CN103343113B - 一种热稳定性改良的木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E及其基因和应用 - Google Patents

一种热稳定性改良的木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E及其基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体内容涉及一种热稳定性改良的木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E、V81P/G82E/D185P/S186E及其基因和应，所述木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的木聚糖酶的第81位缬氨酸突变为脯氨酸且第82位甘氨酸突变为谷氨酸。进一步，将木聚糖酶的第81位缬氨酸突变为脯氨酸且第82位甘氨酸突变为谷氨酸；第185位的天冬氨酸突变为脯氨酸且第186位的丝氨酸突变为谷氨酸，得到木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E/D185P/S186E。本发明的获得的突变酶的热稳定性明显提高，显示出了在纸浆酿造、生物能源等工业上潜在的应用价值。

Description

一种热稳定性改良的木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E及其基因和应用
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体内容涉及一种热稳定性改良的木聚糖酶突变体XynAS9-mV81P/G82E及其基因和应用。
背景技术
木聚糖酶(endo-1,4-β-xylanases，EC3.2.1.8)是一类重要的工业用酶，降解木聚糖成低聚糖和木糖的一类酶的总称。主要以内切方式水解木聚糖分子中的β-1,4-糖苷键，生成低聚木糖和木糖，是半纤维素水解酶系中最关键的水解酶之一，目前所克隆的木聚糖酶大多属于F/10和G/11家族，且第十家族的木聚糖酶较第十一家族的木聚糖酶具有底物特异性低、水解速度快、水解产物聚合度低等优势，因此在工业上具有重要的应用价值。近几年来木聚糖酶已经在饲料、制浆造纸、食品、能源等行业中得到广泛应用，尤其是在工业造纸上的应用。但是目前大多木聚糖酶的最适温度为45-55℃，且热稳定性差，不能满足纸浆酿造中的要求，并且高温木聚糖酶或耐热酶具有降低酶制剂的成本，提高反应催化效率，降低反应能耗，降低了杂菌的污染及对化学变性剂及相关金属利息具有较高的耐受力。基于此寻找有效途径和手段，提高木聚糖酶在高温环境中的稳定性及催化活性已成为国内木聚糖酶工业的当务之急。
随着蛋白质工程技术和分子生物学的发展，运用定向进化和理性设计的手段对酶分子进行人工进化和改造已成为当前酶工程领域研究的热点。到目前为止，已有许多学者运用这项技术成功对蛋白的热稳定性进行了改造，本发明应用定点突变的方法改造木聚糖酶，分别获得木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E和木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E/D185P/S186E，将木聚糖酶XynAS9-m的最适温度提高了20℃，Tm值提高了7℃，扩大了其在工业上的应用。
发明内容
本发明的目的是通过定点突变的方法对木聚糖酶进行改造，使改造后的木聚糖酶XynAS9-m突变体在耐受性上性质更加优良。
本发明的另一目的是提供编码上述木聚糖酶XynAS9-m突变体的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述木聚糖酶XynAS9-m突变体基因的重组载体。
本发明还提供了一种宿主细胞，其含有如前所述的木聚糖酶XynAS9-m突变体的基因或如前所述的重组载体。
本发明对链霉菌来源的木聚糖酶XynAS9-m基因进行定点突变，该木聚糖酶的成熟蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，该成熟蛋白是由如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的。
SEQ ID NO.1
1    MFRHHPTRGR RTAGLLAAAL ATLSAGLTAV APAHPARADT ATLGELAEAK
51   GRYFGSATDN PELPDTQYTQ ILGSEFSQIT VGNTMKWQYT EPSRGRFDYT
101  AAEEIVDLAE SNGQSVRGHT LVWHNQLPSW VDDVPAGELL GVMRDHITHE
151  VDHFKGRLIH WDVVNEAFEE DGSRRQSVFQ QKIGDSYIAE AFKAARAADP
201  DVKLYYNDYN IEGIGPKSDA VYEMVKSFKA QGIPIDGVGM QAHLIAGQVP
251  ASLQENIRRF ADLGVDVALT ELDIRMTLPR TAAKDAQQAT DYGAVVEACL
301  VVSRCVGITV WDYTDKYSWV PSVFPGQGAA LPWDEDFAKK PAYHAIAAAL
351  NGGSPAPGGN CTATYRVTSQ WQGGFTAEIT VGNDHTAPIT GWTVTWTLSS
401  GQSISHMWNG NLTVNGQDVT VRDVGYNGTL GGNGSTTFGF QGEGVADTPA
451  DVTCTPGRPS GTSA
SEQ ID NO.2
1    ATGTTCCGCC ACCACCCGAC CCGAGGCCGC CGCACGGCCG GCCTCCTCGC GGCAGCGTTA
61   GCAACCCTGT CGGCCGGCCT GACCGCGGTT GCGCCCGCTC ATCCGGCCCG CGCCGACACC
121  GCCACCCTGG GCGAACTGGC CGAGGCCAAG GGCCGTTACT TCGGCTCCGC CACGGACAAC
181  CCCGAACTGC CCGACACTCA GTACACGCAG ATCCTGGGCA GCGAGTTCAG CCAGATCACC
241  GTCGGCAACA CCATGAAGTG GCAGTACACC GAGCCGTCTC GGGGCCGGTT CGACTACACC
301  GCCGCCGAGG AGATAGTCGA CCTGGCCGAG TCCAACGGCC AGTCGGTGCG CGGACACACC
361  CTGGTGTGGC ACAACCAGCT GCCGAGCTGG GTCGACGACG TGCCGGCCGG TGAGCTCCTC
421  GGGGTCATGC GCGACCACAT CACCCACGAG GTCGACCACT TCAAGGGGCG ACTGATCCAC
481  TGGGACGTGG TCAACGAGGC GTTCGAGGAG GACGGCAGCC GCCGGCAGTC GGTCTTCCAG
541  CAGAAGATCG GCGACAGTTA CATCGCCGAG GCATTCAAGG CCGCCCGCGC CGCCGATCCG
601  GACGTCAAGC TCTACTACAA CGACTACAAC ATCGAAGGCA TCGGCCCCAA GAGCGATGCC
661  GTCTACGAGA TGGTGAAGTC CTTCAAGGCC CAGGGCATCC CCATCGACGG CGTCGGCATG
721  CAGGCACATC TGATCGCCGG CCAGGTCCCG GCAAGCCTGC AGGAGAACAT CCGGCGCTTC
781  GCCGACCTGG GCGTCGACGT CGCCCTCACC GAACTCGACA TCCGCATGAC CCTGCCGCGC
841  ACCGCTGCCA AGGATGCCCA GCAGGCCACC GACTACGGTG CCGTGGTCGA GGCATGCCTG
901  GTGGTCTCCC GGTGCGTCGG CATCACCGTC TGGGACTACA CCGACAAGTA CTCCTGGGTC
961  CCCTCCGTCT TCCCGGGCCA GGGTGCCGCC CTGCCATGGG ACGAGGACTT CGCCAAGAAG
1021 CCCGCCTATC ACGCCATCGC CGCCGCGCTC AACGGCGGCA GCCCCGCCCC CGGTGGCAAC
1081 TGCACCGCTA CCTACCGCGT CACCAGCCAG TGGCAGGGCG GCTTCACCGC CGAGATCACC
1141 GTCGGGAACG ACCACACCGC GCCGATTACC GGCTGGACCG TCACCTGGAC GCTGTCCAGT
1201 GGCCAGTCCA TCAGCCACAT GTGGAACGGA AACCTCACCG TCAACGGACA GGACGTCACC
1261 GTCCGCGACG TCGGCTACAA CGGCACCCTC GGCGGCAACG GAAGCACCAC CTTCGGCTTC
1321 CAGGGCGAAG GCGTGGCCGA CACTCCGGCG GACGTGACCT GTACCCCCGG CCGGCCGTCC
1381 GGGACTTCGG CGTAG
本发明采用定点突变的方法，获得了2个热稳定性提高的木聚糖酶XynAS9-m突变体，分别命名为V81P/G82E、V81P/G82E/D185P/S186E，即：V81P/G82E为第81位缬氨酸突变为脯氨酸且第82位甘氨酸突变为谷氨酸；V81P/G82E/D185P/S186E为第81位缬氨酸突变为脯氨酸，第82位甘氨酸突变为谷氨酸，第185位的天冬氨酸突变为脯氨酸且第186位的丝氨酸突变为谷氨酸。
因此根据本发明的热稳定性改良的木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E，其中第81位缬氨酸突变为脯氨酸，第82位甘氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如SEQID NO.3所示
SEQ ID NO.3
1    MFRHHPTRGR RTAGLLAAAL ATLSAGLTAV APAHPARADT ATLGELAEAK
51   GRYFGSATDN PELPDTQYTQ ILGSEFSQIT PENTMKWQYT EPSRGRFDYT
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451  DVTCTPGRPS GTSA
因此根据本发明的热稳定性改良的木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E/D185P/S186E，其中第81位缬氨酸突变为脯氨酸，第82位甘氨酸突变为谷氨酸，第185位的天冬氨酸突变为脯氨酸且第186位的丝氨酸突变为谷氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：
1    MFRHHPTRGR RTAGLLAAAL ATLSAGLTAV APAHPARADT ATLGELAEAK
51   GRYFGSATDN PELPDTQYTQ ILGSEFSQIT PENTMKWQYT EPSRGRFDYT
101  AAEEIVDLAE SNGQSVRGHT LVWHNQLPSW VDDVPAGELL GVMRDHITHE
151  VDHFKGRLIH WDVVNEAFEE DGSRRQSVFQ QKIGPEYIAE AFKAARAADP
201  DVKLYYNDYN IEGIGPKSDA VYEMVKSFKA QGIPIDGVGM QAHLIAGQVP
251  ASLQENIRRF ADLGVDVALT ELDIRMTLPR TAAKDAQQAT DYGAVVEACL
301  VVSRCVGITV WDYTDKYSWV PSVFPGQGAA LPWDEDFAKK PAYHAIAAAL
351  NGGSPAPGGN CTATYRVTSQ WQGGFTAEIT VGNDHTAPIT GWTVTWTLSS
401  GQSISHMWNG NLTVNGQDVT VRDVGYNGTL GGNGSTTFGF QGEGVADTPA
451  DVTCTPGRPS GTSA
本发明还提供了编码上述热稳定性改良的木聚糖酶XynAS9-m突变体基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5、6所示
SEQ ID NO.5
1    ATGTTCCGCC ACCACCCGAC CCGAGGCCGC CGCACGGCCG GCCTCCTCGC GGCAGCGTTA
61   GCAACCCTGT CGGCCGGCCT GACCGCGGTT GCGCCCGCTC ATCCGGCCCG CGCCGACACC
121  GCCACCCTGG GCGAACTGGC CGAGGCCAAG GGCCGTTACT TCGGCTCCGC CACGGACAAC
181  CCCGAACTGC CCGACACTCA GTACACGCAG ATCCTGGGCA GCGAGTTCAG CCAGATCACC
241  CCCGAAAACA CCATGAAGTG GCAGTACACC GAGCCGTCTC GGGGCCGGTT CGACTACACC
301  GCCGCCGAGG AGATAGTCGA CCTGGCCGAG TCCAACGGCC AGTCGGTGCG CGGACACACC
361  CTGGTGTGGC ACAACCAGCT GCCGAGCTGG GTCGACGACG TGCCGGCCGG TGAGCTCCTC
421  GGGGTCATGC GCGACCACAT CACCCACGAG GTCGACCACT TCAAGGGGCG ACTGATCCAC
481  TGGGACGTGG TCAACGAGGC GTTCGAGGAG GACGGCAGCC GCCGGCAGTC GGTCTTCCAG
541  CAGAAGATCG GCGACAGTTA CATCGCCGAG GCATTCAAGG CCGCCCGCGC CGCCGATCCG
601  GACGTCAAGC TCTACTACAA CGACTACAAC ATCGAAGGCA TCGGCCCCAA GAGCGATGCC
661  GTCTACGAGA TGGTGAAGTC CTTCAAGGCC CAGGGCATCC CCATCGACGG CGTCGGCATG
721  CAGGCACATC TGATCGCCGG CCAGGTCCCG GCAAGCCTGC AGGAGAACAT CCGGCGCTTC
781  GCCGACCTGG GCGTCGACGT CGCCCTCACC GAACTCGACA TCCGCATGAC CCTGCCGCGC
841  ACCGCTGCCA AGGATGCCCA GCAGGCCACC GACTACGGTG CCGTGGTCGA GGCATGCCTG
901  GTGGTCTCCC GGTGCGTCGG CATCACCGTC TGGGACTACA CCGACAAGTA CTCCTGGGTC
961  CCCTCCGTCT TCCCGGGCCA GGGTGCCGCC CTGCCATGGG ACGAGGACTT CGCCAAGAAG
1021 CCCGCCTATC ACGCCATCGC CGCCGCGCTC AACGGCGGCA GCCCCGCCCC CGGTGGCAAC
1081 TGCACCGCTA CCTACCGCGT CACCAGCCAG TGGCAGGGCG GCTTCACCGC CGAGATCACC
1141 GTCGGGAACG ACCACACCGC GCCGATTACC GGCTGGACCG TCACCTGGAC GCTGTCCAGT
1201 GGCCAGTCCA TCAGCCACAT GTGGAACGGA AACCTCACCG TCAACGGACA GGACGTCACC
1261 GTCCGCGACG TCGGCTACAA CGGCACCCTC GGCGGCAACG GAAGCACCAC CTTCGGCTTC
1321 CAGGGCGAAG GCGTGGCCGA CACTCCGGCG GACGTGACCT GTACCCCCGG CCGGCCGTCC
1381 GGGACTTCGG CGTAG
SEQ ID NO.6
1    ATGTTCCGCC ACCACCCGAC CCGAGGCCGC CGCACGGCCG GCCTCCTCGC GGCAGCGTTA
61   GCAACCCTGT CGGCCGGCCT GACCGCGGTT GCGCCCGCTC ATCCGGCCCG CGCCGACACC
121  GCCACCCTGG GCGAACTGGC CGAGGCCAAG GGCCGTTACT TCGGCTCCGC CACGGACAAC
181  CCCGAACTGC CCGACACTCA GTACACGCAG ATCCTGGGCA GCGAGTTCAG CCAGATCACC
241  CCCGAAAACA CCATGAAGTG GCAGTACACC GAGCCGTCTC GGGGCCGGTT CGACTACACC
301  GCCGCCGAGG AGATAGTCGA CCTGGCCGAG TCCAACGGCC AGTCGGTGCG CGGACACACC
361  CTGGTGTGGC ACAACCAGCT GCCGAGCTGG GTCGACGACG TGCCGGCCGG TGAGCTCCTC
421  GGGGTCATGC GCGACCACAT CACCCACGAG GTCGACCACT TCAAGGGGCG ACTGATCCAC
481  TGGGACGTGG TCAACGAGGC GTTCGAGGAG GACGGCAGCC GCCGGCAGTC GGTCTTCCAG
541  CAGAAGATCG GCCCCGAGTA CATCGCCGAG GCATTCAAGG CCGCCCGCGC CGCCGATCCG
601  GACGTCAAGC TCTACTACAA CGACTACAAC ATCGAAGGCA TCGGCCCCAA GAGCGATGCC
661  GTCTACGAGA TGGTGAAGTC CTTCAAGGCC CAGGGCATCC CCATCGACGG CGTCGGCATG
721  CAGGCACATC TGATCGCCGG CCAGGTCCCG GCAAGCCTGC AGGAGAACAT CCGGCGCTTC
781  GCCGACCTGG GCGTCGACGT CGCCCTCACC GAACTCGACA TCCGCATGAC CCTGCCGCGC
841  ACCGCTGCCA AGGATGCCCA GCAGGCCACC GACTACGGTG CCGTGGTCGA GGCATGCCTG
901  GTGGTCTCCC GGTGCGTCGG CATCACCGTC TGGGACTACA CCGACAAGTA CTCCTGGGTC
961  CCCTCCGTCT TCCCGGGCCA GGGTGCCGCC CTGCCATGGG ACGAGGACTT CGCCAAGAAG
1021 CCCGCCTATC ACGCCATCGC CGCCGCGCTC AACGGCGGCA GCCCCGCCCC CGGTGGCAAC
1081 TGCACCGCTA CCTACCGCGT CACCAGCCAG TGGCAGGGCG GCTTCACCGC CGAGATCACC
1141 GTCGGGAACG ACCACACCGC GCCGATTACC GGCTGGACCG TCACCTGGAC GCTGTCCAGT
1201 GGCCAGTCCA TCAGCCACAT GTGGAACGGA AACCTCACCG TCAACGGACA GGACGTCACC
1261 GTCCGCGACG TCGGCTACAA CGGCACCCTC GGCGGCAACG GAAGCACCAC CTTCGGCTTC
1321 CAGGGCGAAG GCGTGGCCGA CACTCCGGCG GACGTGACCT GTACCCCCGG CCGGCCGTCC
1381 GGGACTTCGG CGTAG
将上述编码热稳定性改良的木聚糖酶XynAS9-m突变体的cDNA分子以合适的取向和正确的读码框插入到所述载体的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。本发明优选的载体为pPIC9，使改造的木聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoRI和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到各突变体的重组酵母表达质粒。本发明优选的宿主菌为毕赤酵母GS115。
相比于野生型，本发明的两个木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E和V81P/G82E/D185P/S186E的热稳定性明显提高，最适温度较70℃分别提高了20℃和20℃，Tm值分别提高了6.84℃和6.99℃，显示出了在纸浆酿造、生物能源等工业上潜在的应用价值。
附图说明
图1木聚糖酶XynAS9-m突变的Overlap-PCR示意图；
图2为pPIC9载体图谱；
图3为pPIC9-XynAS9-m重组载体图谱
图4为改造前、后的木聚糖酶在不同温度下的酶活曲线图；
图5为改造前、后的木聚糖酶在不同温度处理不同时间后酶活曲线图；
图6为改造前、后的木聚糖酶在不同pH下的酶活曲线图；
图7为改造前、后的木聚糖酶对不同pH的耐受性曲线图。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
（1）Phialophora sp.培养基为马铃薯培养基：1000mL200g土豆煮汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH5.0。
（2）大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0)。
（3）BMGY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，0.00004%Biotin，1%甘油(V/V)。
（4）BMMY培养基：除以0.5%甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH4.0。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1
1、突变基因的获得：
以来源于链霉菌Streptomyces sp.S9的木聚糖酶XynAS9-m的基因序列（SEQ IDNO.2）进行改造，通过Overlap PCR的方式引入突变，并对其进行测序，获得突变基因。
突变包括六条PCR引物：S9BF、S9BR、V81P/G82E-F、V81P/G82E-R、
D185P/S186E-F、D185P/S186E-R。
引物序列如下：
S9BF:5’-TAGAATTCGACACCGCCACCCTGGGCGAACT-3’
S9BR：5’-TATGCGGCCGCCTACGCCGAAGTCCCGGACGGC-3’
V81P/G82E-F:5’-GCCAGATCACCcccgaaAACACCATGAAGT-3’
V81P/G82E-R:5-ACTTCATGGTGTTttcgggGGTGATCTGGC-3’
D185P/S186E-F:5’-AGAAGATCGGCcccgagTACATCG-3’;
D185P/S186E-R:5’-CGATGTActcgggGCCGATCTTCT-3’
下划线代表限制性酶切位点EcoRI和NotI，小写字母表示的为突变碱基重叠延伸PCR法是通过3个PCR反应来完成的。以XynAS9-m-pPIC9质粒为模板，以突变体V81P/G82E为例：
PCR反应体系：
PCR1
PCR1程序设定：
95°C，5min；
94°C，30sec；60°C，30sec；72°C，1min,30个循环；
72°C，10min；10°C，hold。
PCR扩增产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA回收试剂盒进行胶回收，溶于20μLddH2O，命名为V81P/G82E-R。
PCR2
PCR2程序设定：
95°C，5min；
94°C，30sec;60°C，30sec;72°C，1min,30个循环；
72°C，10min；10°C，hold。
PCR扩增产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA回收试剂盒进行胶回收，溶于20μLddH2O,命名为V81P/G82E-F。
PCR3
以PCR1和PCR2反应产物混合后为模板
PCR程序设定：
95°C，5min；
94°C，30sec；60°C，30sec,；72°C，2min,30个循环；
72°C，10min；10°C，hold。
PCR扩增产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳后，切去1.2kb作用的条带，用DNA回收试剂盒进行胶回收，溶于20μL ddH2O。通过DNA测序确定为突变的链霉菌的木聚糖酶基因。
2、木聚糖酶基因XynAS9-m与表达载体的连接
将上述获得突变的XynAS9-m与表达载体pPIC9分别进行限制性内切酶EcoRI/Not I双酶切，酶切条件如下：
37℃水浴酶切处理2h，电泳后分别回收两个目的片段，溶于20μLddH2O。用T4DNA连接酶进行连接，连接体系如下：
室温连接20-30min，电泳检测结果显示有大约9kb的片段，并且用EcoR I/Not I双酶切后发现有1.2kb和8kb左右两条带，说明连接成功，构建得到分别包含V81P/G82E、V81P/G82E/D185P/S186E突变体的pPIC9-XynAS9-m载体（XynAS9-m为定点突变改造后的各木聚糖酶基因的代号）
3、XynAS9-m表达载体转化毕赤酵母GS115及工程菌的筛选
受体感受态细胞的制备：将毕赤酵母GS115菌株在YPD平板上划线，30°C培养48h，挑取生长茁壮的单菌落于20mL YPD液体培养基中，30°C、200rpm摇床培养48h；将活化的新鲜GS115菌液按0.1%的比例接种于200mL的YPD中，200rpm，30°C培养至OD600约为1.0-1.3，放置冰上预冷；将菌液转移至预冷的离心管中，4°C、5000rpm离心5min，弃上清，用200mL预冷的无菌水重悬菌体；将重悬菌体在4°C，5000rpm离心5min，弃上清后沉淀再用100mL预冷的无菌水重悬；将重悬菌体在4°C，5000rpm离心5min，用20mL预冷的1mol/L山梨醇溶液重悬沉淀；将重悬的菌体沉淀在4°C，5000rpm离心5min，用600μL预冷的1mol/L的山梨醇溶液重悬；对重悬细胞悬浮液分别以80μL分装到1.5mL的预冷的EP管中，并保存在-70°C，备用。
电击转化：将电转仪提前开启预热，将线性化的质粒纯化后溶于10μL无菌水，取80μL已制备好的GS115感受态细胞与之混匀，后将其转至预冷的电转杯中；调整电转仪的参数为电压2kV，电击；电击完成后立即加入。0.5-1mL预冷的1mol/L山梨醇，混匀后转移至1.5ml的EP管中，在30℃恒温箱中静置30min后，5000rpm离心3min，弃去部分上清，剩余液体混匀后涂布于MD平板上，30°C倒置培养培养2-3天；
酵母转化子的筛选：将在MD平板上长出的单克隆用灭菌牙签按编号挑至MM上，再点到相应编号的MD平板上；将两平板置于30°C培养箱中培养2天。按编号挑取正常生长的转化子接种于装有3mL BMGY培养基的酵母管中，此酵母管需要提前湿热灭菌且八层纱布包裹，将其置于30°C、220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液置于4400rpm离心10min，去上清，向离心管中加入1mL含有0.5%甲醇的BMMY培养基，在30°C、220rpm诱导培养。诱导培养48h后，将菌液置于12000rpm离心3min，取上清检测活性，从中筛选出具有木聚糖酶活性的转化子；
目的基因在毕赤酵母中摇瓶水平的表达：将含有较高酶活力的阳性菌株接种于400mL BMGY培养基的1L三角瓶中，置于30°C，220rpm摇床培养48h；后将培养液5000rpm离心5min，弃上清，沉淀用200mL含有0.5%甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30°C，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加1mL甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5%，诱导液经离心后上清为突变XynAS9-m的粗酶液，此粗酶液经6KDa中空纤维柱及10KDa超滤膜浓缩后，进一步用丙酮沉淀进行浓缩，再经脱盐柱及阴离子柱纯化后获得与野生型一致的蛋白分子量。
4、本发明所述的突变木聚糖酶活力的测定
1个木聚糖酶的活性单位(U)定义：在一定的条件下，每分钟分解木聚糖释放出1μmol D-木糖的还原糖所需要的酶量。
重组酶反应最适pH和pH稳定性的测定：
将纯化好的重组突变木聚糖酶在60°C下，不同pH的底物中进行酶学反应，以测定其最适pH。所用缓冲液为：pH2.0–7.0的McIlvaine缓冲液(0.2M磷酸氢二钠/0.1M柠檬酸)，pH8.0–9.0的0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液，以及pH10.0–12.0的Gly-NaOH缓冲液。结果（图6）表明各突变酶的最适pH没有太大改变，且作用范围基本一致，只是在缓冲液换取中酶活力有差异。
pH稳定性测定：将浓缩后的纯酶液在不同pH值的缓冲液中置于37°C下处理1h，用各自最适pH的缓冲液作适当稀释，在最适条件下测定剩余酶活性。结果（图7）显示，突变酶的pH耐受性几乎与野生型一致，只是突变酶V81P/G82E与V81P/G82E/D185P/S186E在pH3.0时稳定。氨基酸的取代不影响其最适pH和pH耐受性。
重组酶反应最适温度和热稳定性的测定：
在最适pH的缓冲液中及不同温度下(40–90°C)测定活性以确定最适温度。
耐热性测定为在不同温度下处理不同时间后，再在各自最适条件下测定其剩余酶活力。结果（图4,5）显示，突变酶较原酶的最适温度分别提高了10-20℃，并且在65℃处理60min后，野生型仅剩余9.3%的酶活，而突变酶V81P/G82E与V81P/G82E/D185P/S186E剩余将近83%的酶活，D185P/S186E剩余47%的酶活，70℃处理60min后，V81P/G82E与V81P/G82E/D185P/S186E剩余酶活力是野生型的12倍，即突变酶为64%而野生型为5.9%而已，此外在其他高温条件下处理后，突变酶始终保持高于野生型的剩余酶活力，实验结果显示热稳定性确有显著提高。
重组酶比活、Km值及Vmax的测定重组酶
用不同浓度的木聚糖(0.5，0.75，1.0，2.0，4.0，5.0，6.0、8.0、10.0mg/ml)为底物，在最适条件下测定酶活性，利用双倒数作图法计算出相应的反应速度，Km值及Vmax。
按照Bio-Rad试剂盒的方法，绘制标准曲线。选用蛋白浓度分写为2.0、1.5、1.0、0.75、0.5、0.25和0.125mg/ml，采用5uL（蛋白）和250uL（显色液）的反应体系，室温反应10-60min，在OD595下测定其吸收值绘制标准曲线。比活力的测定方法：首先通过标准曲线计算目的蛋白的含量，其次是在最适条件下测得重组酶的酶活，用酶活数与蛋白浓度的比值即为酶的比活。比活力的定义为：每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数。
表1为改造前、后的木聚糖酶的动力学参数及比活力的比较

Claims (10)

1.一种木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的木聚糖酶的第81位缬氨酸突变为脯氨酸，且第82位甘氨酸突变为谷氨酸。
2.一种木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E/D185P/S186E，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的木聚糖酶的第81位缬氨酸突变为脯氨酸且第82位甘氨酸突变为谷氨酸；第185位的天冬氨酸突变为脯氨酸且第186位的丝氨酸突变为谷氨酸。
3.一种木聚糖酶突变体基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E或权利要求2所述的木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E/D185P/S186E。
4.根据权利要求3所述的木聚糖酶突变体基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5或6所示。
5.包含权利要求3所述木聚糖酶突变体基因的重组载体。
6.包含权利要求3所述木聚糖酶突变体基因的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母。
8.一种制备稳定性改良的木聚糖酶XynAS9-m的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用权利要求5的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组定点突变的木聚糖酶XynAS9-m的表达；以及
3)回收并纯化所表达的定点突变的木聚糖酶XynAS9-m。
9.权利要求1所述的木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E水解木聚糖的应用。
10.权利要求2所述的木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E/D185P/S186E水解木聚糖的应用。
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