CN102757949A - 一种水解锦纶的聚酰胺酶及其编码基因 - Google Patents

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陈晟
郭迎春
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Abstract

本发明提供了一种聚酰胺酶及其编码基因和表达系统。聚酰胺酶氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。编码其的基因核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。该聚酰胺酶能够有效水解锦纶，可用于纺织改性行业。本发明提供的聚酰胺酶最适温度50℃，最适pH8.0.在40℃、pH8.0下处理锦纶，吸水实验和染色实验结果显示该重组聚酰胺酶能够提高其吸水性和上染率，具有很好的应用前景。

Description

一种水解锦纶的聚酰胺酶及其编码基因
技术领域
本发明涉及一种水解水不溶性底物锦纶的聚酰胺酶及其编码基因，属于酶基因工程和酶工程领域。
技术背景
在纺织工业中聚酰胺(polyamida，PA)俗称尼龙或锦纶，是纺织三大合成纤维之一，其耐磨性高、弹性好、拉伸恢复能力强、摩擦系数低的优点，使其在纺织工业中具有重要应用。然而作为高分子聚合物，PA的手感和润湿性较差，需要对其进行改性，以达到优良的吸水性和染色效果。目前工业上均使用强碱或强酸工艺处理PA，导致纤维结构损伤严重，强度和质量降低，织物染色效果差，且生产过程产生大量废水，对环境造成极大污染。生物酶处理相对于传统酸碱工艺具有作用条件温和、特异性强、工艺可控制性强，处理过程污染小等优点，因此开发适用于PA改性的高效酶制剂以实现PA的生物酶改性，不仅能够有效提高PA的质量和加工性能，还顺应了绿色生产加工和可持续发展的趋势。聚酰胺酶能够水解PA分子链中的酰胺键，生成相应的氨基和羧基，从而增加PA的亲水性。聚酰胺酶与其它水解锦纶的生物酶相比特异性强，水解效率高，因此酶处理工艺时间短，具有潜在的工业应用价值。
目前国外对能够水解PA的聚酰胺酶研究尚处于初级阶段，只是报道过来源于Nocardiafarcinica的聚酰胺酶能够水解PA，但野生菌产酶量低，且该聚酰胺酶的基因序列和蛋白序列尚未确定。国内尚未有关水解PA聚酰胺酶的研究。
发明内容
本发明要解决的一个技术问题是提供一种水解PA的聚酰胺酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种编码聚酰胺酶的基因，其核苷酸
序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明要解决的另一技术问题是提供一种生产聚酰胺酶的方法，具体包括
如下步骤：首先采用化学全合成或PCR方法获得SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；克隆获得的核苷酸序列到pET20b(+)表达载体；然后将获得的表达载体转化E.coli BL21获得表达聚酰胺酶的基因工程菌；最后通过优化发酵工艺，将获得的基因工程菌在LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基37℃培养3h后用4mg/L IPTG诱导，降温至25℃培养，20h时离心收集菌体，破壁后收集上清粗酶液。
本发明的另一个目的是提供一种编码本发明的聚酰胺酶的DNA分子，所述的DNA分子具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
本发明的再一个目的是提供包含本发明基因的表达载体。
本发明的又一个目的是提供包含本发明表达载体的宿主细胞。
本发明提供的聚酰胺酶最适温度50℃，最适pH8.0.在40℃、pH8.0下处理锦纶，吸水实验和染色实验结果显示该重组聚酰胺酶能够提高其吸水性和上染率，具有很好的应用前景。
附图说明
图1重组菌发酵产聚酰胺酶SDS-PAGE图
1：胞内上清，2：空载对照，M：protein marker
图2重组聚酰胺酶纯化SDS-PAGE电泳分析
1：纯化后蛋白；M：protein marker.
图3锦纶经不同处理后的上染率
具体实施方式
实施例1本实验说明聚酰胺酶分离克隆程序。
Nocardia farcinica CGMCC 4.1166菌株在液体培养基（葡萄糖1g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，氯化钙0.1g/L）中培养3天，10000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤，使用基因组提取试剂盒提取总DNA，提取过程中需加入0.5%的SDS，提高总DNA提取效率。
根据NCBI中N.farcinica IFM10152中nfa28230设计引物如下，nfa28230上游引物(amid-f)：5，-CCCATATGGATGTCGCCGAATACGCCGC-3，下游引物(amid-r)：3，-CAAGCTTAGAAGACGGCCTGCCCGGTGTGGG-5,，下划线部分为限制性内切酶Nde Ⅰ和HindⅢ酶切位点。
利用上述引物，以Nocardia farcinica总DNA为模版，PCR扩增聚酰胺酶基因。反应条件为：94℃预变性4min后进入一下循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。扩增得到1440bp的PCR片段，割胶回收。回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板。37℃培养过夜，挑取单菌落，接入LB液体培养基，8h后提取质粒。将此质粒进行序列测定，结果表明此基因全长1440个核苷酸，编码479个氨基酸，和蛋白nfa-28320的基因有9个核苷酸的差异，编码氨基酸有三个不同。此基因是第一个报道的能够水解锦纶的聚酰胺酶基因。
实施例2本实验说明聚酰胺酶基因在大肠杆菌表达载体上的构建程序。
用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET20b(+)。将pET20b(+)质粒和聚酰胺酶基因进行Nde Ⅰ和HindⅢ双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的AMI-pET20b(+)质粒。
实施例3本实验说明大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌的程序。
将质粒AMI-pET20b(+)热击转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，在氨苄青霉素（100mg/L）-LB平板上经37℃培养过夜，挑选转化子（重组菌AMI-pET20b(+)/E.coli BL21(DE3)）在LB培养基（蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 1g/L）中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基（甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HPO4 12.54g/L，KH2PO4 2.31g/L）37℃培养3h后用4mg/L IPTG（异丙基硫代βD半乳糖苷）诱导，降温至25℃培养，20h时离心收集菌体，破壁后上清酶活为0.6u/mL。电泳图见图1，表观分子量31kDa。
实施例4本实验说明重组聚酰胺酶的纯化程序。
将胞内上清液经70%硫酸铵沉淀过夜，4℃，12000rpm离心20min，弃上清，沉淀用适量磷酸钠缓冲液（50mM，pH7.0）溶解，透析过夜得到浓缩酶液。将透析过夜蛋白液于4℃，12000rpm离心10min后，经0.22微米膜过滤后制成阴离子交换柱上样样品。DEAE阴离子交换柱先用水平衡，再用缓冲液A（pH7.0.50mM磷酸钠）平衡，待基线稳定后，将上样样品完全注入阴离子柱，用缓冲液A洗去未结合的蛋白后，再用缓冲液A和缓冲液B（pH7.0，50mM磷酸钠+1M Nacl）进行梯度洗脱，收集目的蛋白样品，测定酶活及蛋白含量。将经过初步纯化收集的目的蛋白样品再经monoQ阴离子柱进一步纯化，收集目的蛋白样品，测定酶活及蛋白含量。HiTrap phenl FF疏水柱用水平衡后，用缓冲液A（pH7.50mM磷酸钠+1M Na2SO4）平衡，将经monoQ阴离子柱分离到的目的蛋白样品注入疏水层析柱，用洗去未结合蛋白，再用缓冲液A和缓冲液B（pH7.50mM磷酸钠）进行梯度洗脱，得到较纯的聚酰胺酶，测定酶活及蛋白含量。
实施例5本实验说明重组聚酰胺酶的锦纶改性程序。
1、锦纶的预处理
称取0.5gPA置于100mL去离子水中，60℃、200rpm回转式摇床洗涤30min，去除PA表面的一些杂质，以免影响锦纶的改性处理。
2、锦纶纤维的酶处理、碱处理
酶处理：将预处理过的PA置于5mL pH 7.0的磷酸钠缓冲液的中，加入5mL重组聚酰胺酶酶液（酶活为2.5U），40℃、200rpm回转式摇床酶处理1h。
碱处理:：将预处理过的PA置于10mL pH 7.0的磷酸钠缓冲液的三角瓶中，加入1mL 1mol/L氢氧化钠，40℃、200rpm回转式摇床处理1h。
对照：将预处理过的PA纤维置于10mLpH 7.0的磷酸钠缓冲液中，440℃、200rpm回转式摇床处理1h。
3、锦纶纤维的后处理
将处理的锦纶置于100mL碳酸钠（10mM，pH9.5）中，50℃、200rpm洗涤30min后，再用去离子水充分洗涤，以去除吸附在PA表面的酶蛋白等，后在60℃烘干。
4、锦纶纤维酶改性效果的测定
吸水高度实验
根据毛细管效应，将处理后的PA裁成2cm*20cm条状，底部（1cm）浸入水中，测定处理后的锦纶在30min内水的上升的高度（cm），用来表示PA纤维的润湿性[10]。水面上升高度越高，说明PA纤维的润湿性越强。
染色实验
配制20g/L的弱酸性黄GN染料，将锦纶75℃入染，染色1h，自然冷却，测定纤维对染料的上染率。以PA对染料的上染率表征酶对纤维的改性效果。上染率越高，说明PA的润湿性越好，改性效果越明显。
PA分别经碱、重组聚酰胺酶和磷酸缓冲液处理后，测定PA纤维毛细管上升高度和上率，结果如表1和图3所示，酶处理和碱处理效果基本相当。
表1.PA经不同处理后的吸水高度结果
Figure BDA00001685399500041
Figure IDA00001685400300031
Figure IDA00001685400300041
Figure IDA00001685400300051

Claims (5)

1.一种水解锦纶的聚酰胺酶，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述聚酰胺酶的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.表达权利要求1所述聚酰胺酶的基因工程菌或细胞系。
4.含有权利要求2所述聚酰胺酶基因的表达载体或克隆载体。
5.生产权利要求1所述聚酰胺酶的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）采用化学全合成或PCR方法获得SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；
2）克隆SEQ ID NO.2所示核苷酸序列到pET20b(+)表达载体；
3）将步骤2）获得的表达载体转化E.coli BL21(DE3)获得表达聚酰胺酶的基因工程菌；
4）将步骤3）获得的基因工程菌在LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基37℃培养3h后用4mg/L IPTG诱导，降温至25℃培养，20h时离心收集菌体，破壁后收集上清粗酶液。
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