CN105838692B - 来源于黑曲霉nl-1木聚糖酶的多位点突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
来源于黑曲霉NL‑1木聚糖酶的多位点突变体及其应用，所述多位点突变体含有如下8个突变位点中的至少6个，其中N28突变为H，N29突变为D，Y45突变为M，N47突变为L，S58突变为H，D76突变为R，G116突变为C，Y135突变为C。突变体使得黑曲霉NL‑1木聚糖酶的耐热耐碱性能得到显著提升。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学及酶工程领域，具体涉及来源于黑曲霉NL‐1木聚糖酶的多位点突变体及其应用。
背景技术
木聚糖酶是将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一类酶的总称，在制浆造纸、燃料乙醇、植物纤维原料生物转化、饲料、食品等领域中有着广阔的应用前景。应用于不同领域中的木聚糖酶不但需要具备高活力、低成本的共性以外，还需要具有与实际应用环境相适应的特定的酶学特性。作为生物漂白助剂，木聚糖酶不但可以提高纸浆白度，降低卡伯值，改善纤维滤水性和纸浆的物理强度，而且可以大大减少后续化学漂剂的用量及其对环境产生的污染。为此，国内外众多学者对木聚糖酶的纸浆漂白进行了深入的研究，取得了卓有成效的多项成果。但木聚糖酶在纸浆漂白工业中进行规模化推广应用的主要障碍和技术瓶颈仍然存在：(1)现有菌株产木聚糖酶的活力不够高，直接导致了使用成本较高。(2)通过传统发酵制备的木聚糖酶产品中，大都含有较高活力的纤维素酶，使用过程中易引起纸浆黏度和纤维强度的下降。(3)目前具备规模化生产的木聚糖酶基本上都是适合于在低温、酸性条件下发挥作用，其温度及pH值等酶学特性与纸浆漂白的实际环境(偏碱性，较高温度)不吻合，致使酶使用效率大大降低。如果要适应这类酶的反应要求，企业就必须增加冷却和中和设施,这大大增加了酶的使用成本,并且延长了生产周期。
本课题组在研究中克隆表达了黑曲霉NL-1来源的木聚糖酶基因xynB，通过优化密码子，改变G+C含量，提高mRNA二级结构稳定性，得到了优化后的木聚糖酶基因MxynB，并构建重组质粒pPICZαA-MxynB，使其表达水平大幅提高，摇瓶最高酶活力达到1408U/mL。在5L发酵罐中进行高密度发酵，酶的最大活力和胞外可溶性蛋白分别达到20424.2U/ml和584mg/L，远远高于到目前为止国内外报导的最好水平。但该酶的最适反应pH 4.5，温度大于60℃条件下该酶不稳定，其温度及pH值等酶学特性与纸浆漂白的实际环境不吻合。由此可见，在保持该酶高活力的基础上，提高该酶的热稳定性和耐碱性能，尽量靠近实际应用环境条件，将有望大幅提高该酶使用效果。
通过蛋白质工程对酶进行定点突变可以改良其酶学性质。Georis等人构建了来源于Streptomyces sp.的木聚糖酶Xyl 1和来源于T.fusca的木聚糖酶TfxA的分子模型，两种木聚糖酶同属于G/11家族糖苷水解酶类。通过定点突变证明了TfxA的热稳定区主要在N末端。三维结构对比后，他们将TfxA中的嗜热结构用定点突变的方法引入Xyl 1，得到的突变酶比原酶最适反应温度提高了10℃，57℃时突变酶的热稳定性提高了6倍。Yang Hao Meng等通过N端替换，对来自S.olivaceoviridis的木聚糖酶基因xyn B进行改良，突变后的融合木聚糖酶在70℃，pH 6.0热处理20min的条件下，热稳定性提高了6倍，半衰期提高到20min。研究还表明，一些木聚糖酶的稳定性与其表面的精氨酸含量有关。嗜热酶蛋白表面都有较高的精氨酸含量，同时，精氨酸与赖氨酸含量比值的升高也使木聚糖酶在碱性条件下的酶活提高。研究显示在G/11家族的木聚糖酶三维结构中存在一个保守的“Ser/Thr”平面，该平面富含丝氨酸和苏氨酸。Turunen等人对来源于T.ressei的G/11家族木聚糖酶XYNⅡ的该平面引入5个Arg点突变时，酶在65℃的半衰期提高4～5倍，最适pH也有所提高。Ji Hye Yang等利用同源建模和分子模型分析，根据最适pH与活性位点电子势能之间的关系对来源于B.circulans木聚糖酶进行改造，确定突变方案K175Q、Q167M、R73V。突变酶Q167M最适催化反应pH较原酶向碱性偏移了2个单位。
虽然通过定点突变可以提高木聚糖酶的热稳定性和耐碱性，但国内外进行定点突变的木聚糖酶的表达水平不高。如何保持酶的比活力和实现酶的超量表达对上述突变酶依然是巨大的挑战。另一方面，针对特定的木聚糖酶(黑曲霉NL-1木聚糖酶)如何选择合适的突变位点，使其在提高热稳定和耐碱性能的同时，还保持其优异的催化性能，需要对酶进行同源建模，并设计大量的突变位点，找到符合要求的突变位点进行改造。
本研究将对已经实现超量表达的黑曲霉NL-1木聚糖酶基因MxynB为研究对象，对其进行定点突变，提高其耐热、耐碱性能。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供了一种来源于黑曲霉NL-1(AspergiLLus niger NL-1)木聚糖酶的多位点突变体及其在提升黑曲霉NL-1木聚糖酶耐热耐碱性能中的应用。
技术方案：来源于黑曲霉NL-1木聚糖酶的多位点突变体，所述多位点突变体含有如下8个突变位点中的至少6个，其中N28突变为H，N29突变为D，Y45突变为M，N47突变为L，S58突变为H，D76突变为R，G116突变为C，Y135突变为C。
突变体1(MxynB-116-135-58-76-28-45-47)：在MxynB基础上对其G116突变为C，Y135突变为C，S58突变为H，D76突变为R，N28突变为H，Y45突变为M和N47突变为L。
所述突变体的核酸序列如SEQ ID NO:6所示。
突变体2(MxynB-116-135-76-28-45-47)：在MxynB基础上对其G116突变为C，Y135突变为C，D76突变为R，N28突变为H，Y45突变为M和N47突变为L。
所述突变体的核酸序列如SEQ ID NO:7所示。
突变体3(MxynB-116-135-76-28-29-45-47)：在MxynB基础上对其G116突变为C，Y135突变为C，D76突变为R，N28突变为H，N29突变为D，Y45突变为M和N47突变为L。
所述突变体的核酸序列如SEQ ID NO:8所示。
突变体4(MxynB-116-135-58-76-28-29-45-47)：在MxynB基础上对其G116突变为C，Y135突变为C，S58突变为H，D76突变为R，N28突变为H，N29突变为D，Y45突变为M和N47突变为L。
所述突变体的核酸序列如SEQ ID NO:9所示。
所述突变体在提升黑曲霉NL-1木聚糖酶耐热耐碱性能中的应用。
有益效果：
1.重组酶MxynB-116-135-58-76-28-45-47，MxynB-116-135-76-28-45-47，MxynB-116-135-76-28-29-45-47和MxynB-116-135-58-76-28-29-45-47温度稳定性相对于原酶MxynB大幅提高，MxynB-116-135-58-76-28-45-47和MxynB-116-135-58-76-28-29-45-47在70℃下保温60min，仍能达到65％以上的剩余酶活力，较原酶提高了570％。
2.重组木聚糖酶MxynB-116-135-76-28-45-47，MxynB-116-135-76-28-29-45-47和MxynB-116-135-58-76-28-29-45-47最适反应pH由原来的4.5提高至5.5-6.0，重组木聚糖酶MxynB-116-135-76-28-45-47，MxynB-116-135-76-28-29-45-47和MxynB-116-135-58-76-28-29-45-47在pH 5.0-7.0的范围内，稳定性较原酶大幅提高，分别提高了120％-194％不等。
附图说明
图1为原酶及突变木聚糖酶的氨基酸序列比对图，SEQ ID NO:1表示MxynB，SEQ IDNO:2表示MxynB-116-135，SEQ ID NO:3表示MxynB-116-135-58，SEQ ID NO:4表示MxynB-116-135-58-76，SEQ ID NO:5表示MxynB-116-135-76，SEQ ID NO:6表示MxynB-116-135-58-76-28-45-47，SEQ ID NO:7表示MxynB-116-135-76-28-45-47，SEQ ID NO:8表示MxynB-116-135-76-28-29-45-47，SEQ ID NO:9表示MxynB-116-135-58-76-28-29-45-47；
图2为原酶及突变木聚糖酶温度稳定性比较图；
图3为原酶及突变木聚糖酶pH稳定性比较图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅为本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细阐述，其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到；如无特殊说明，实施例中涉及的具体操作参见《分子克隆实验指南第三版》。
一系列的突变木聚糖酶基因，其核酸序列如下表所示。
突变基因
包含上述核苷酸序列的系列重组质粒。
包含上述核苷酸序列的系列重组质粒pTrc-MxynB-116-135，pTrc-MxynB-116-135-58，pTrc-MxynB-116-135-58-76，pTrc-MxynB-116-135-76，pTrc-MxynB-116-135-58-76-28-45-47， pTrc-MxynB-116-135-76-28-45-47，pTrc-MxynB-116-135-76-28-29-45-47，pTrc-MxynB-116-135-58-76-28-29-45-47。
包含上述SEQ ID NO:2的重组质粒pTrc-MxynB-116-135制备方法，构建步骤为：以实验已经构建的，携带MxynB基因的重组质粒pPICZαA-MxynB为模板，设计引物PCR扩增获得基因，并克隆到pTrc-99a，获得重组质粒pTrc-MxynB，以重组质粒pTrc-MxynB为模板，进一步利用反向PCR对G116C和Y135C进行突变，获得携带有突变基因SEQ ID NO:2的重组质粒pTrc-MxynB-116-135。
包含上述SEQ ID NO:3的重组质粒pTrc-MxynB-116-135-58制备方法，构建步骤为：以重组质粒pTrc-MxynB-116-135为模板，利用反向PCR对S58H进行突变，获得携带有突变基因SEQ ID NO:3的重组质粒pTrc-MxynB-116-135-58。
包含上述SEQ ID NO:4的重组质粒pTrc-MxynB-116-135-58-76制备方法，构建步骤为：以重组质粒pTrc-MxynB-116-135-58为模板，利用反向PCR对D76R进行突变，获得携带有突变基因SEQ ID NO:4的重组质粒pTrc-MxynB-116-135-58-76。
包含上述SEQ ID NO:5的重组质粒pTrc-MxynB-116-135制备方法，构建步骤为：以重组质粒pTrc-MxynB-116-135为模板，利用反向PCR对D76R进行突变，获得携带有突变基因SEQ ID NO:5的重组质粒pTrc-MxynB-116-135-76。
包含上述SEQ ID NO:6的重组质粒pTrc-MxynB-116-135-58-76-28-45-47制备方法，构建步骤为：以重组质粒pTrc-MxynB-116-135-58-76为模板，利用反向PCR对N28H，Y45M和N47L进行突变，获得携带有突变基因SEQ ID NO:6的重组质粒pTrc-MxynB-116-135-58-76-28-45-47。
包含上述SEQ ID NO:7的重组质粒pTrc-MxynB-116-135-76-28-45-47制备方法，构建步骤为：以重组质粒pTrc-MxynB-116-135-76为模板，利用反向对N28H，Y45M和N47L进行突变，获得携带有突变基因SEQ ID NO:7的重组质粒pTrc-MxynB-116-135-76-28-45-47。
包含上述SEQ ID NO:8的重组质粒pTrc-MxynB-116-135-76-28-29-45-47制备方法，构建步骤为：以重组质粒pTrc-MxynB-116-135-76-28-45-47为模板，利用反向对N29D进行突变，获得携带有突变基因SEQ ID NO:8的重组质粒pTrc-MxynB-116-135-76-28-29-45-47。
包含上述SEQ ID NO:9的重组质粒pTrc-MxynB-116-135-58-76-28-29-45-47制备方法，构建步骤为：以重组质粒pTrc-MxynB-116-135-76-28-29-45-47为模板，利用反向对S58H进行突变，获得携带有突变基因SEQ ID NO:9的重组质粒pTrc-MxynB-116-135-58-76-28-29-45-47。
将上述重组质粒转化大肠杆菌。
实施例中所用的DNA聚合酶(Ex Taq和PrimeSTAR HS DNA Polymerase)、脱氧核糖核酸(dNTP)、连接酶(T4DNA ligase)、内切酶(EcoRI、XbaI)、磷酸化酶(T4PolynucleotideKinase)以及相关的缓冲液都是购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)。
实施例1：
1.重组质粒pTrc‐MxynB的构建及突变位点的确定
为了使基因MxynB能在原核表达体系大肠杆菌中表达，根据已知的木聚糖酶基因MxynB序列分别设计引物，为了能正确插入表达载体，设计引物时分别在上下游引入EcoRI和XbaI限制性酶切位点，为了提高酶切效率，两端需加入保护碱基(重组质粒pTrc‐MxynB构建过程)。如下表：
表1重组质粒构建引物
以携带MxynB基因的重组质粒pPICZαA‐MxynB为模板，分别用引物对MxynB f1和MxynB r1进行PCR扩增。得到含有酶切位点的MxynB cDNA全序列(MxynB)，PCR反应液配制及反应条件如下：
表2PCR反应液的配制
混匀后按下表反应条件进行PCR。
表3PCR反应条件
目的片段的回收：按照Biomiga公司DNA凝胶回收试剂盒说明书进行操作。
目的基因的双酶切：参照TaKaRa目录上的双酶切反应时的通用缓冲液使用表，由于EcoRI和XbaI双酶切时有通用buffer 1×M，采用同步酶切法对目的片段进行双酶切，酶切体系如下：
表4目的片段双酶切体系(50μL)
表5表达载体双酶切体系(20μL)
混匀后37℃酶切3h，电泳检测并对酶切产物进行割胶回收。
将EcoRⅠ和XbaⅠ酶切后的MxynB基因与表达载体pTrc‐99a浓缩后，16℃连接3h。
表6表达载体与目的基因的连接体系(10μL)
将连接液转化大肠杆菌感受态细胞Top10F’，转化液涂布于氨苄青霉素(Amp，购自Sigma公司)(终浓度为50μg/mL)的LB平板，37℃恒温倒置培养12‐16h。
从含Amp的LB平板中随机挑选1‐2个单菌落，转接到含Amp(终浓度为100μg/mL)的LB液体培养基中，在37℃，180r/min培养过夜。然后提取表达质粒，并进行双酶切验证后测序。质粒双酶切鉴定体系如下表。获得重组质粒pTrc‐MxynB。
表7重组质粒双酶切鉴定体系(20μL)
目的基因要成功表达必须相应的RNA聚合酶与启动子结合才能使转录进行。因此将测序正确的重组表达质粒pTrc‐MxynB转化大肠杆菌BL21condon plus(DE3)。以pTrc‐99a空载转化各相应宿主作为对照。
研究表明木聚糖酶蛋白结构内部的二硫键和酶蛋白表面的精氨酸、碱性氨基酸的含量及活性位点氨基酸的电子势能都与木聚糖酶的温度稳定性和pH稳定性密切相关。通过同源建模，获得黑曲霉NL‐1木聚糖酶的三维结构，基于上述理论设计突变位点，利用生物信息学软件Discovery Studio对虚拟突变位点的突变能进行分析，筛选突变势能较低的突变位点及组合作为研究对象，最终确定的突变位点为G116C，Y135C，S58H，D76R，N28H，N29D，Y45M和N47L。
突变引物设计：利用生物信息学分析及同源建模比对，改变木聚糖酶MxynB分子部分氨基酸，设计突变点。利用反向PCR技术获得突变序列，每个突变位点设计正反两条寡核苷酸序列。突变位点选用酵母偏爱密码子，突变引物如下表。
表8定点突变引物表
2.携带突变基因的系列重组质粒的构建
2.1重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135的构建
以重组质粒pTrc‐MxynB为模板，进一步利用反向PCR对G116C和Y135C进行突变，获得携带有突变基因SEQ ID NO:2的重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135。
表9反向PCR反应液的配制(共50μL)
表10反向PCR反应条件
PCR片段5’末端磷酸化反应配制如下表，于37℃下反应1h。
表11磷酸化反应液的配制
37℃磷酸化后，加入1μL T4ligase，16℃连接3h。质粒DNA转化，挑选异变体，通过测序鉴定。
2.2重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135‐58的构建
以重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135为模板，利用反向PCR对S58H进行突变，获得携带有突变基因SEQ ID NO:3的重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135‐58。
表12反向PCR反应液的配制(共50μL)
表13反向PCR反应条件
PCR片段5’末端磷酸化反应配制如下表，于37℃下反应1h。
表14磷酸化反应液的配制
37℃磷酸化后，加入1μL T4ligase，16℃连接3h。质粒DNA转化，挑选异变体，通过测序鉴定。
2.3重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135‐58‐76的构建
以重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135‐58为模板，利用反向PCR对D76R进行突变，获得携带有突变基因SEQ ID NO:4的重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135‐58‐76。
表15反向PCR反应液的配制(共50μL)
表16反向PCR反应条件
PCR片段5’末端磷酸化反应配制如下表，于37℃下反应1h。
表17磷酸化反应液的配制
37℃磷酸化后，加入1μL T4ligase，16℃连接3h。质粒DNA转化，挑选异变体，通过测序鉴定。
2.4重组质粒pTrc‐MxynB‐166‐135‐76的构建
以重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135为模板，利用反向PCR对D76R进行突变，获得携带有突变基因SEQ ID NO:5的重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135‐76。
表18反向PCR反应液的配制(共50μL)
表19反向PCR反应条件
PCR片段5’末端磷酸化反应配制如下表，于37℃下反应1h。
表20磷酸化反应液的配制
37℃磷酸化后，加入1μL T4ligase，16℃连接3h。质粒DNA转化，挑选异变体，通过测序鉴定。
2.5重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135‐58‐76‐28‐45‐47的构建
以重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135‐58‐76为模板，利用反向PCR对N28H，Y45M和N47L进行突变，获得携带有突变基因SEQ ID NO:6的重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135‐58‐76‐28‐45‐47。
表21反向PCR反应液的配制(共50μL)
表22反向PCR反应条件
PCR片段5’末端磷酸化反应配制如下表，于37℃下反应1h。
表23磷酸化反应液的配制
37℃磷酸化后，加入1μL T4ligase，16℃连接3h。质粒DNA转化，挑选异变体，通过测序鉴定。
2.6重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135‐28‐45‐47的构建
以重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135‐76为模板，利用反向对N28H，Y45M和N47L进行突变，获得携带有突变基因SEQ ID NO:7的重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135‐76‐28‐45‐47。
表24反向PCR反应液的配制(共50μL)
表25反向PCR反应条件
PCR片段5’末端磷酸化反应配制如下表，于37℃下反应1h。
表26磷酸化反应液的配制
37℃磷酸化后，加入1μL T4ligase，16℃连接3h。质粒DNA转化，挑选异变体，通过测序鉴定。
2.7重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135‐28‐29‐45‐47的构建
以重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135‐76‐28‐45‐47为模板，利用反向对N29D进行突变，获得携带有突变基因SEQ ID NO:8的重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135‐76‐28‐29‐45‐47。
表27反向PCR反应液的配制(共50μL)
表28反向PCR反应条件
PCR片段5’末端磷酸化反应配制如下表，于37℃下反应1h。
表29磷酸化反应液的配制
37℃磷酸化后，加入1μL T4ligase，16℃连接3h。质粒DNA转化，挑选异变体，通过测序鉴定。
2.8重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135‐58‐76‐28‐29‐45‐47的构建
以重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135‐76‐28‐29‐45‐47为模板，利用反向对S58H进行突变，获得携带有突变基因SEQ ID NO:9的重组质粒pTrc‐MxynB‐116‐135‐58‐76‐28‐29‐45‐47。
表30反向PCR反应液的配制(共50μL)
表31反向PCR反应条件
PCR片段5’末端磷酸化反应配制如下表，于37℃下反应1h。
表32磷酸化反应液的配制
37℃磷酸化后，加入1μL T4ligase，16℃连接3h。质粒DNA转化，挑选异变体，通过测序鉴定。
3.重组酶的表达及纯化
将测序正确的重组表达质粒pTrc-MxynB，pTrc-MxynB-116-135，pTrc-MxynB-116-135-58，pTrc-MxynB-116-135-58-76，pTrc-MxynB-116-135-76，pTrc-MxynB-116-135-58-76-28-45-47，pTrc-MxynB-116-135-76-28-45-47，pTrc-MxynB-116-135-76-28-29-45-47，pTrc-MxynB-116-135-58-76-28-29-45-47。转化大肠杆菌BL21condon plus(DE3)。
热击转化：取1μL重组质粒与80μL BL21condon plus(DE3)感受态细胞混合，冰浴30min，42℃热击2min，然后冰上放置5min，立即与800μL提前预热的SOC液体培养基(胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％(pH控制在中性))混合，37℃摇床震荡培养40min左右，涂布在含有Amp的LB培养皿上，37℃培养12-16h。
热击转化后，挑取单菌落接种到5mL的LB液体培养基(胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％(pH控制在中性)，含100μg/mL Amp)中，180r/min，37℃培养过夜。将新鲜菌液以1％接种量转接于150mL LB液体培养基，37℃培养至OD值达到0.8，加入IPTG至终浓度为0.01mM，于37℃摇床，180r/min诱导培养4h。4℃，10000rpm离心收集菌体，加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗涤两次，再用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液悬浮，然后用高压破碎仪破细胞，10000r/min，4℃离心10min，取上清，进行Ni柱亲和层析纯化。
4.重组酶的酶学性质分析
4.1木聚糖酶酶活测定
以Beechwood木聚糖(购自Sigma公司)为底物，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法。反应体系包括1mL 50mM pH 5.0缓冲液，0.5mL 1％底物，混匀预热后加入0.5mL稀释酶液，50℃反应30min。然后加入3.0mL DNS溶液煮沸5min，立即冷却后用蒸馏水定容至25mL，混匀后在550nm条件下比色测定。同时做有酶液无底物的对照和有底物无酶液的对照。
一个酶活单位(U)定义为：在50℃、pH 5.0的条件下，水解1％Beechwood木聚糖每分钟 释放1μmol还原糖所需的酶量。
对照标准曲线，计算酶活：
内切木聚糖酶酶活(U/mL)＝c/(t×V×0.15)×N
c：由DNS标准方程计算出的酶反应后的木糖含量(mg)；
t：酶与底物反应时间(min)；
V：酶反应时酶液的体积(mL)；
N：酶液稀释倍数；
0.15：1μmol木糖相当于0.15mg木糖(0.15mg/μmol)。
4.2温度稳定性
将重组木聚糖酶在pH 5.0下，分别于50℃、60℃和70℃条件下保温60min后，按照标准方法在50℃、pH 5.0下测定其残余酶活性，以不进行热处理的重组木聚糖酶的酶活性为相对100％，测定结果如图2所示。
4.3pH稳定性
在不含底物的情况下，将重组木聚糖酶置于不同的pH值(4-7)的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中，在4℃下处理24h，在pH5.0，50℃条件下测定其残余酶活性，以不经过pH处理的酶液活性为100％，测定结果如图3所示。
由上可知，重组酶MxynB-116-135-58-76-28-45-47，MxynB-116-135-76-28-45-47，MxynB-116-135-76-28-29-45-47和MxynB-116-135-58-76-28-29-45-47温度稳定性相对于原酶MxynB大幅提高，MxynB-116-135-58-76-28-45-47和MxynB-116-135-58-76-28-29-45-47在70℃下保温60min，仍能达到65％以上的剩余酶活力，较原酶提高了570％。
重组木聚糖酶MxynB-116-135-76-28-45-47，MxynB-116-135-76-28-29-45-47和MxynB-116-135-58-76-28-29-45-47在pH 5.0-7.0的范围内，稳定性较原酶大幅提高，分别提高了120％-194％不等。
5.重组酶的碱基序列
SEQ ID NO:1：MxynB
SEQ ID NO:2：MxynB‐116‐135
SEQ ID NO:3：MxynB‐116‐135‐58
SEQ ID NO:4：MxynB‐116‐135‐58‐76
SEQ ID NO:5：MxynB‐116‐135‐76
SEQ ID NO:6：MxynB‐116‐135‐58‐76‐28‐45‐47
SEQ ID NO:7：MxynB‐116‐135‐76‐28‐45‐47
SEQ ID NO:8：MxynB‐116‐135‐76‐28‐29‐45‐47
SEQ ID NO:9：MxynB‐116‐135‐58‐76‐28‐29‐45‐47
。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京林业大学
<120> 来源于黑曲霉NL-1木聚糖酶的多位点突变体及其应用
<130>
<160> 25
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 642
<212> DNA
<213> AspergiLLus niger NL-1
<400> 1
gttcctcacg actccgttgt tgaaagatca gatgctttgc ataagctttc agaaagaagt 60
acaccatctt ccaccggaga gaacaatggt ttttactata gtttctggac tgatggtgga 120
ggtgacgtta catacaccaa cggagatgct ggttcatata cagtcgaatg gagtaacgtt 180
ggtaattttg tcggaggtaa aggatggaac ccaggttccg cccaagacat tacttactct 240
ggaactttca caccttccgg aaatggttac ttgtcagttt atggttggac tacagatcca 300
cttatcgaat actacatcgt tgagagttac ggagactata atcctggttc tggaggtact 360
tacaagggaa ccgttacttc tgatggttcc gtctacgaca tctacacagc caccagaact 420
aacgctgcct ccatccaggg tacagcaacc tttactcaat attggtcagt tagacagaat 480
aagagagttg gaggtactgt caccacttct aaccatttca atgcatgggc taaattggga 540
atgaaccttg gtactcacaa ttatcaaatc gtcgcaacag agggttacca aagttcagga 600
agtagttcta ttacagttca gcaccatcat catcatcatt ag 642
<210> 2
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gttcctcacg actccgttgt tgaaagatca gatgctttgc ataagctttc agaaagaagt 60
acaccatctt ccaccggaga gaacaatggt ttttactata gtttctggac tgatggtgga 120
ggtgacgtta catacaccaa cggagatgct ggttcatata cagtcgaatg gagtaacgtt 180
ggtaattttg tcggaggtaa aggatggaac ccaggttccg cccaagacat tacttactct 240
ggaactttca caccttccgg aaatggttac ttgtcagttt atggttggac tacagatcca 300
cttatcgaat actacatcgt tgagagttac ggagactata atccttgttc tggaggtact 360
tacaagggaa ccgttacttc tgatggttcc gtctacgaca tctgtacagc caccagaact 420
aacgctgcct ccatccaggg tacagcaacc tttactcaat attggtcagt tagacagaat 480
aagagagttg gaggtactgt caccacttct aaccatttca atgcatgggc taaattggga 540
atgaaccttg gtactcacaa ttatcaaatc gtcgcaacag agggttacca aagttcagga 600
agtagttcta ttacagttca gcaccatcat catcatcatt ag 642
<210> 3
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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acaccatctt ccaccggaga gaacaatggt ttttactata gtttctggac tgatggtgga 120
ggtgacgtta catacaccaa cggagatgct ggttcatata cagtcgaatg gcacaacgtt 180
ggtaattttg tcggaggtaa aggatggaac ccaggttccg cccaagacat tacttactct 240
ggaactttca caccttccgg aaatggttac ttgtcagttt atggttggac tacagatcca 300
cttatcgaat actacatcgt tgagagttac ggagactata atccttgttc tggaggtact 360
tacaagggaa ccgttacttc tgatggttcc gtctacgaca tctgtacagc caccagaact 420
aacgctgcct ccatccaggg tacagcaacc tttactcaat attggtcagt tagacagaat 480
aagagagttg gaggtactgt caccacttct aaccatttca atgcatgggc taaattggga 540
atgaaccttg gtactcacaa ttatcaaatc gtcgcaacag agggttacca aagttcagga 600
agtagttcta ttacagttca gcaccatcat catcatcatt ag 642
<210> 4
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gttcctcacg actccgttgt tgaaagatca gatgctttgc ataagctttc agaaagaagt 60
acaccatctt ccaccggaga gaacaatggt ttttactata gtttctggac tgatggtgga 120
ggtgacgtta catacaccaa cggagatgct ggttcatata cagtcgaatg gcacaacgtt 180
ggtaattttg tcggaggtaa aggatggaac ccaggttccg cccaacgcat tacttactct 240
ggaactttca caccttccgg aaatggttac ttgtcagttt atggttggac tacagatcca 300
cttatcgaat actacatcgt tgagagttac ggagactata atccttgttc tggaggtact 360
tacaagggaa ccgttacttc tgatggttcc gtctacgaca tctgtacagc caccagaact 420
aacgctgcct ccatccaggg tacagcaacc tttactcaat attggtcagt tagacagaat 480
aagagagttg gaggtactgt caccacttct aaccatttca atgcatgggc taaattggga 540
atgaaccttg gtactcacaa ttatcaaatc gtcgcaacag agggttacca aagttcagga 600
agtagttcta ttacagttca gcaccatcat catcatcatt ag 642
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<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gttcctcacg actccgttgt tgaaagatca gatgctttgc ataagctttc agaaagaagt 60
acaccatctt ccaccggaga gaacaatggt ttttactata gtttctggac tgatggtgga 120
ggtgacgtta catacaccaa cggagatgct ggttcatata cagtcgaatg gagtaacgtt 180
ggtaattttg tcggaggtaa aggatggaac ccaggttccg cccaacgcat tacttactct 240
ggaactttca caccttccgg aaatggttac ttgtcagttt atggttggac tacagatcca 300
cttatcgaat actacatcgt tgagagttac ggagactata atccttgttc tggaggtact 360
tacaagggaa ccgttacttc tgatggttcc gtctacgaca tctgtacagc caccagaact 420
aacgctgcct ccatccaggg tacagcaacc tttactcaat attggtcagt tagacagaat 480
aagagagttg gaggtactgt caccacttct aaccatttca atgcatgggc taaattggga 540
atgaaccttg gtactcacaa ttatcaaatc gtcgcaacag agggttacca aagttcagga 600
agtagttcta ttacagttca gcaccatcat catcatcatt ag 642
<210> 6
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gttcctcacg actccgttgt tgaaagatca gatgctttgc ataagctttc agaaagaagt 60
acaccatctt ccaccggaga gcacaatggt ttttactata gtttctggac tgatggtgga 120
ggtgacgtta caatgaccct cggagatgct ggttcatata cagtcgaatg gcacaacgtt 180
ggtaattttg tcggaggtaa aggatggaac ccaggttccg cccaacgcat tacttactct 240
ggaactttca caccttccgg aaatggttac ttgtcagttt atggttggac tacagatcca 300
cttatcgaat actacatcgt tgagagttac ggagactata atccttgttc tggaggtact 360
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aacgctgcct ccatccaggg tacagcaacc tttactcaat attggtcagt tagacagaat 480
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<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
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ggtaattttg tcggaggtaa aggatggaac ccaggttccg cccaacgcat tacttactct 240
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<210> 8
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
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ggtaattttg tcggaggtaa aggatggaac ccaggttccg cccaacgcat tacttactct 240
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<211> 642
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<213> 人工序列
<400> 9
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cttatcgaat actacatcgt tgagagttac ggagactata atccttgttc tggaggtact 360
tacaagggaa ccgttacttc tgatggttcc gtctacgaca tctgtacagc caccagaact 420
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cccgaattcg ttccccacga ctctgtc 27
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ccctctagat tactgaacag tgatggagga 30
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aggattatag tctccgtaac tctcaacg 28
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tgtacagcca ccagaactaa cgct 24
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ccattcgact gtatatgaac cagc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cgcattactt actctggaac tttcac 26
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
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<400> 19
ttgggcggaa cctgggttcc at 22
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cacaatggtt tttactatag tttctgg 27
<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ctctccggtg gaagatggtg tac 23
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gacggttttt actatagttt ctggact 27
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gtgctctccg gtggaagatg gt 22
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
atgaccctcg gagatgctgg ttc 23
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tgtaacgtca cctccaccat cag 23
Claims (2)
1.编码来源于黑曲霉NL-1木聚糖酶的多位点突变体的核酸序列，其特征在于序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示。
2.权利要求1所述核酸序列编码的突变体在提升黑曲霉NL-1木聚糖酶耐热耐碱性能中的应用。
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Site-Directed Mutagenesis and Thermostability of Xylanase XYNB from Aspergillus niger 400264;Jie Xie 等;《Curr Microbiol》;20100701;第62卷(第1期);第242-248页 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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