CN103060424A - 一种木聚糖酶耐热性与其n端二硫键相关性的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种木聚糖酶耐热性与其N端二硫键相关性的分析方法，属于微生物基因工程技术领域。采用将酶蛋白的一级结构同源比对、同源建模及分子动力学模拟三种生物信息学方法相结合的方案，并结合定点突变实验手段，分析EvXyn11TS的耐热性机理，证明了N端二硫键是影响木聚糖酶耐热性的主要因素之一。该研究结果为其它与EvXyn11TS一级结构相似的、11家族常温高比活性木聚糖酶的耐热性改造奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物信息学和基因工程领域，尤其涉及木聚糖酶EvXyn11TS耐热性与其N端二硫键的相关性的分析、验证，属于微生物基因工程技术领域。
背景技术
由于生物酶催化具有极高的效率、高度的特异性和对环境友好等优点，其已逐渐取代化学催化应用于工业生产过程中。木聚糖酶是木聚糖降解酶系中最重要的酶，广泛应用于造纸、饲料、食品、能源及功能性寡聚木糖生产等诸多工业领域。不同的应用领域需要对应特性的木聚糖酶，如纸浆漂白和饲料加工等过程中要求酶同时具备高催化活性和耐高温的特性，但天然酶通常难以达到这些要求。因此，如何提高耐热酶的比活性或高比活性酶的热稳定性已成为广泛关注的热点。目前主要由两种途径获得耐热酶：一是从嗜热微生物中筛选天然耐热酶，二是对常温高比活性酶进行耐热性改造。就11家族木聚糖酶而言，利用定点突变构建二硫键以提高常温木聚糖酶耐热性的报道较多，如Turunen等人和Jeong等人分别将来源于里氏木霉(Trichoderma reesei)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的11家族木聚糖酶α-螺旋区和β-折叠股A7上特定的氨基酸突变为半胱氨酸以形成二硫键，突变酶的热稳定性均得到了显著的提高。
等的研究结果表明多个二硫键的协同作用能进一步提高11家族木聚糖酶的热稳定性。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用计算机技术与生物信息学相结合的方法对木聚糖酶EvXyn11TS耐热性与其N端二硫键的相关性进行分析。可为与耐热EvXyn11TS的有较高的相似性某些11家族常温高比活性木聚糖酶的耐热性改造提供新的方法。
采用生物信息学预测与实验验证相结合的方案分析和改造酶的耐热性，可减少实验的工作量，本研究采用将酶蛋白的一级结构同源比对、同源建模及分子动力学模拟三种生物信息学方法相结合的方案，并结合定点突变实验手段，分析了EvXyn11TS的耐热性机理。该研究结果也为其它与EvXyn11TS一级结构相似的、11家族常温高比活性木聚糖酶的耐热性改造奠定了基础。对不同来源的、与EvXyn11TS一级结构相似度最高的若干11家族木聚糖酶进行多序列同源比对，发现只有耐热的EvXyn11TS在其N端存在一个二硫键(Cys5-Cys32)；运用分子动力学模拟预测该N端二硫键存在与否对木聚糖酶热稳定性的影响。以人工合成的Syxyn11为母本(GenBank accession no.JX459567)，采用PCR技术将其编码Cys5的密码子TGT突变为编码Thr5的ACT，构建去除了N端二硫键的突变酶(EvXyn11M)的编码基因Syxyn11M；分别将Syxyn11和Syxyn11M在毕赤酵母GS115中进行表达，并分析表达产物EvXyn11TS和EvXyn11M的温度和pH特性。
本发明的技术方案：去二硫键的木聚糖酶EvXyn11M的完整核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
所述的生物信息学方法和基因工程菌的建立及表达方法如下：
(1)木聚糖酶一级结构的同源比对：以耐热木聚糖酶EvXyn11TS为模板，在GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中运用BLAST服务器搜寻与EvXyn11TS一级结构相似度最高的若干11家族木聚糖酶序列；再利用ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/ClustalW)在线程序和DNAMAN 6.0软件对这些酶进行多序列同源比对，寻找EvXyn11TS与其它木聚糖酶在一级结构上所存在的主要差异。
(2)同源建模和分子动力学模拟：以耐热EvXyn11TS晶体结构(PDB:2VUL)作为空间结构建模模板，运用SWISS-MODEL在线程序(http://swiss-model.expasy.org/on-line)对突变酶EvXyn11M进行同源建模。利用GROMACS 4.0程序包(http://www.gromacs.org/)在高温下分别对EvXyn11TS和EvXyn11M结构进行分子动力学(Molecular dynamics，MD)模拟，依据根均方偏差(Root Mean Square Deviation，RMSD)值预测N端二硫键(Cys5-Cys32)存在与否对木聚糖酶耐热性的影响。将得到的RMSD值导入Excel作图，同时应用Origin8软件分析RMSD值的分布，结果见图2。
(3)重组质粒pUCm-T-Syxyn11M的构建：设计将木聚糖酶EvXyn11TS氨基酸序列中的Cys5突变为Thr5，以去除其N端二硫键。根据人工合成的Syxyn11核苷酸序列(GenBankaccession no.JX459567)设计一对PCR突变引物CMT-F和CMT-R，以质粒pUCm-T-Syxyn11为模板，PCR扩增突变酶编码基因Syxyn11M。
(4)木聚糖酶基因的诱导表达：用EcoR I和Not I分别双酶切重组质粒pUCm-T-Syxyn11和pUCm-T-Syxyn11M，割胶回收目的基因条带，与经同样双酶切的pPIC9K连接，获重组表达质粒pPIC9K-Syxyn11和pPIC9K-Syxyn11M，转化E.coli DH5α。测序正确的这两种重组质粒分别用Sal I线性化，电转化P.pastoris GS115，具体操作参照基因脉冲仪(Bio-Rad公司)说明书。重组毕赤酵母的鉴定、多拷贝筛选参照Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手册，其诱导表达及表达产物SDS-PAGE分析。
(5)重组木聚糖酶的分离纯化
重组毕赤酵母经1.0％(v/v)甲醇诱导96h，离心保留上清液，用45％-75％饱和度的(NH4)2SO4分级沉淀，离心收集沉淀，溶于适量20mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.5)，经透析、超滤浓缩(超滤膜的截留分子量为10kDa，Millipore公司)，上样CM-Cellulose CM-52弱阳离子交换柱(1.6cm×20cm)进行纯化。蛋白质含量测定采用Bradford法，以牛血清白蛋白为标准。
(6)木聚糖酶活性的测定
木聚糖酶活性测定采用DNS法。2.4mL 0.5％(w/v)桦木木聚糖溶液(pH 6.0)中加入0.1mL适当稀释的酶液，65℃反应10min，加入2.5mL DNS试剂，沸水浴中显色7min，分光光度计测定OD540。1个酶活性单位(U)定义为每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量。
本发明的有益效果：本发明提供了一种木聚糖酶耐热性与其N端二硫键相关性的分析方法。为其它与EvXyn11TS一级结构相似的、11家族常温高比活性木聚糖酶的耐热性改造奠定了基础。
附图说明
图1：5种不同来源11家族木聚糖酶的多序列同源比对
图2：EvXyn11TS和EvXyn11M分子动力学轨迹及其RMSD值分析
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1木聚糖酶一级结构的同源比对：将耐热EvXyn11TS序列分别与11家族其它木聚糖酶序列进行同源比对，发现其与来源于米曲霉(Aspergillus oryzae，Aor)、黑曲霉(Aspergillus niger，Ani)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii，Aus)和里氏木霉(Trichoderma reesei，Tre)的木聚糖酶同源性最高，分别为64.4％、62.4％、62.4％和54.9％。在E.coli中表达的耐热木聚糖酶EvXyn11TS的最适温度为75℃，在80℃处理15min保留全部酶活性；而其余木聚糖酶的最适温度为50℃-55℃，在45℃-50℃稳定。利用Clustal W在线程序对这些酶的一级结构进行多序列同源比对，结果见图1。由图1可见，它们在N端区域内的同源性相对较低，且仅有耐热EvXyn11TS在其N端存在一个二硫键(Cys5-Cys32)，已被其测定的晶体结构(PDB:2VUL)所证实。
实施例2同源建模和分子动力学模拟：以耐热EvXyn11TS晶体结构(PDB:2VUL)作为空间结构建模模板，运用SWISS-MODEL在线程序(http://swiss-model.expasy.org/on-line)对突变酶EvXyn11M进行同源建模。利用GROMACS 4.0程序包(http://www.gromacs.org/)在高温下分别对EvXyn11TS和EvXyn11M结构进行分子动力学(Molecular dynamics，MD)模拟，MD模拟体系设定为：温度500K，力场GROMOS 96，溶质分子被1.5nm的SPC/E水分子层包裹。MD模拟前，分别对受约束和去约束的溶质分子体系进行两次能量优化，即先采用最陡下降法优化800步，再采用共轭梯度法优化1200步。MD模拟分两步进行：首先在300K对受约束溶质分子进行模拟100ps；再对去约束溶质分子模拟10ns，此阶段温度从300K逐步升高至500K。MD模拟结束后，利用GROMACS 4.0中的g_rms软件计算EvXyn11TS和EvXyn11M的RMSD值。将得到的RMSD值导入Excel作图，同时应用Origin8软件分析RMSD值的分布，结果见图2。从图2-A可知，与EvXyn11M相比，EvXyn11TS到达平衡阶段后其总体RMSD值较低且波动较小。由图2-B可知，在MD模拟过程中，EvXyn11TS的RMSD值集中在0.58
而EvXyn11M的RMSD值则主要分布在0.71
左右，较EvXyn11TS的值提高了22.4％，这表明EvXyn11TS分子去除N端二硫键后，其刚性明显降低。
实施例3重组质粒pUCm-T-Syxyn11M的构建：设计将木聚糖酶EvXyn11TS氨基酸序列中的Cys5突变为Thr5，以去除其N端二硫键。根据人工合成的Syxyn11核苷酸序列(GenBankaccession no.JX459567)设计一对PCR 突变引物，分别为CMT-F：5′-GAATTCAACGCTCAAACT
CTTACCTCTCCAC-3′(下划线部分为EcoR I酶切位点，加框部分为突变密码子)和CMT-R：5′-GCGGCCGCTTAACTAACAGTAATGTCAGA-3′(下划线部分为Not I酶切位点，斜体部分为终止密码子)，由上海Sangon公司合成。PCR条件为：：94℃，预变性2min；30个循环(94℃30s，50℃30s，72℃40s)；72℃，充分延伸10min。以质粒pUCm-T-Syxyn11为模板、CMT-F和CMT-R为引物，PCR扩增突变酶编码基因Syxyn11M。该PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析、割胶回收、与pUCm-T连接，获重组质粒pUCm-T-Syxyn11M，转化E.coli JM109，蓝白斑筛选阳性转化子，送上海Sangon公司测序，测序结果与预期一致。
实施例4木聚糖酶基因的诱导表达：用EcoR I和Not I分别双酶切重组质粒pUCm-T-Syxyn11和pUCm-T-Syxyn11M，割胶回收目的基因条带，与经同样双酶切的pPIC9K连接，获重组表达质粒pPIC9K-Syxyn11和pPIC9K-Syxyn11M，转化E.coli DH5α。测序正确的这两种重组质粒分别用Sal I线性化，电转化P.pastoris GS115，具体操作参照基因脉冲仪(Bio-Rad公司)说明书。重组毕赤酵母的鉴定、多拷贝筛选参照Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手册，其诱导表达及表达产物SDS-PAGE分析。
实施例5重组毕赤酵母经1.0％(v/v)甲醇诱导96h，离心保留上清液，用45％-75％饱和度的(NH4)2SO4分级沉淀，离心收集沉淀，溶于适量20mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.5)，经透析、超滤浓缩(超滤膜的截留分子量为10kDa，Millipore公司)，上样CM-CelluloseCM-52弱阳离子交换柱(1.6cm×20cm)进行纯化。蛋白质含量测定采用Bradford法，以牛血清白蛋白为标准。对纯化样品进行SDS-PAGE分析，纯化的目的蛋白EvXyn11TS和EvXyn11M均在31kDa处(表观分子量)显示单一条带，且大于理论分子量21.24kDa。经NetNGlyc在线程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)预测，在EvXyn11TS和EvXyn11M的一级结构中均含有三个潜在的N-糖基化位点，使得这两种酶在毕赤酵母表达过程中分别发生糖基化作用，提高了它们的表观分子量。
实施例6木聚糖酶学性质的分析
温度对酶活性的影响在不同温度(55℃-90℃)下，用DNS法测定EvXyn11TS和EvXyn11M活性。最适温度Topt定义为最高酶活性(以相对活性100％计)所对应的温度。将酶液置于不同温度下保温0min-60min，测定残余酶活性，未处理酶液(0min)的酶活性以100％计。酶的半衰期t1/2定义为残余酶活性为50％时的保温时间。酶学性质结果显示EvXyn11M的Topt为70℃，较EvXyn11TS的Topt(85℃)下降了15℃。说明EvXyn11TS N端二硫键的去除显著降低了其最适温度Topt。EvXyn11TS具有很好的热稳定性，80℃处理60min保留全部酶活性；在90℃的半衰期t1/2 90长达32min，保温60min保留25％酶活性。将EvXyn11M在50℃、60℃处理60min，其残余酶活性分别为98％和50％；在70℃的半衰期t1/2 70仅为8.0min，保温40min酶活性几乎完全丧失。EvXyn11TS和EvXyn11M热稳定性的测定和分析结果表明，N端二硫键的存在对EvXyn11TS的高热稳定性起到了关键的作用。
pH对酶活性的影响用不同pH值(pH 4.0-pH 8.0)、50mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制0.5％(w/v)木聚糖溶液，以DNS法测定EvXyn11TS和EvXyn11M活性。最适pH定义为最高酶活性所对应的pH值。将酶液在不同pH值(柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液：pH 3.5-pH8.0；甘氨酸-氢氧化纳缓冲液：pH 8.5-pH 10.0)、40℃保温60min，测定残余酶活性。酶的pH稳定性定义为残余酶活性在85％以上的pH范围。EvXyn11TS和EvXyn11M的最适pH均为6.5，当pH＜5.5或pH＞7.5时，酶活性下降较快；该两种酶在pH 4.0-pH 9.5范围内稳定。分析结果表明，EvXyn11TS突变前后的pH特性保持一致。
Claims (5)
1.在不同来源的、与EvXyn11TS一级结构相似度较高的若干11家族木聚糖酶中，只有耐热的EvXyn11TS在其N端存在一个二硫键(Cys5-Cys32)，是通过对其氨基酸序列进行多序列同源比对发现的。
2.运用了分子动力学模拟预测该N端二硫键存在与否对木聚糖酶热稳定性的影响；以耐热EvXyn11TS晶体结构(PDB:2VUL)作为空间结构建模模板，运用SWISS-MODEL在线程序(http://swiss-model.expasy.org/on-line)对突变酶EvXyn11M进行同源建模；利用GROMACS4.0程序包(http://www.gromacs.org/)在高温下分别对EvXyn11TS和EvXyn11M结构进行分子动力学(Molecular dynamics，MD)模拟，依据根均方偏差(Root Mean Square Deviation，RMSD)值预测N端二硫键(Cys5-Cys32)存在与否对木聚糖酶耐热性的影响。
3.运用定点突变的方法进一步验证了二硫键的存在与否对木聚糖酶耐热性的影响；以人工合成的Syxyn11为母本，采用PCR技术将其编码Cys5的密码子TGT突变为编码Thr5的ACT，构建去除了N端二硫键的突变酶(EvXyn11M)的编码基因Syxyn11M。
4.定点突变后的突变酶(EvXyn11M)的编码基因Syxyn11M和原耐热酶基因Syxyn11在毕赤酵母GS115中进行表达，表达产物EvXyn11TS和EvXyn11M的温度和温度稳定性如下所述：EvXyn11M的Topt为70℃，较EvXyn11TS的Topt(85℃)下降了15℃；EvXyn11TS具有很好的热稳定性，80℃处理60min保留全部酶活性；在90℃的半衰期t1/2 90长达32min，保温60min保留25％酶活性；将EvXyn11M在50℃、60℃处理60min，其残余酶活性分别为98％和50％；在70℃的半衰期t1/2 70仅为8.0min，保温40min酶活性几乎完全丧失。
5.采用将酶蛋白的一级结构同源比对、同源建模及分子动力学模拟三种生物信息学方法相结合的方案，并结合定点突变实验手段，分析EvXyn11TS的耐热性机理。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130424 |