JPS60141289A - アルカリ・プロテア−ゼの製造方法 - Google Patents

アルカリ・プロテア−ゼの製造方法

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JPS60141289A
JPS60141289A JP58245459A JP24545983A JPS60141289A JP S60141289 A JPS60141289 A JP S60141289A JP 58245459 A JP58245459 A JP 58245459A JP 24545983 A JP24545983 A JP 24545983A JP S60141289 A JPS60141289 A JP S60141289A
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JP
Japan
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fermentation
bacterial
bacterial cell
medium
extract
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JP58245459A
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English (en)
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Ryozo Taniyasu
谷安 亮三
Hisashi Kunitachi
国立 久
Yoshihiro Watanabe
渡辺 良弘
Minoru Nishimura
西村 実
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Lion Corp
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Lion Corp
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  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアルカリ・プロテアーゼの発酵による製造方法
、さらに詳しくいえば、バチルス・リケニホルミス(B
acillus licheniformis ) A
TOO14580を用いてアルカリ°プロテアーゼを発
酵生産するに当り、発酵液の酵素活性全高め、かつ発酵
時間を短縮したアルカリ・プロテアーゼの製造方法に関
するものである。
従来、プロテアーゼは食品・水産物加工工業において、
大豆タンパクや魚肉の加水分解などに用いられており、
また皮革工業、醸造工業あるいは洗剤工業などの分野に
おいても広く用いられている。特に近年、衣料用洗剤に
おいては、環境汚染の而からリン酸塩の使用が規制され
るに伴い、洗浄力を高めるためにアルカリ・プロテアー
ゼが配合されてきた。このリン酸塩の規制はますます強
化される傾向にあるため、今後、アルカリ・プロテアー
ゼの需要は大きく拡大することが予想される。
ところで、バチリス・リケニホルミスATO01458
0はアルカリ・プロテアーゼ生産株としてよく知られて
いるが、この菌体を用いてアルカリ、プロテアーゼを工
業的に発酵生産する場合には、発酵液の酵素活性をでき
るだけ高めるとともに、発酵時間をできるだけ短縮する
ことが重要である。これは、酵素活性が高ければ、一定
量の酵素を生産する場合に発酵槽の容h1を小さくしう
るのみならず、菌体分離や酵素精製などの後工程におけ
る装置も小型化、及び発酵時間の短縮による装置容量当
シの生産性の向上が可能にな9、その結果として生産コ
ストを低減しうるためである。
しかしながら、従来の前記菌体を用いるアルカリ・プロ
テアーゼの工業的発酵生産法においては、発酵液の酵素
活性や発酵時間に関して工業的に実施する上で必ずしも
満足しうるものではなかった。
本発明者らは、このような事情に鑑み、バチルス・リケ
ニホルミスATO014580を用いてアルカリ・プロ
テアーゼを発酵生産するに当り、発酵液の酵素活性を高
め、かつ発酵時間を短縮する方法について鋭意研究を重
ねた結果、特定の炭素源及び窒素源を所定hV添加した
栄養培地中で、温度及びPHを所定の条件に設定して前
記菌体を培養することにより、その目的を達成しうるこ
とを見出しその知見に基づいて本発明を完成するに至っ
た。
すなわち、本発明は、バチルス・リケニホルミスATO
C14580”a’用いてアルカリ°プロテアーゼを発
酵生産するに当シ、炭素源として培地11当リラクトー
ス60〜aoyを、窒素源として培地1/2当り大豆カ
ゼイン10〜25.j7と、酵母エキス5〜20g又は
前記菌体エキス若しくはその両方とを添加した栄養培地
中で、温度35〜38°C及びPH6,5〜7.0の条
件下で前記菌体を培養することを特徴とするアルカリ・
プロテアーゼの発酵製造法を提供するものである。
本発明方法に用いるバチルス・リケニホルミスATCO
14851]は、アルカリ”プロテアーゼ生産に対する
炭素源の要求特異性が極めて強い。本発明者らは炭素源
としてラフ)−ス、ガラクトース、グルコース、フラク
トース、シュークロス、マルトース、デキストリン、廃
糖蜜、デンプンなどについて検討したところ、グルコー
ス、フラクトース、シュークロース、マルトース、テキ
ストリン、廃糖蜜及びデンプンにおいては、菌体濃度は
ラクトースと同等以上、特にシュークロースでは約2倍
に達するものの、酵素活性はほとんど認められず、ラク
トース及びガラクトースのみにおいて、効率よくアルカ
リ・プロテアーゼが生産されることが分った。しかしな
がら、ラクトースとガラクトースとを比較した場合、ラ
クトースの方が約2倍の酵素活性を示すことから、本発
明方法においては、最適炭素源としてラクトースが用い
られる。
このラクトースの添加量は培地iz当り60〜80g、
好ましくは50〜80gの範囲である。
この量が30.9未満では酵素活性が低く、また80.
9を超えると菌体の基質用害が生じ、その増殖が著しく
抑制される。
本発明方法において用いる窒素源は、大豆カゼインと、
酵母エキス又は前記菌体の発酵後分離した菌体エキス又
はその両方を組み合わせたもので、ある。このように、
大豆カゼインを用いることにより、他の窒素源、例えば
ペプトン、コーンステイープリカー、酵母エキス、硫安
、尿素などを用いた場合に比べて、酵素活性が最大にな
るまでの時間(発酵時間)が短縮される。しかしながら
、この大豆カゼインにおいては酵素活性がペプトンやコ
ーンステイープリカーなどに比較して若干低いという問
題があるが、この大豆カゼインに、他の窒素源として、
酵苛エキス又は前記菌体の発酵後分離した菌体エキス若
しくはその両方を組み合わせることにより、相乗効果が
発揮されて、大豆カゼイン単独系に比べて、発酵時間を
変えずに酵素活性を約165〜1.7倍向上させること
ができへこれは、大豆カゼイン単独系においては菌体濃
度が低く、前記窒素源を加えることにょシ、菌体濃度が
約1.3〜1.7倍となり、しかも菌体1個当シのアル
カリ°プロテアーゼ生産能が大豆カゼイン単独系と同等
か、又は若干大きくなるためと考えられる。
本発明方法においては、大豆カゼインの添加量は、培地
11当り10〜25gの範囲であり、10g未満では菌
体濃度が低くて酵素活性も低く、また25.9を超える
と菌の増殖が著しく阻害される。
酵母エキスの添加量は培地11当り5〜2011好まし
くは5〜io、!7の範囲であり、5g未満では大豆カ
ゼイン単独系に比して顕著な菌体濃度の上昇が認められ
ず、また20.9を超えると菌体濃度が著しく高くなっ
て、栄養分は菌体増殖に多く消費され、アルカリ・プロ
テアーゼ生産が抑制される。
前記菌体エキスは、例えば分離した該菌体(湿潤状態)
を10倍量の水で1〜2回洗浄したのち、これに卵白又
はリゾチームを添加してかきまぜ、該菌体の細胞壁を溶
解し、次いで加熱して内容物を抽出したのち、遠心分離
やろ過などによって分解した細胞壁を分離除去すること
によって得られる。
本発明方法に用いる栄養培地には、前記の必須成分であ
る炭素源及び窒素源以外に、通常培地に用いられている
添加成分、例えばリン酸カリウム塩類、硫酸アンモニウ
ム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウムなどの無機塩類
、ビタミン類なども゛必要に応じ添加することができる
本発明方法における培養温度は65〜68°Cの範囲で
ある。この温度が35℃未満では増殖速度が極めて遅く
、また38℃を超えると培養初期における増殖速度は速
いものの、最終的菌体濃度が低くなる。
本発明方法に用いるバチルス°リケニホルミスATC0
1458Gは極めて酸素要求性の強い変異株であること
が、本発明者らの研究によ1り分った。すなわち、該菌
体の培養において、一時的に窒素を通して嫌気状態にし
、酵素活性を向上させることを試みたが、予想に反し逆
効果となって酵素活性は極めて低く、該菌体を寒天培地
に移してそのコロニー形態を観察したところ、全く異な
ってい丸したがって、該菌体の培養において、アルカ1
ノ・プロテアーゼ生産に好ましい通気条件を見出すため
に、亜硫酸ナトリウムの酸化テスト(二より、酸素移動
速度(Oxygen Transfer Hate )
をめたところ、1X 10’ 〜10 X 10’ g
−mol−02/H1−m i n の範囲が最適であ
ること力ぷ分った。酸素移動速度がこの範囲を逸脱する
と、菌体の増殖〃S著しく抑制されて菌体濃度が低くな
シ、その結果酵素活性も低くなる。
また、本発明方法においては、培養中のpH)ま6.5
〜7.0の範囲であり、6.5未満では酵素活イ生が低
く、また7、0を超えると菌体の増殖i=抑溜1]され
る。
本発明のアルカリ・プロテアーゼの発酵製造法(二よる
と、発酵液の酵素活性を高めることi=でき、かつ発酵
時間を短縮しうるので、発酵槽や1麦処理工程における
装置の小型化か可能であり、その上装置容量当りの生産
性を向上させることi=できもしたがって、本発明方法
はアルカリ・プロテアーゼの工業的発酵生産に極めて適
している。
次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明するO 参考例1 第1表に示すような成分を含む培地に、種々の炭素源を
添加したもの10 D mlを5 D O、nl坂ロフ
ラスコに入れ、初期PHを6にして、バチリス゛リケニ
ホルミスATCC14580を37°Cで6日間振どう
培養したときの発酵液1 ml当りの酵素活性(PUA
l )をめた。その結果を第2表に示す。
第 1 表 第2表 第2表からラクトースとガラクトース以外は、はとんど
アルカリ・プロテアーゼを生産しないこと及び、ラクト
ースはガラクトースの約2倍の酵素活性を示すことが分
る。
参考例2 参考例1の第1表に示す組成の培地に、種々の量のラク
トースを添加したもの100111を500 mlの坂
ロフラスコに入れ、初期PHを6にして、参考例1で用
いた菌体を37℃で3日間振どう培養したときの発酵液
1ゴ当りの酵素をめた。その結果を第3表に示す。
第3表 第3表から、ラクトース添加量が培地11当り30〜8
0.9のものが酵素活性が大きいことが分る。
実施例1 参考例1の第1表に示す組成の培地に、炭素源としてラ
クトース60fl/lを添加し、さらに窒素源として第
4表に示すように種々のものを添加し、参考例1と同様
にして培養試験を行い、酵素活性と培養時間をめた。そ
の結果を第4表に示す。
実施例2 参考例1の第1表に示す組成の培地に、炭素源どしてラ
クトース60β/lを添加し、窒素源として酵母エキス
10.!9/l及び種々の量の大豆カゼインを添加し、
参考例1と同様にして培養試験を行い、酵素活性と培養
時間をめた。その結果を第5表に示す。
第5表 実施例3 実施例2において、大豆カゼイン添加量を20g/lと
し、酵母エキスの添加量を種々変える以外は、実施例2
と同様にして培養試験を行い、酵素活性と培養時間をめ
た。その結果を第6表に示す。
第6表 実施例4 実施例2における酵母エキス10.9/lの代りに、菌
体エキス1バツチ分を用いる以外は、実施例2と全く同
様にして培養試験を行い、酵素活性と培養時間をめた。
その結果を第7表に示す。
第 7 表 実施例5 第8表に示すような組成の培地を用い、培養温度を変え
て前記と同様に培養試験を行い、酵素活性と培養時間を
めた。その結果を第9表に示す。
第8表 第 9 表 実施例6 実施例5における酵fUエキス109/l:の代りに、
菌体エキス1バッチ分を用いる以外は実施例5と全く同
様にして培養試験を行い、酵素活性と培養時間をめた。
その結果を第10表に示す。
第10表 実施例7 実施例5における培地と同様のものを用い、37℃で培
養するに当り、l/−ジャー゛ファーメンタでかきまぜ
速度を変化させて酸素移動速度(QTRと略す)を変化
させ、培養試験を行い、酵素活性と培養時間をめた。そ
の結果を第11表に示す。
実施例8 実施例乙における培地と同様のものを用い、実施例7と
同様にして培養試験を行い、酵素活性と培養時間をめた
。その結果を第12表に示す。
実施例9 実施例5における培地と同様のものを用い、37°Cで
培養するに当り、Pl(を種々変えて培養試験を行い、
酵素活性と培養時間をめた。その結果を第13表に示す
第13表 A(Vt−

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 バチルス・リケニホルミス(Bacillusli
    cheniformis ) ATOO14580を用
    いてアルカリ・プロテアーゼを発酵生産するに当り、炭
    素源として培地IJ当りラクトース30〜8011を、
    窒素源として培地11当シ大豆カゼイン10〜255と
    、酵母エキス5〜20g又は前記菌体の発酵後分離した
    菌体エキス若しくはその両方とを添加した栄養培地中で
    、温度35〜38℃及びPH6,5〜7.0の条件下で
    前記菌体を培養することを特徴とするアルカリ°プロテ
    アーゼの製造方法。 2 菌体エキスが、発酵後分離した菌体と卵白とを混合
    してかきまぜながら加熱したのち、該菌体の細胞壁を取
    り除いて成るものである特許請求の範囲第1項記載の製
    造方法。 6 菌体エキスが、発酵後分離した菌体とリゾチームと
    を混合してかきまぜながら加熱したのち、該菌体の細胞
    壁を取り除いて成るものである特許請求の範囲第1項記
    載の製造方法。 4 酸素移動速度(Oxygen Transfer 
    Rate )をI Xl 0”’ 〜10X10″l−
    m01.02/11−m1nの範囲で行う特許請求の範
    囲第1項記載の製造方法。
JP58245459A 1983-12-28 1983-12-28 アルカリ・プロテア−ゼの製造方法 Pending JPS60141289A (ja)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05192131A (ja) * 1991-03-19 1993-08-03 Becton Dickinson & Co 環境サンプリング用器具として使用するのに適した微生物培地
CN110408568A (zh) * 2019-08-09 2019-11-05 中国农业科学院饲料研究所 一株高产蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其发酵产酶方法

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