CN110408568A - 一株高产蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其发酵产酶方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高产蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其发酵产酶方法。本发明提供的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)GZ73，简称为地衣芽孢杆菌GZ73，保藏编号为CGMCC No.18048。本发明还保护地衣芽孢杆菌GZ73在生产蛋白酶中的应用。通过发酵地衣芽孢杆菌GZ73制备蛋白酶，发酵产酶效率高，原料成本低，发酵液酶活力高、酶提取纯化工艺收率高、总生产成本较低。本发明提供的酶制剂可广泛应用于饲料、食品、洗涤剂等工业行业。

Description

一株高产蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其发酵产酶方法
技术领域
本发明属于酶制剂生物工程领域，涉及一株高产蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其发酵产酶方法。
背景技术
豆粕是最重要的饲料蛋白质原料，我国每年的用量约7000万吨。但是豆粕中含有多种抗营养的蛋白质。根据中国农科院饲料所和中国农大饲料工业中心对市售的342批次豆粕中抗营养因子(ANFs)(包括大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子)含量进行分析测定的结果表明，豆粕中ANFs含量比较膨化大豆高50％-300％，严重影响豆粕的正常消化吸收和利用。在无特定病原菌情况下，因为饲料主要原料大豆粕存在高含量的抗营养因子(包括胰蛋白酶抑制因子、大豆抗原蛋白、大豆凝集素)，可以导致幼畜发生群发性消化不良及腹泻，严重危害畜禽健康养殖。豆粕中的抗营养因子，严重降低玉米豆粕日粮的饲料利用率。
大豆抗原蛋白可以导致仔猪、犊牛肠道过敏反应，引起肠道损伤，是腹泻的原发性病因，继发性导致大肠杆菌等在肠道的增殖和附着，最终导致仔猪下痢和肠炎，这一理论已被许多试验所证实。Kenworthy报道，仔猪腹泻最初几天，典型的损伤是肠绒毛严重萎缩，酶水平下降，养分吸收率下降，但微生物检查并未发现大肠杆菌的增殖。谁仕彦和李德发的研究认为，仔猪断奶后第8d肠道中致病性大肠杆菌与血清抗大豆glycinin和β-conglycinin抗体效价成正比，仔猪腹泻的元凶是机体对日粮抗原发生的过敏反应。
饲料中的部分抗原蛋白会穿过小肠上皮细胞间隙或空隙完整进入血液和淋巴，刺激肠道免疫组织，产生包括特异性抗原抗体反应和T淋巴细胞介导的迟发性过敏反应，前者刺激肥大细胞释放组胺，引起上皮细胞通透性增加和黏膜水肿，后者引起肠道形态变化。过敏反应将使幼龄动物血清中大豆抗原特异性抗体滴度升高，小肠绒毛萎缩，隐窝细胞增生，同时导致消化吸收障碍、生长受阻以及过敏性腹泻。谯仕彦等研究发现膨化加工可降低仔猪血清中抗大豆球蛋白的抗体效价。
微生物蛋白酶可以消除日粮致敏原等抗营养因子，包括热处理后豆粕中残留的胰蛋白酶抑制因子、植物凝集素、抗原蛋白等。发酵豆粕本质上也是利用微生物生长发酵产生的酶消解致敏原。应用蛋白酶，一方面能有效消除饲料中抗营养因子的作用，全面促进养分的分解和吸收利用，提高饲料转化效率和营养价值，另一方面有利于减少畜禽粪便中有机物、氮和磷的排出量,从而减少排泄物对土壤和水源的污染。产蛋白酶微生物也可以应用于微生物肥料的生产，生产氨基酸供应植物生长发育。微生物进入植物根系，可以成为益生内生菌，促进植物生长。
屠宰副产物有禽类羽毛和动物皮毛，主要成分为角蛋白。角蛋白可分为α-角蛋白和β-角蛋白。α-角蛋白通常存在于头发、羊毛、角质、指甲等；β-角蛋白更坚硬，通常存在于鸟类的羽毛、嘴和爪。角蛋白富含大量的营养物质，如羽毛中粗蛋白含量基本在80％以上，角蛋白中胱氨酸、赖氨酸、脯氨酸和丝氨酸等多种氨基酸的含量可达70％，是一种具有潜在价值的蛋白质。但角蛋白因为含有二硫键在动物消化道中不能降解，体外也难被降解，传统的物理化学处理技术耗能高，加工工艺产生的废液废气污染环境。我国每年200万t的羽毛废弃物未被充分利用，造成资源浪费。产生角蛋白酶的微生物可以降解利用羽毛角蛋白。
研究发现，羽毛粉经角蛋白酶或蛋白分解菌处理后，粗蛋白含量可达85％～90％，同时也得到了高含量的胱氨酸，胱氨酸在饲粮中可作为良好的蛋氨酸补充剂。角蛋白酶具有非特异性，不仅可以分解角蛋白，还可以不同程度地分解其他蛋白质和多种多肽，如血红蛋白、明胶和卵蛋白等，甚至对一些胶原蛋白和弹性蛋白等不可溶性蛋白的水解能力高于其对应的蛋白酶。因此，在动物饲料中添加相应角蛋白酶可以把饲料中难分解的蛋白质水解成多肽或氨基酸，提高动物对营养物质的消化率和吸收率，合理利用羽毛资源。
研究发现微生物蛋白酶可提高幼龄和青年动物对饲料中蛋白成分的消化吸收率，预防腹泻，促进生长。Yu等发现，在玉米-豆粕型日粮中添加蛋白酶，具有提高饲料转化率的功能。Angle等发现补充外源蛋白酶，可以改善低蛋白日粮饲料转化效率，节约豆粕用量。蛋白酶对幼龄动物有着独特的作用，能够为养殖产业带来新效益。
选育微生物蛋白酶高产菌种，提高酶产量，降低生产成本，对饲料酶制剂工业和饲料工业均有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其发酵产酶方法。
本发明提供的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)GZ73，简称为地衣芽孢杆菌GZ73，已于2019年6月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.18048。
本发明还保护地衣芽孢杆菌GZ73在生产蛋白酶中的应用。
本发明还保护一种制备地衣芽孢杆菌GZ73的发酵产物的方法，包括如下步骤：将地衣芽孢杆菌GZ73进行发酵。发酵产物可为发酵完成后的整个发酵体系。发酵产物也可为发酵完成后收集的发酵上清。
所述发酵中，采用的发酵培养基的制备原料为酵母粉、玉米粉、豆粕粉、玉米浆、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸镁、柠檬酸钠、中温淀粉酶、高温淀粉酶和水；每升发酵培养基中，酵母粉的加入量为8-10g、玉米粉的加入量为110-130g、豆粕粉的加入量为20-30g、玉米浆的加入量为8-12g、氯化钙的加入量为3-5g、磷酸二氢钾的加入量为10-14g、硫酸镁的加入量为0.6-1.0g、柠檬酸钠的加入量为3-5g；玉米粉、中温淀粉酶、高温淀粉酶的配比为1g玉米粉：2-4U中温淀粉酶：20-40U高温淀粉酶。
每升发酵培养基中，酵母粉的加入量为9g、玉米粉的加入量为120g、豆粕粉的加入量为25g、玉米浆的加入量为10g、氯化钙的加入量为4g、磷酸二氢钾的加入量为12g、硫酸镁的加入量为0.8g、柠檬酸钠的加入量为4g；玉米粉、中温淀粉酶、高温淀粉酶的配比为1g玉米粉：3U中温淀粉酶：30U高温淀粉酶。
所述发酵培养基的pH为7.0-8.0。
所述发酵培养基的制备方法为：将水、玉米粉、豆粕粉混合，然后加入中温淀粉酶与高温淀粉酶，然后边搅拌边升温至68-72℃并保温，然后边搅拌边升温至88-92℃并保温，然后加入其它原料并搅拌均匀。
所述发酵培养基的制备方法为：将水、玉米粉、豆粕粉混合，调pH值为6.0，然后加入中温淀粉酶与高温淀粉酶，然后边搅拌边升温至70℃并保温30min，然后边搅拌边升温至90℃并保温20min，然后加入其它原料并搅拌均匀，调pH值为7.0-8.0。
所述发酵中，采用的补料培养基的制备原料为麦芽糊精、豆粕水解液和水；每升补料培养基中，麦芽糊精的加入量为30-50g、豆粕水解液的加入量为3-5g；豆粕水解液的加入量以制备豆粕水解液时加入的豆粕质量计。
所述补料培养基的pH为7.0-8.0。
每升补料培养基中，麦芽糊精的加入量为40g、豆粕水解液的加入量为4g。
豆粕水解液的制备原料为：1质量份豆粕粉、6质量份水和0.06-0.07质量份石灰。
豆粕水解液的制备方法为：将豆粕粉与水混匀，然后加入石灰，搅拌均匀，120℃静置反应1h，自然冷却至室温。
所述方法中，将种子液接种至发酵培养基，然后进行发酵。
种子液与发酵培养基的体积配比可为5-10:100。种子液与发酵培养基的体积配比具体可为8:100。所述种子液的菌浓度为108-1010cfu/ml。所述种子液的菌浓度具体可为109cfu/ml。
发酵初始时刻，地衣芽孢杆菌GZ73在体系中的浓度可为107cfu/ml。
所述发酵的条件可为：33-35℃、190-200rpm振荡培养45小时。
所述发酵的条件可为：34℃、200rpm振荡培养45小时。
所述发酵的发酵过程参数为：温度34℃，发酵罐转速200-800rpm，通风量为1-3倍发酵体系体积，罐压为0.05MPa，溶解氧为15-25％，pH为6.5-7.0；发酵过程中，当发酵体系中的还原糖浓度低于2mg/ml时流加补料培养基，从而控制发酵体系的还原糖浓度为2mg/ml-5mg/ml。
所述发酵的发酵过程参数为：温度34℃、发酵罐转速200-800rpm，通风量为1-3倍发酵体系体积，罐压为0.05MPa；发酵过程中，通过调整转速及通风量，控制溶解氧为15-25％；发酵过程中，当发酵体系中的还原糖浓度低于2mg/ml时流加补料培养基，从而控制发酵体系的还原糖浓度为2mg/ml-5mg/ml；发酵过程中，采用浓氨水或稀磷酸控制发酵体系的pH为6.5-7.0。
所述发酵的时间可为80-100小时，例如96小时。
体系中，芽孢数量占总菌数量达到70％以上时结束发酵。
以上任一所述方法制备得到的发酵产物均属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种蛋白酶溶液；是将发酵产物依次进行絮凝、压滤和超滤膜浓缩得到的。蛋白酶溶液的制备原料为：发酵产物、助凝剂和絮凝剂；发酵产物、助凝剂、絮凝剂的配比为1L发酵产物：0.08-0.1g助凝剂：0.06-0.08g絮凝剂。发酵产物、助凝剂、絮凝剂的配比具体为1L发酵产物：0.1g助凝剂：0.08g絮凝剂。所述蛋白酶溶液的制备方法：在发酵产物中加入助凝剂，然后加入絮凝剂，然后进行压滤，然后用20000道尔顿分子量超滤膜进行超滤浓缩,得到浓缩液，即为蛋白酶溶液；每升发酵产物得到300-900ml蛋白酶溶液。所述蛋白酶溶液的制备方法：在发酵产物中加入助凝剂，搅拌，调pH至7.0，然加入絮凝剂，然后输入板框压滤机进行压滤(加压至0.3MPa)，然后用20000道尔顿分子量超滤膜进行超滤浓缩,得到浓缩液，即为蛋白酶溶液；每升发酵产物得到300-900ml蛋白酶溶液。助凝剂具体可为聚合氯化铝。絮凝剂具体可为阴离子型聚丙烯酰胺。
本发明还保护一种液态酶制剂；液态酶制剂的制备原料为：蛋白酶溶液、稳定剂和防腐剂；蛋白酶溶液、稳定剂和防腐剂的配比为100ml蛋白酶溶液：15-25g稳定剂：0.4-0.5g防腐剂。蛋白酶溶液、稳定剂和防腐剂的配比具体可为100ml蛋白酶溶液：20g稳定剂：0.45g防腐剂。所述液态酶制剂的制备方法为：在蛋白酶溶液中加入稳定剂、防腐剂，过滤除菌，收集滤液，即为液态酶制剂。所述液态酶制剂的制备方法为：在蛋白酶溶液中加入稳定剂、防腐剂，调pH至7.5，然后用0.45μm孔径的滤膜进行过滤除菌，收集滤液，即为液态酶制剂。稳定剂具体为甘油。防腐剂具体由1质量份山梨酸钾和2质量份苯甲酸钠混合得到。
本发明还保护一种固态酶制剂；是将液态酶制剂进行喷雾干燥得到的。所述固态酶制剂的制备参数为：干燥塔高度为15米，直径为2.2米，蒸发量为200kg/小时，压力式喷嘴；进风为150℃，风量为4500m3/h，操作压力为3.8Mpa，喷片直径为1.3mm。
本发明还保护以上任一所述发酵产物、以上任一所述蛋白酶溶液、以上任一所述液态酶制剂或以上任一所述固态酶制剂作为饲料添加剂的应用。
本发明还保护以上任一所述发酵产物、以上任一所述蛋白酶溶液、以上任一所述液态酶制剂或以上任一所述固态酶制剂作为蛋白酶的应用。所述蛋白酶作用的底物为酪蛋白。所述蛋白酶作用的底物为豆粕提取蛋白。
通过发酵地衣芽孢杆菌GZ73制备蛋白酶，发酵产酶效率高，原料成本低，发酵液酶活力高、酶提取纯化工艺收率高、总生产成本较低。本发明提供的酶制剂可广泛应用于饲料、食品、洗涤剂等工业行业。
附图说明
图1为地衣芽孢杆菌GZ73的照片。
图2为各个发酵时间点的发酵上清的蛋白酶酶活。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
酵母粉：北京泽平科技有限责任公司，LP0021B。麦芽糊精：北京索莱宝科技有限公司，M8450。蛋白胨：北京京哲永兴生物技术有限责任公司，CP8311。玉米浆：北京涛恒科技有限公司，C116026。石灰：北京百灵威科技有限公司，J01-38835。中温淀粉酶：山东隆科特酶制剂有限公司，3000u/g。高温淀粉酶：山东隆科特酶制剂有限公司，30000u/g。聚合氯化铝：山东德州瑞星净水原料有限公司。阴离子型聚丙烯酰胺：山东德州瑞星净水原料有限公司。
实施例1、地衣芽孢杆菌GZ73的获得、鉴定和保藏
从羽毛废物的高温发酵产物中分离野生菌，然后进行反复的紫外诱变及亚硝基胍诱变，然后筛选获得一株菌株，将其命名为菌株GZ73。
菌株GZ73的形态特征：在LB固体培养基上形成白色菌落，呈圆形半透明状，质地光滑，边缘呈锯齿状；显微镜镜检菌株呈细杆状，宽0.5-2.0μm，长1.0-9.0μm。
菌株GZ73的生理生化特征：接触酶阳性，生长NaCl 2％-7％阳性，苯丙氨酸脱氨阴性，利用柠檬酸盐大部阳性，卵磷脂酶阴性，酪蛋白水解阳性，淀粉水解阳性，甲基红实验阴性，葡萄糖产酸阳性，葡萄糖产气阴性，发酵木糖阳性，发酵甘露醇阳性，发酵阿拉伯糖阳性，V-P测定阳性，硝酸盐还原阳性，明胶水解阳性。
菌株GZ73的16S rRNA的编码序列如序列表的序列1所示。
根据以上鉴定结果，菌株GZ73属于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，因此又称为地衣芽孢杆菌GZ73。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)GZ73，简称为地衣芽孢杆菌GZ73，已于2019年6月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.18048。
地衣芽孢杆菌GZ73产蛋白酶的pH活性范围为6.0-11.0、最适pH范围为7.5-8.5，最适作用温度范围为60℃-65℃。地衣芽孢杆菌GZ73接种至LB培养基平板，33℃-35℃静置培养24h，结晶紫染色的显微镜镜检结果见图1。地衣芽孢杆菌GZ73接种至酪素培养基平板，培养后，菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。地衣芽孢杆菌GZ73的特性是产蛋白酶效率高，稳定性好。
地衣芽孢杆菌GZ73生产的蛋白酶对大豆蛋白、酪蛋白、植物性蛋白等各类蛋白质有很强的酶解活性，可以有效减少抗营养因子的影响。
实施例2、地衣芽孢杆菌GZ73的稳定性
地衣芽孢杆菌GZ73采用固体LB培养基平板进行多次传代，将第一次传代得到的菌株命名为F1代菌株，将第二次传代得到的菌株命名为F2代菌株，将第三次传代得到的菌株命名为F3代菌株，将第四次传代得到的菌株命名为F4代菌株，将第五次传代得到的菌株命名为F5代菌株，将第六次传代得到的菌株命名为F6代菌株。
供试菌株为：F1代菌株、F2代菌株、F3代菌株、F4代菌株、F5代菌株或F6代菌株。
供试菌株接种至种子培养基(种子培养基同实施例3)，34℃、200rpm振荡培养15小时，得到种子液。将种子液接种至发酵培养基(发酵培养基同实施例3)(初始时刻，供试菌在体系中的浓度为107cfu/ml)，34℃、200rpm振荡培养45小时，收集发酵上清。检测发酵上清的蛋白酶酶活力。
结果见表1。各代菌株的发酵上清的蛋白酶酶活均为28000U/ml以上。
表1
蛋白酶酶活力(U/ml) 相对酶活(％)
F1代菌株 28354 100
F2代菌株 28473 100.4
F3代菌株 28914 101.9
F4代菌株 29147 102.8
F5代菌株 28157 99.3
F6代菌株 28642 101.0
实施例3、地衣芽孢杆菌GZ73生产蛋白酶的能力
一、培养基的制备
固体培养基：酵母粉4g/L、蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、牛肉膏5g/L、磷酸二氢钾10g/L、琼脂15g/L，余量为水；pH7.0-8.0；121℃灭菌30min。
种子培养基：酵母粉8g/L、麦芽糊精120g/L、蛋白胨4g/L、玉米浆50g/L、磷酸二氢钾11g/L、硫酸镁0.8g/L，余量为水；pH7.0-8.0；121℃灭菌30min。
发酵培养基：酵母粉9g/L、玉米粉120g/L、豆粕粉25g/L、玉米浆10g/L、氯化钙4g/L、磷酸二氢钾12g/L、硫酸镁0.8g/L、柠檬酸钠4g/L、中温淀粉酶、高温淀粉酶，余量为水；pH7.0-8.0。发酵培养基的制备方法：将水、玉米粉、豆粕粉投入配料罐中，调pH值为6.0，然后加入中温淀粉酶(每g玉米粉配比3U中温淀粉酶)与高温淀粉酶(每g玉米粉配比30U高温淀粉酶)，然后边搅拌边升温至70℃并保温30min，然后边搅拌边缓慢升温至90℃并保温20min，然后加入其它原料并搅拌均匀，调pH值为7.0-8.0，最后121℃灭菌30min。
补料培养基：麦芽糊精40g/100ml，豆粕水解液4g/100ml(以制备豆粕水解液时加入的豆粕质量计)，余量为水；pH7.0-8.0；121℃灭菌30min。豆粕水解液的制备方法：将1质量份豆粕粉与6质量份水混匀，然后加入0.06质量份石灰，搅拌均匀，120℃静置反应1h，自然冷却至室温。
二、菌株的发酵
1、挑取一环地衣芽孢杆菌GZ73，接种于固体培养基平板，34℃静置培养14h，得到平板菌种。
2、取一环平板菌种，接种至装有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，34℃、200rpm振荡培养15h。
3、将步骤2得到的种子液以9:100的体积配比接种至种子培养基，培养至菌浓度为109cfu/ml。
4、将步骤3得到的种子液以9:100的体积配比接种至种子培养基，培养至菌浓度为109cfu/ml。
5、将步骤4得到的种子液接种至装有发酵培养基的发酵罐(种子液与发酵培养基的体积配比为8:100)，进行发酵。
发酵过程中，温度为34℃、转速为200-800rpm，通风量为1-3倍发酵体系体积，罐压为0.05MPa。发酵过程中，通过调整转速及通风量，控制溶解氧为15-25％。发酵过程中，当发酵体系中的还原糖浓度低于2mg/ml时流加补料培养基，从而通过补料培养基控制发酵体系的还原糖浓度为2mg/ml-5mg/ml。发酵过程中，采用浓氨水或稀磷酸控制发酵体系的pH为6.5-7.0。发酵72小时后，每隔1小时取样发酵体系，通过显微镜镜检计数芽孢数量，发酵96小时时芽孢数量占总菌数量达到70％以上，因此结束发酵。
发酵过程中，每12小时取样，离心(4℃,5000rpm,10min)，获得发酵上清。
三、发酵上清的蛋白酶酶活
检测步骤二得到的各个发酵时间点的发酵上清的蛋白酶酶活。结果见图2。发酵96小时(发酵结束时)，发酵上清的蛋白酶酶活为30387U/ml。
实施例4、制备蛋白酶制剂
1、制备蛋白酶溶液
实施例3中发酵结束后，在发酵体系中加入助凝剂，充分搅拌，调pH至7.0，然后加入絮凝剂，然后输入板框压滤机进行压滤(加压至0.3MPa)，然后用20000道尔顿分子量超滤膜进行超滤浓缩,得到浓缩液，即为蛋白酶溶液。
发酵体系、助凝剂、絮凝剂的配比为：1L发酵体系：0.1g助凝剂：0.08g絮凝剂。
助凝剂为聚合氯化铝(助凝剂量以聚合氯化铝纯品计)。
絮凝剂为阴离子型聚丙烯酰胺(絮凝剂量以阴离子型聚丙烯酰胺纯品计)。
每升发酵体系得到300ml蛋白酶溶液。
2、制备液态酶制剂
在100mL蛋白酶溶液中加入20g稳定剂、0.45g防腐剂，调pH至7.5，然后用0.45μm孔径的滤膜进行过滤除菌，收集滤液，即为液态蛋白酶制剂。稳定剂采用甘油。防腐剂由1质量份山梨酸钾和2质量份苯甲酸钠混合得到。
检测液态酶制剂的蛋白酶酶活，为52587U/ml。
3、制备固态酶制剂
取步骤2制备的液态酶制剂，采用喷雾干燥方法生产固态酶制剂。干燥塔高度为15米，直径为2.2米，蒸发量为200kg/小时，压力式喷嘴。进风为150℃，风量为4500m3/h，操作压力为3.8Mpa，喷片直径为1.3mm，每小时可生产干品18kg。
检测固态酶制剂的蛋白酶酶活，为100165U/g。
制备固态酶制剂的收率＝(作为原料的液态酶制剂的酶活*作为原料的液态酶制剂的体积)÷(作为产物的固态酶制剂的酶活*作为产物的固态酶制剂的质量)。作为原料的液态酶制剂的酶活的单位为U/ml，作为原料的液态酶制剂的体积的单位为ml。作为产物的固态酶制剂的酶活的单位为U/g,作为产物的固态酶制剂的质量的单位为g。制备固态酶制剂的收率为85％。
干燥失重＝(W1-W2)/W1*100％；W1为干燥前的样品重量，W2为干燥后的样品重量。干燥失重为5％。
取固态酶制剂以及高温处理后的固态酶制剂，检测蛋白酶酶活。活性保留率＝高温处理后的固态酶制剂的蛋白酶酶活÷未经任何处理的固态酶制剂的蛋白酶酶活*100％。活性保留率为67.3％。
实施例5、地衣芽孢杆菌GZ73制备的蛋白酶对豆粕提取蛋白的降解能力
蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。本实施例用豆粕提取蛋白为底物，测定地衣芽孢杆菌GZ73的发酵上清水解肽键的活力。豆粕粗提取蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，可计算酶的活力。
一、豆粕提取蛋白的制备
1、100g大豆粕，加入1L水，调pH至8，然后40℃搅拌25min，然后3100g离心20min，分别收集上清液和沉淀。
2、取步骤1得到的沉淀，加入0.1L水，调pH至8.4，然后40℃搅拌25min，然后3100g离心20min，收集上清液。
3、将步骤1得到的上清液和步骤2得到的上清液合并，然后调pH至4.5，30rpm搅拌5min，然后3100g离心5min，收集沉淀。
4、取步骤3得到的沉淀，用水洗涤(洗涤后通过3100g离心5min收集沉淀)。
5、取步骤4得到的沉淀，调pH至7，然后冷冻干燥，产物即为豆粕提取蛋白。
二、酶活检测
豆粕提取蛋白用pH7.2的PBS缓冲液溶解，使其蛋白浓度为0.05g/100ml，即为0.05％豆粕提取蛋白溶液。
待测样品为实施例4中制备的固态酶制剂。待测样品用pH7.2的PBS缓冲液溶解，得到待测酶液。
1、将5％三氯乙酸水溶液和0.05％豆粕提取蛋白溶液在37℃下保温。
2、取四支15ml具塞试管，分别标上记号A1、A0、B1和B0。在A1和A0试管中各吸入0.20ml待测酶液，在B1和B0试管中各吸入0.40ml待测酶液，分别用pH7.2、0.2mol/L PBS缓冲液定容至2.00ml。在A0和B0试管中各吸入6.00ml 5％三氯乙酸水溶液，将上述四支试管都置于37℃水浴中保温10min。
3、在各试管中吸入2.00ml 0.05％豆粕提取蛋白溶液，在37℃下保温10min，再向A1和B1试管中各吸入6.00ml 5％三氯乙酸水溶液水溶液。
4、将试管从水浴中取出，在室温下放置1h，用少量上清液润湿滤纸后过滤，保留滤出液。
5、在280nm波长下，分别以A0和B0滤液为空白，测定A1和B1滤液的吸光度。
以每分钟增加0.001吸光度定义为一个酶单位(1U)。
每克酶制剂中酶活力的计算：X＝ΔA×1000/(t×w)
式中，ΔA——样品与空白吸光度差值(即A1和B1的吸光值)；t——酶作用时间(本实验为10min)；w——反应中酶的用量，g(g指的是固态酶制剂的质量)。
酶活结果(U/g)见表2。
表2
以上实施例2和实施例3和实施例4中，检测蛋白酶酶活的方法均为如下方法：
原理：蛋白酶在一定的温度和pH条件下，水解底物(如酪蛋白)产生含有酚基的氨基酸(如酪氨酸)，含有酚基的氨基酸在偏碱性条件下将福林试剂(Folin)还原生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与含有酚基的氨基酸的含量成正比。因此可以通过在680nm测定吸光度，得到含有酚基的氨基酸的产量，进而计算蛋白酶活力。
蛋白酶活力单位的定义：在一定温度(40℃±0.2℃)和pH8.0条件下，在1min内水解酪蛋白产生相当于1μg酚类化合物(由酪氨酸等同物表示)的酶量，为1个酶活单位，以1U表示。
(1)试剂的制备
稀福林试剂的制备方法：于2000mL磨口回流装置中加入Na2WO4·2H2O 100.0g、Na2MoO4·2H2O 25.0g、水700mL、85％磷酸水溶液50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，然后在通风厨中加入Li2SO4 50g、水50mL和数滴99％浓溴水，再微沸15min，冷却后加水定容至1000mL，混匀并过滤，即为Folin试剂，试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内；以1体积份Folin试剂与2体积份水混匀，得到稀福林试剂。
酪蛋白溶液的制备：称取酪蛋白1.000g，先用0.5mL 0.5mol/L氢氧化钠水溶液湿润，再加入pH8.0的硼酸钠-硼酸缓冲液80mL,边加热边搅拌直至完全溶解，冷却后，调整pH至8.0±0.05,用pH8.0的硼酸钠-硼酸缓冲液定容至100mL，得到酪蛋白溶液。制备过程中，采用0.1mol/L盐酸水溶液或0.5mol/L氢氧化钠水溶液调pH。使用前，酪蛋白溶液置于40℃±0.2℃恒温水浴中预热5min。酪蛋白：9000-71-9，国药集团化学试剂有限公司。
(2)绘制标准曲线
L-酪氨酸储备溶液：称取0.1000g L-酪氨酸标准品，用20mL 1mol/L盐酸水溶液溶解，然后用水定容至100mL，即为1mg/mL的L-酪氨酸储备溶液。
L-酪氨酸溶液：取10mL L-酪氨酸储备溶液，用0.1mol/L的盐酸水溶液定容至100mL，即为100μg/mL的L-酪氨酸溶液。
采用L-酪氨酸溶液和0.1mol/L的盐酸溶液制备各个L-酪氨酸工作液。工作液0即0.1mol/L的盐酸溶液。工作液1中L-酪氨酸浓度为10μg/mL。工作液2中L-酪氨酸浓度为20μg/mL。工作液3中L-酪氨酸浓度为30μg/mL。工作液4中L-酪氨酸浓度为40μg/mL。工作液5中L-酪氨酸浓度为50μg/mL。工作液6中L-酪氨酸浓度为60μg/mL。
取1.0mL L-酪氨酸工作液，加入5.0mL 0.4mol/L碳酸钠水溶液和1.0mL稀福林试剂，于具塞试管中震荡均匀，置于40℃±0.2℃水浴中显色20min，取出，置于冷水中迅速冷却至室温，采用10mm比色皿，在分光光度计波长680nm处测定其吸光度。每种浓度的工作液设置2个重复处理。以吸光度A为纵坐标，以L-酪氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线。利用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(μg)，即为吸光常数K值(K值应在95～105范围内)。
(3)检测待测溶液的蛋白酶酶活。
待测溶液：发酵上清、待测液态酶制剂、待测固态酶制剂用pH8.0的硼酸钠-硼酸缓冲液溶解的溶解物。
待测溶液用pH8.0的硼酸钠-硼酸缓冲液稀释后，作为供试溶液。
对照组：取供试溶液1.00mL，40℃±0.2℃孵育2min；然后加入0.4mol/L三氯乙酸水溶液2.00mL，40℃±0.2℃孵育10min；然后加入酪蛋白溶液1.00mL，室温静置孵育10min；然后采用定性滤纸过滤并收集滤液；取1.00mL滤液，加0.4mol/L碳酸钠水溶液5.0mL和稀福林试剂1.00mL，混匀，40℃±0.2℃显色20min，然后于680nm波长检测吸光度(10mm比色皿)。对照组用于调零。
试验组：取供试溶液1.00mL，40℃±0.2℃孵育2min；然后加入酪蛋白溶液1.00mL，40℃±0.2℃孵育10min；然后加入0.4mol/L三氯乙酸水溶液2.00mL，室温静置10min；然后采用定性滤纸过滤并收集滤液；取1.00mL滤液，加0.4mol/L碳酸钠水溶液5.0mL和稀福林试剂1.00mL，混匀，40℃±0.2℃显色20min，然后于680nm波长检测吸光度(10mm比色皿)。每种供试溶液设置三个平行处理。
根据吸光度值和标准曲线，计算得到供试溶液中的酪氨酸含量，再进一步计算得到供试溶液中含有的蛋白酶活力单位。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120> 一株高产蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其发酵产酶方法
<130> GNCYX190086
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1453
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 1
atcttggttc acttcggcgg ctggctccaa aaggttacct caccgacttc gggtgttaca 60
aactctcgtg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg 120
ctgatccgcg attactagcg attccagctt cacgcagtcg agttgcagac tgcgatccga 180
actgagaaca gatttgtggg attggcttag cctcgcggct tcgctgccct ttgttctgcc 240
cattgtagca cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac 300
cttcctccgg tttgtcaccg gcagtcacct tagagtgccc aactgaatgc tggcaactaa 360
gatcaagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac 420
aaccatgcac cacctgtcac tctgcccccg aaggggaagc cctatctcta gggttgtcag 480
aggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc 540
gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc 600
ggagtgctta atgcgtttgc tgcagcacta aagggcggaa accctctaac acttagcact 660
catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgcg 720
cctcagcgtc agttacagac cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct 780
acgcatttca ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gttccccagt 840
ttccaatgac cctccccggt tgagccgggg gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg 900
cgcgcgcttt acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg 960
ctggcacgta gttagccgtg gctttctggt taggtaccgt caaggtaccg ccctattcga 1020
acggtacttg ttcttcccta acaacagagt tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg 1080
cggcgttgct ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta 1140
ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca 1200
tcgtcgcctt ggtgagccgt tacctcacca actagctaat gcgccgcggg tccatctgta 1260
agtggtagct aaaagccacc ttttataatt gaaccatgcg gttcaatcaa gcatccggta 1320
ttagccccgg tttcccggag ttatcccagt cttacaggca ggttacccac gtgttactca 1380
cccgtccgcc gctgacctaa gggagcaagc tcccgtcggt ccgctcgact tgcatgtata 1440
gcacccgcca tgc 1453

Claims (10)

1.地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)GZ73，其保藏编号为CGMCC No.18048。
2.权利要求1所述地衣芽孢杆菌在生产蛋白酶中的应用。
3.一种制备权利要求1所述地衣芽孢杆菌的发酵产物的方法，包括如下步骤：将地衣芽孢杆菌GZ73进行发酵。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵中，采用的发酵培养基的制备原料为：酵母粉、玉米粉、豆粕粉、玉米浆、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸镁、柠檬酸钠、中温淀粉酶、高温淀粉酶和水；每升发酵培养基中，酵母粉的加入量为8-10g、玉米粉的加入量为110-130g、豆粕粉的加入量为20-30g、玉米浆的加入量为8-12g、氯化钙的加入量为3-5g、磷酸二氢钾的加入量为10-14g、硫酸镁的加入量为0.6-1.0g、柠檬酸钠的加入量为3-5g；玉米粉、中温淀粉酶、高温淀粉酶的配比为1g玉米粉：2-4U中温淀粉酶：20-40U高温淀粉酶。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵中，采用的补料培养基的制备原料为：麦芽糊精、豆粕水解液和水；每升补料培养基中，麦芽糊精的加入量为30-50g、豆粕水解液的加入量为3-5g；豆粕水解液的加入量以制备豆粕水解液时加入的豆粕质量计。
6.如权利要求3或4或5所述的方法，其特征在于：
所述发酵的发酵过程参数为：温度34℃，发酵罐转速200-800rpm，通风量为1-3倍发酵体系体积，罐压为0.05MPa，溶解氧为15-25％，pH为6.5-7.0；发酵过程中，当发酵体系中的还原糖浓度低于2mg/ml时流加补料培养基，从而控制发酵体系的还原糖浓度为2mg/ml-5mg/ml。
7.权利要求3至6中任一所述方法制备得到的发酵产物。
8.用权利要求7所述发酵产物制备得到的蛋白酶溶液或液态酶制剂或固态酶制剂。
9.权利要求7所述发酵产物或权利要求8所述蛋白酶溶液或权利要求8所述液态酶制剂或权利要求8所述固态酶制剂作为饲料添加剂的应用。
10.权利要求7所述发酵产物或权利要求8所述蛋白酶溶液或权利要求8所述液态酶制剂或权利要求8所述固态酶制剂作为蛋白酶的应用。
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