CN103289979A

CN103289979A - 发酵法制取碱性蛋白酶的一种方法

Info

Publication number: CN103289979A
Application number: CN 201210418976
Authority: CN
Inventors: 王鹏; 丛倩千
Original assignee: BEIJING RENFENG TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: BEIJING RENFENG TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2012-10-29
Filing date: 2012-10-29
Publication date: 2013-09-11

Abstract

本发明提供了一种发酵法制取碱性蛋白酶的方法：采用紫外线-NTG复合诱变处理获得遗传性能稳定的高产嗜碱性芽孢杆菌菌株Svf4-21-7；发酵液经硫酸铵盐析、透析脱盐、离子交换层析、聚乙二醇包埋浓缩和凝胶过滤层析，冻干后碱性蛋白酶活力≥100000u/g。本发明制取的碱性蛋白酶产量高，工艺相对简单，适合于工业化生产。

Description

发酵法制取碱性蛋白酶的一种方法

技术领域

本发明涉及碱性蛋白酶高产菌株的诱变选育及利用该菌株发酵制备碱性蛋白酶的方法，涉及微生物领域。

背景技术

碱性蛋白酶(Alkaline Protease)是指在pH值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类，其最适pH值一般为9～11，属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类。碱性蛋白酶除可催化蛋白质水解为氨基酸外，在有机溶剂中还可催化多肽的合成。

碱性蛋白酶最早在猪的胰脏中发现。1913年，Rohm首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。1945年，瑞士的Dr.Jaag等发现了微生物碱性蛋白酶(Pose A H，1980)，使蛋白酶有可能广泛应用于洗涤剂工业。1963年，诺和诺德公司(现诺维信公司)发现了更适用于洗涤剂的碱性蛋白酶Alcalase，酶制剂被广泛地皮用于洗涤剂产品中，出现了加酶洗衣粉，随后的20年中，细菌类蛋白酶是唯一被应用于洗涤剂的商品化酶制剂。

碱性蛋白酶主要应用于加酶洗涤剂工业，在制革、丝绸、饲料、医药、食品、环保等工业也有广泛的应用。目前，在世界范围内蛋白分解酶是工业酶种中用得最多的一种酶，约占酶总量的60％，其中碱性蛋白酶就占37％。它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用，吸引着国际国内的许多公司及研究单位竟相对其进行多方面的研究。

碱性蛋白酶广泛存在于细菌、放线菌和真菌中，其中以芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究最为广泛和深入。目前用于碱性蛋白酶工业化生产的菌种主要有：枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌等。我国用于生产碱性蛋白酶的菌种主要有：地衣芽孢杆菌2709、短小芽孢杆菌289和209菌株(方海红等，2002)、嗜碱性短小芽孢杆菌B45等。

国内50年代开始选育产碱性蛋白酶菌株，60年代末上海洗涤剂厂选育出地衣芽孢杆菌2709，70年代中国科学院林业±壤研究所选育出短小芽孢杆菌289和290。我国目前用于碱性蛋白酶的生产菌和研究对象主要是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌及短小芽孢杆菌，如2709地衣芽孢杆菌和1213地衣芽孢杆菌，嗜碱性短小芽孢杆菌B45等。我国自1978年开始推广应用，目前加酶洗涤剂约占总洗涤剂的10％～15％，1989年生产洗涤剂用蛋白酶15-20万吨，目前生产应用更多。近年来我国科学工作者对碱性蛋白酶生产进行了不懈的探讨。邱秀宝等人1980年对工业用短小芽孢杆菌209产的碱性蛋白酶进行了部分纯化，并对酶的性质和应用进行了研究。1988年又从土样中筛选到一株嗜碱性短小芽孢杆菌R115，经选育获得一株高产、稳产碱性蛋白酶变异株B45。郑铁曾等(1993)进行了提高C1213菌碱性蛋白酶活力的研究，酶活力提高了170％。薛林贵，冯清平等(1997)从28份土样中筛选到一株嗜碱性地衣芽孢菌株，对其原生质体进行复合及诱变处理，从中选育出了耐高温，耐碱的碱性蛋白酶高产菌株，以期应用于工业生产。

与国内相比，国外在碱性强白酶的菌株选育以及应用方面远远领先于国内，关于菌株的筛选及其应用性质的报道层出不穷，并且许多已进行了商业化生产。

Deepti Agrawal等报道(2005)了从土壤中筛选到一株碱性蛋白酶产生菌Aspergillus oryzae NCIM649，该菌所产碱性蛋白酶可以运用于大豆蛋白的水解。S.Mehrotra，P.K等(1999)报道从盐碱性土壤中筛选到一株芽孢杆菌，该菌可以以无机氮氯化铵为唯一氮源产碱性蛋白酶。B.Johnvesly(2001)筛选到一株嗜热、嗜碱性芽孢杆菌JB-99，该菌株所产碱性蛋白酶最适温度为80℃，80℃加热1h，仍保持78％的活性。Ruchi Oberoi(2001)筛选到一种SDS稳定型碱性蛋白酶，酶的作用温度范围在20-80℃，0.1％SDS作用1h，酶活没有改变，0.5％SDS作用1h，活性保持70％。该酶对各种表面活性剂、氧化剂均有良好的抗性，是一种较为理想的洗涤用酶。Rathindra Monhan Banik(2004)筛选到了一株产碱性蛋白酶的蜡样芽胞杆菌，该酶最适温度为50℃，最适pH10.5-11.0，40℃保温1h，残余酶活70％，50℃保温1h，残余酶活30％左右，也可作为商业用洗涤剂添加物开发。

我国碱性蛋白酶的研究发展很快，随着重组DNA技术的发展，蛋白酶的蛋白质工程研究也开展并取得了一定的成果。虽然我国研究和生产的碱性蛋白酶的活力水平不断提高，但我国在碱性蛋白酶出发菌种的筛选方面的工作还是很不够的，并且碱性蛋白酶的酶学性质仍不能满足实际应用领域的要求，特别是在食品应用领域，大多数采用进口碱性蛋白酶制剂，并且大规模工业用碱性蛋白酶也主要依赖进口。

基于以上考虑，本项目以从西藏温泉采集到的土样分离到的产高温碱性蛋白酶的菌株——嗜碱性芽孢杆菌SVF176(Bacillus alcalophilus)为出发菌株，通过紫外诱变和NTG复合诱变获得高产菌株Svf4-21-7(CGMCC No.6417)，研究发酵条件对产酶的影响，建立高效制备碱性蛋白酶的发酵模式和提纯工艺以及在更广泛的条件下发挥高活性的固定化工艺，获得了工业化生产碱性蛋白酶的途径。

发明内容

本发明的目的是采用现代生物技术手段，提供一种改良嗜碱性芽孢杆菌后发酵制备碱性蛋白酶的新方法，该方法具有发酵单位高、收率高、酶活性高等优点。本发明的目的是通过如下技术方案实现的，具体步骤顺序如下：

1、高产菌株筛选

将复筛选出的SVF176菌株接入固体斜面培养基中，30℃培养一段时间后，用生理盐水将菌苔洗下，制成菌悬液，菌数约为10⁸个/ml。取菌悬液6ml加至直径9cm的培养皿内，在黑暗中用紫外灯(20w，距离30cm)分别照射20s、30s、40s、50、60s。菌悬液中加入NTG，使其终浓度分别为40、100、200、400g/mL，37℃水浴处理30min，间歇摇动，离心后去掉含亚硝基胍的上清液。将处理过的菌液稀释后涂布于酪蛋白平板分离培养基上，30℃避光培养48h。待平板上长出菌落后进行碱性蛋白酶高产菌株的筛选，其中菌株Svf4-21-7酶活最高，产酶活性稳定。

2、发酵罐发酵

挑取菌株制备成0.1mL菌悬液，经种子逐级扩大培养，按5～20％接种量转入50L发酵罐发酵。发酵培养基组成为：棉籽饼粉(60～100目)1～5％，酵母浸粉0.50～2.00％，麦芽糊精(DE＝30％)5～15％，柠檬酸钠0.1～0.5％，CaCl₂ 0.1～0.5％，K₂HPO₄ 0.5～2.0％。发酵条件为：装料系数0.50～0.80，温度30～37℃，转速200～800r/min，通风量1∶0.5～1∶2.5，溶氧维持在30～40％。

3、提取纯化

①发酵液预处理：发酵液4℃预冷，5000r/min离心20min，取上清液，即得粗酶液。

②硫酸铵盐析：各取发酵液的离心上清液10L，边搅拌边缓慢添加经研磨过的硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度分别为30％～80％，缓慢搅拌20min后，4℃静置数小时。倾去上清液，5000r/min离心20min，取上清液测残余酶活，沉淀添加10～25mmol/L Tris-HCl-CaCl₂，pH8.0缓冲液溶解。

③透析脱盐：将盐析沉淀溶解后溶液置于4℃下，用10mmol/L Tris-HCl-CaCl₂，pH8.0的缓冲液透析除盐约24h。

④离子交换层析：采用DEAE-sepharose Fast Flow，装柱，用basic buffer平衡2～4个柱体积，上样结束，用basic buffer洗脱2～5个柱体积，改用1％～5％KCl浓度的elution buffer分段洗脱，洗脱速度0.4～1.0mL/min。

⑤聚乙二醇包埋浓缩：收集通过离子交换层析有酶活性的洗脱液，用PGE6000～20000包埋数小时浓缩蛋白质。

⑥Sephacryl S-300HR凝胶过滤层析：将成品凝胶浆装柱，用1～3倍柱床体积的buffer洗涤层析柱，使其稳定和平衡。用蓝色葡聚糖和VB₁₂混合，检查层析床的均匀性和预测样品所需洗脱用量以确定层析收集的起点和终点。上样，并用洗脱缓冲液进行蛋白洗脱，洗脱速度为0.4～1.0mL/min，收集洗脱液。

⑦冷冻干燥：洗脱液冷冻干燥，制得碱性蛋白酶固体粉末。

本发明的创造性在于采用紫外线-NTG复合诱变获得碱性蛋白酶高产菌株，通过优化高产菌株的发酵条件，碱性蛋白酶的发酵产量达到38000u/mL以上；通过硫酸铵盐析、透析脱盐、离子交换层析、聚乙二醇包埋浓缩和凝胶过滤层析纯化，得到的碱性蛋白酶活力＝100000u/g。本发明具有操作简便、易于大规模生产，产品收率高、酶活性高等特点。

具体实施方式

实施例1发酵法制取碱性蛋白酶的一种方法，按以下步骤依次进行：

1、高产菌株筛选

2、50L发酵罐发酵

挑取菌株制备成0.1mL菌悬液，经种子逐级扩大培养，按5％接种量转入50L发酵罐发酵。发酵培养基组成为：棉籽饼粉(60目)3％，酵母浸粉1.25％，麦芽糊精(DE＝30％)15％，柠檬酸钠0.3％，CaCl₂ 0.3％，K₂HPO₄ 1.0％。发酵条件为：装料系数0.65，温度34℃，转速500r/min，通风量1∶2.5，溶氧维持在30％。

3、提取纯化

②硫酸铵盐析：各取发酵液的离心上清液10L，边搅拌边缓慢添加经研磨过的硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度为60％，缓慢搅拌20min后，4℃静置数小时。倾去上清液，5000r/min离心20min，取上清液测残余酶活，沉淀添加10mmol/LTris-HCl-CaCl₂，pH8.0缓冲液溶解。

④离子交换层析：采用DEAE-sepharose Fast Flow，装柱，用basic buffer平衡2个柱体积，上样结束，用basic buffer洗脱3个柱体积，改用1％KCl浓度的elutionbuffer分段洗脱，洗脱速度0.4mL/min。

⑤聚乙二醇包埋浓缩：收集通过离子交换层析有酶活性的洗脱液，用PGE12000包埋数小时浓缩蛋白质。

⑥Sephacryl S-300HR凝胶过滤层析：将成品凝胶浆装柱，用3倍柱床体积的buffer洗涤层析柱，使其稳定和平衡。用蓝色葡聚糖和VB₁₂混合，检查层析床的均匀性和预测样品所需洗脱用量以确定层析收集的起点和终点。上样，并用洗脱缓冲液进行蛋白洗脱，洗脱速度为0.4mL/min，收集洗脱液。

⑦冷冻干燥：洗脱液冷冻干燥，制得碱性蛋白酶固体粉末，酶活性为112400u/g。

实施例2发酵法制取碱性蛋白酶的一种方法，按以下步骤依次进行：

1同实施例1。

2、50L发酵罐发酵

挑取菌株制备成0.1mL菌悬液，经种子逐级扩大培养，按10％接种量转入50L发酵罐发酵。发酵培养基组成为：棉籽饼粉(100目)5％，酵母浸粉1.00％，麦芽糊精(DE＝30％)10％，柠檬酸钠0.1％，CaCl₂ 0.1％，K₂HPO₄ 1.5％。发酵条件为：装料系数0.50，温度30℃，转速800r/min，通风量1∶2.0，溶氧维持在35％。

3、提取纯化

②硫酸铵盐析：各取发酵液的离心上清液10L，边搅拌边缓慢添加经研磨过的硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度为50％，缓慢搅拌20min后，4℃静置数小时。倾去上清液，5000r/min离心20min，取上清液测残余酶活，沉淀添加15mmol/LTris-HCl-CaCl₂，pH8.0缓冲液溶解。

④离子交换层析：采用DEAE-sepharose Fast Flow，装柱，用basic buffer平衡3个柱体积，上样结束，用basic buffer洗脱3个柱体积，改用2％KCl浓度的elutionbuffer分段洗脱，洗脱速度0.6mL/min。

⑤聚乙二醇包埋浓缩：收集通过离子交换层析有酶活性的洗脱液，用PGE6000包埋数小时浓缩蛋白质。

⑥Sephacryl S-300HR凝胶过滤层析：将成品凝胶浆装柱，用3倍柱床体积的buffer洗涤层析柱，使其稳定和平衡。用蓝色葡聚糖和VB₁₂混合，检查层析床的均匀性和预测样品所需洗脱用量以确定层析收集的起点和终点。上样，并用洗脱缓冲液进行蛋白洗脱，洗脱速度为0.6mL/min，收集洗脱液。

⑦冷冻干燥：洗脱液冷冻干燥，制得碱性蛋白酶固体粉末，酶活性为107800u/g。

实施例3发酵法制取碱性蛋白酶的一种方法，按以下步骤依次进行：

1同实施例1。

2、50L发酵罐发酵

挑取菌株制备成0.1mL菌悬液，经种子逐级扩大培养，按15％接种量转入50L发酵罐发酵。发酵培养基组成为：棉籽饼粉(80目)1％，酵母浸粉1.75％，麦芽糊精(DE＝30％)15％，柠檬酸钠0.5％，CaCl₂ 0.5％，K₂HPO₄ 1.0％。发酵条件为：装料系数0.80，温度37℃，转速600r/min，通风量1∶0.5，溶氧维持在40％。

3、提取纯化

②硫酸铵盐析：各取发酵液的离心上清液10L，边搅拌边缓慢添加经研磨过的硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度为80％，缓慢搅拌20min后，4℃静置数小时。倾去上清液，5000r/min离心20min，取上清液测残余酶活，沉淀添加25mmol/LTris-HCl-CaCl₂，pH8.0缓冲液溶解。

④离子交换层析：采用DEAE-sepharose Fast Flow，装柱，用basic buffer平衡4个柱体积，上样结束，用basic buffer洗脱5个柱体积，改用3％KCl浓度的elutionbuffer分段洗脱，洗脱速度1.0mL/min。

⑤聚乙二醇包埋浓缩：收集通过离子交换层析有酶活性的洗脱液，用PGE15000包埋数小时浓缩蛋白质。

⑥SephacrylS-300HR凝胶过滤层析：将成品凝胶浆装柱，用2倍柱床体积的buffer洗涤层析柱，使其稳定和平衡。用蓝色葡聚糖和VB₁₂混合，检查层析床的均匀性和预测样品所需洗脱用量以确定层析收集的起点和终点。上样，并用洗脱缓冲液进行蛋白洗脱，洗脱速度为1.0mL/min，收集洗脱液。

⑦冷冻干燥：洗脱液冷冻干燥，制得碱性蛋白酶固体粉末，酶活性为100650u/g。

Claims

1.发酵法制取碱性蛋白酶的一种方法，主要包括以下步骤：

1)高产菌株筛选：将复筛选出的嗜碱性芽孢杆菌SVF176菌株接入固体斜面培养基中培养，制成菌悬液。紫外线-NTG复合诱变，酪蛋白平板分离培养，筛选出碱性蛋白酶高产菌株Svf4-21-7(CGMCC No.6417)。

2)发酵罐发酵：菌种经种子逐级扩大培养，转入发酵罐发酵。

3)提取纯化：发酵液预处理后，经硫酸铵盐析、透析脱盐、离子交换层析、聚乙二醇包埋浓缩、凝胶过滤层析后冷冻干燥，制得碱性蛋白酶固体粉末。

2.根据权利要求1所述的紫外线-NTG复合诱变方法，其特征在于：紫外线诱变时间为20～90s，NTG终浓度为40～400g/ml。

3.根据权利要求1所述的发酵培养基成分，其特征在于：棉籽饼粉(60～100目)1～5％，酵母浸粉0.50～2.00％，麦芽糊精(DE＝30％)5～15％，柠檬酸钠0.1～0.5％，CaCl₂ 0.1～0.5％，K₂HPO₄ 0.5～2.0％。

4.根据权利要求1所述的发酵条件，其特征在于：装料系数0.50～0.80，温度30～37℃，转速200～800r/min，通风量1∶0.5～1∶2.5，溶氧维持在30～40％。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：硫酸铵盐析、透析脱盐、离子交换层析、聚乙二醇包埋浓缩、凝胶过滤层析逐步纯化。

6.根据权利要求1所述的硫酸铵盐析方法，其特征在于：硫酸铵饱和度为30％～80％，沉淀添加Tris-HCl-CaCl₂的浓度为10～25mmol/L。

7.根据权利要求1所述的离子交换层析方法，其特征在于：采用DEAE-sepharoseFast Flow装柱，用basic buffer平衡2～4个柱体积，上样结束，用basic buffer洗脱2～5个柱体积，改用1％～5％KCl浓度的elution buffer分段洗脱，洗脱速度0.4～1.0mL/min。

8.根据权利要求1所述的聚乙二醇包埋浓缩方法，其特征在于：采用的聚乙二醇为PGE6000～20000。

9.根据权利要求1所述的凝胶过滤层析方法，其特征在于：采用Sephacryl S-300HR装柱，用1～3倍柱床体积的buffer洗涤层析柱；洗脱缓冲液进行蛋白洗脱，洗脱速度为0.4～1.0mL/min。