Lysine与样品水解液作比较叠加，它们分别为峰1、峰2、峰3，在衍生过程中通过不加赖氨酸、CDNB或是不经过衍生直接上样，均有峰1，是杂质峰，是溶液中的，最终确定峰2、峰3是水解过程中产生的，峰2为CDNB在碱性条件下形成的DNP-OH，峰3为经CDNB衍生生成的DNP-赖氨酸，为目的峰，出峰时间为14.685min，峰4经过多次实验，确定是衍生化过程中产生的，查阅文献为2，4-二硝基羟乙基苯(DEB)(黛华，1993)
(6)赖氨酸衍生后标准曲线的建立
以进样浓度(μg/mL)对所得峰面积(μv.s)作直线回归，获得回归方程Y＝1817.4X+2679.7，见图2。在进样量为2μg/mL～80μg/mL的范围内，经重复进样，线性系数均在0.9999，在此范围内进样浓度与峰面积程良好的线性关，各物质得到较好的分离见图3，最低捡出限为2μg/mL。
(7)样品衍生图谱分析
称取0.1000g饲料源蛋白小肽产品根据2.2、2.3试验方法进行水解、衍生化处理，过滤后上样。测定结果见图4，在14.886min出现目的峰，与标准品出峰时间一致，根据HPLC峰面积计算，测得饲料源蛋白小肽产品含赖氨酸5.17％，与其他报道及正常豆粕(3.13％)相比，赖氨酸含量较高。
(8)方法评价
采用柱前衍生反相高效液相色谱法分析赖氨酸是一种灵敏、快速的方法。本文采用CDNB作为柱前衍生生化试剂，CDNB(生化试剂)价格便宜，理化性质稳定；衍生化过程简便，反应易于控制，氨基酸的取样量少，过量的CDNB对测定无干扰，衍生化制得的DNP-Lys性质稳定，线性关系良好。样品水解、衍生后经HPLC，C18柱分离，UV350nm检测，用含
Figure A20091007298900101
甲醇的0.01mol/L pH5.2NaAc缓冲液为流动相，赖氨酸与其他氨基酸分离效果较好，可以准确测定饲料中赖氨酸的含量，为小肽产品及其他饲料中赖氨酸含量的测定提供了一种有效的方法。
平均肽链长度估算：
小肽的平均链长即肽链的平均氨基酸残基数。根据李培骏(2006)研究总结，小肽的平均链长≈1/DH×100％，水解度控制是发酵和酶水解过程的关键，本试验预制备含3～8个氨基酸残基的小肽水解物，即水解度控制在10.0％～34.0％。
小肽分子质量分布测定：
验采用凝胶柱层析法对小肽水解液的分子质量分布范围进行测定。柱Sephadex G-15(1.0cm×80.0cm)，流速1.3mL/min，0.1mol/LpH7.0Tris-HCl洗脱液，温度18℃(YC-1型层析试验冷柜)，检测波长280nm下测定，经CDMC色谱工作站分析。取杆菌肽(Mw＝1445Da)、氧化型谷胱甘肽(Mw＝612.66Da)、还原型谷胱甘肽(Mw＝307.22Da)、酪氨酸(Mw＝181.2Da)、(溶菌酶(Mw＝14400Da)、牛血清白蛋白(Mw＝68000Da)各50mg，分别溶于5ml三蒸水中，制成标准溶液。
将已处理好的Sephadex G-15装柱，用洗脱液洗脱至基线平稳，加入标准溶液3ml，并记录最大吸收峰出现时间(min)，并绘制出峰时间与标准蛋白分子质量对数(1gM)的标准曲线。
制备蛋白饲料源小肽的工艺：
1.原料预处理
(1)原料的选择与粉碎：
选择新鲜优质的豆粕、玉米蛋白粉、麦麸，使用粉碎机粉碎后过40目的筛子，称量后按比例进行混匀，混合比例按美国NRC营养标准中赖氨酸、蛋氨酸理论含量值并根据奶牛赖氨酸和蛋氨酸营养需要比例(100.00∶48.70)确定豆粕∶玉米蛋白粉∶麸皮＝15∶4∶1。
(2)浸提：
称取一定量混合物按5％蛋白质浓度与去离子水(50℃)混合，搅拌均匀，应用饱和Ca(OH)2调节pH为7.7，经封装置于55℃空气浴振荡器中，频率100r/min，萃取反应60min。
(3)灭菌：
浸提后溶液经121℃高温湿热灭菌15min，杀灭病原菌，钝化脂肪氧化酶和脲酶等成分。
2.乳酸菌发酵：
将菌种解冻复活，在种子培养基上接种，培养14h达对数生长期后接种至增殖培养基，接菌量5％(乳酸乳球菌3％、保加利亚乳杆菌2％)，培养时间8h；当灭菌后蛋白浸提液温度降至40℃进行接菌，接菌量10％，温度37.5℃，湿度70％，恒温发酵36h。
3.热处理
发酵后混合液经90℃、10min的热处理，杀灭微生物发酵菌群，并使蛋白质适度变性。
4.酶解
(1)加酶水解：
经热处理后的发酵液通过测定发酵液中蛋白质的含量配制成5％蛋白质浓度溶液，用4mol/L的NaOH调节pH值8.5，置于恒温水浴中，温度40℃，胰蛋白酶的用量按蛋白底物浓度比0.6％，胰酶1.5％，酶解4.5h，小肽得率65％，水解度29.1％。酶解过程中pH值应保持在6.5～7.0的范围内，出现异常时，用HCL及Ca(OH)2进行调解。
(2)酶失活处理：
将酶水解液加热到80～85℃，恒温保持5min，使酶失活。
5.产品的干燥：
采用DZF-6030B型真空干燥箱在55℃进行真空浓缩至浓度30％～40％；浓缩后喷入真空罐，经83-85℃真空状态下瞬时蒸发出水分、喷粉，获得小肽产品。
6.实验结果分析
(1)原料的预处理
试验材料进行适度粉碎处理破坏蛋白由于存在大量二硫键的致密、立体结构，使其成为松散、柔软的伸展状，增大表面积，以提高蛋白溶出率和发酵酶解效果。经粉碎混匀后以氮溶解指数为指标，通过单因素分析和正交实验对浸提温度、pH值、蛋白浓度、时间进行工艺优化，获得最佳预处理条件(浸提温度55℃，溶液pH值7.7，5％的蛋白浓度，浸提60min)，可溶性氮占总氮含量的83.5％。
(2)乳酸菌发酵
经增殖培养后接种至灭菌后蛋白饲料浸提液，以蛋白质、赖氨酸和蛋氨酸含量为指标，通过单因素分析和正交实验对温度、pH值、接种量、浓度、时间优化，在灭菌后蛋白饲料浸提液经温度37.5℃、pH值7.3、接种量10％、5％蛋白质浓度、培养32h条件下发酵，蛋白质含量由最初44.3％增殖至55％。
(3)蛋氨酸含量测定
按检测方法中相应方法测定，获得蛋氨酸标准曲线(图1)，根据曲线求得不同发酵时间样品蛋氨酸含量(见图2)，发酵36h蛋氨酸含量最高，达2.51％，之后随着发酵的进行明显降低。
(4)赖氨酸含量测定
按检测方法中测定，获得赖氨酸标准曲线(见图3)，并求得不同时间样品中赖氨酸含量的变化曲线(图4)，发酵32h含量最高，达到5.17％，并随着发酵时间的进行，含量变化趋于平稳，略有下降。
(5)酶解条件
胰蛋白酶和胰酶复合酶解，以酸溶性蛋白(TCA-NSI)含量为指标，根据单因素分析和正交实验，确定本实验条件下最佳酶解物理参数：温度40℃、pH值8.5、胰蛋白酶-底物浓度比0.6％、胰酶-底物浓度比1.5％、底物浓度8％。根据Sephadex G-15柱层析水解液峰值的变化，随着水解的进行，游离氨基酸含量不断增加，而小肽含量变化比较微弱，综合考虑，经酶解4.5h，水解度29.1％，平均链长度3.44时，酶解效果最好。
(6)小肽平均链长度(PCL)
蛋白质水解度按检测方法中水解度测定方法以不同浓度完全水解蛋白为标准溶液进行测定，获得标准工作曲线Y＝0.0005X-0.0844，R2＝0.9997。取2g处理后不同酶解时间样品测定水解度，从标准工作曲线上查得蛋白质含量，并求出水解度及估算出平均肽链长度
(7)分子质量测定
按检测方法中测定各标准品出峰时间：牛血清白蛋白50.17min，溶菌酶62.69min，杆菌肽71.308min，氧化型谷胱甘肽88.142min，还原型谷胱甘肽102.39min，酪氨酸115.2min，绘制其与标准蛋白分子质量对数(1gM)的标准曲线如图6，获得回归方程Y＝-0.0206X+4.6178，R2＝0.9981，线性关系很好，可以根据此回归方程计算小肽水解液的分子质量。
取不同酶解时间的水解液经Sephadex G-15凝胶过滤分离结果见图7，酶解液有4个明显的洗脱峰，第1峰的出峰时间为61.24，为柱前锋，第2、3两个峰的出峰时间分别是84.23、99.157，根据回归方程计算两个峰的分子量分别为763.59Da、375.98Da，峰4出峰时间是162.345，根据酪氨酸的出峰时间和不同酶解时间图谱分析判定是混合氨基酸，在280nm紫外光下不成线性相关。应用部分收集器收集多肽洗脱峰，经凯式定氮测定，第2、3、4含氮占总可溶性氮的77.84％，说明经酶解后小肽分子质量主要集中在300～800Da之间。

Claims (1)

1.一种乳酸菌混菌发酵结合酶解法生产蛋白饲料源小肽工艺，其特征在于：工艺流程如下：
(1)原料预处理：
步骤一：选择新鲜优质的豆粕、玉米蛋白粉、麦麸，使用粉碎机粉碎后过40目的筛子，称量后按比例进行混匀，混合比例按美国NRC营养标准中赖氨酸、蛋氨酸理论含量值并根据奶牛赖氨酸和蛋氨酸营养需要比例(100.00∶48.70)确定豆粕∶玉米蛋白粉∶麸皮＝15∶4∶1；
步骤二：称取一定量混合物，按5％蛋白质浓度与50℃去离子水混合，搅拌均匀，应用饱和Ca(OH)2调节pH为7.7，经封装置于55℃空气浴振荡器中，频率100r/min，萃取反应60min；
步骤三：浸提后溶液经121℃高温湿热灭菌15min，杀灭病原菌，钝化脂肪氧化酶和脲酶等成分；
(2)乳酸菌发酵：将菌种解冻复活，在种子培养基上接种，培养14h达对数生长期后接种至增殖培养基，接菌量5％：其中乳酸乳球菌3％、保加利亚乳杆菌2％，培养时间8h；当灭菌后蛋白浸提液温度降至40℃进行接菌，接菌量10％，温度37.5℃，湿度70％，恒温发酵36h；
(3)热处理：发酵后混合液经90℃、10min的热处理，杀灭微生物发酵菌群，并使蛋白质适度变性；
(4)酶解：
加酶水解：经热处理后的发酵液通过测定发酵液中蛋白质的含量配制成5％蛋白质浓度溶液，用4mol/L的NaOH调节pH值8.5，置于恒温水浴中，温度40℃，胰蛋白酶的用量按蛋白底物浓度比0.6％，胰酶1.5％，酶解4.5h，小肽得率65％，水解度29.1％，酶解过程中pH值应保持在6.5～7.0的范围内，出现异常时，用HCL及Ca(OH)2进行调解；酶失活处理：将酶水解液加热到80～85℃，恒温保持5min，使酶失活；
(5)产品的干燥：采用DZF-6030B型真空干燥箱在55℃进行真空浓缩至浓度30％～40％，后经FD-1B-55型真空冷冻干燥机干燥，获得小肽产品。
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