CN102732541B

CN102732541B - 木聚糖酶的表达方法及其专用dna片段

Info

Publication number: CN102732541B
Application number: CN 201110089691
Authority: CN
Inventors: 江正强; 贾会勇; 范光森; 闫巧娟; 严烨
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2011-04-11
Filing date: 2011-04-11
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2031-04-11
Also published as: CN102732541A

Abstract

本发明公开了一种木聚糖酶的表达方法及其专用DNA片段。该DNA片段的编码序列如序列表中序列1的第58-1044所示或者如序列表中序列1所示。将该片段导入毕赤酵母后经行高密度发酵，上清液酶活达到最高，为41,000U/mL，粗蛋白含量达10.1g/L。杨梦华等(微生物学报，2005，45(2)：236-240))将该基因在毕赤酵母的进行表达，经5L发酵罐诱导培养5d后，重组木聚糖酶分泌表达量为207mg/L。因此，该研究经过密码子优化，大大提高了该基因的表达量，为其工业化应用提供了重要途径。

Description

木聚糖酶的表达方法及其专用DNA片段

技术领域

本发明涉及一种通过密码子优化技术改造耐热木聚糖酶基因xynB以实现其在毕赤酵母中高效表达的技术方法。本发明还涉及重组巴斯德毕赤酵母GS115/pPIC9K-xynBop的高密度发酵方法。

背景技术

木聚糖是半纤维素的主要组成部分，广泛分布于高等植物的细胞壁中，是自然界中储量巨大的可再生生物资源，仅次于纤维素。木聚糖的降解酶系主要包括β-D-1，4-内切木聚糖酶(β-D-1，4-xylanase，EC 3.2.1.8)和β-木糖苷酶(β-D-1，4-xylosidase，EC 3.2.1.37)。β-D-1，4-内切木聚糖酶(EC.3.2.1.8)能够以内切方式随机作用于木聚糖主链内部的木糖苷键，将其分解成不同长度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶中最关键的酶。木聚糖酶可广泛应用于生物转化、食品、饲料、医药、能源、造纸、纺织等行业。木聚糖酶可由多种微生物产生，但由于一般微生物所产的木聚糖酶为中低温或偏酸性，大大限制了其在工业上的应用。

在许多应用木聚糖酶的工业中，常常需要在高温条件下进行反应，这就需要木聚糖酶具有良好的热稳定性。目前已在多种耐热微生物中发现了热稳定性良好的木聚糖酶，然而耐热的微生物往往培养困难，有的还需要在高温厌氧条件下培养，产酶量低且酶系复杂难以纯化，严重限制了其应用和发展。

极端嗜热菌海栖热袍菌MSB8的木聚糖酶基因xynB已经被克隆在毕赤酵母(申请号为：200310113562.9)中进行了表达，重组酶的最适温度为90℃，在中性和偏碱性环境中热稳定性好。杨梦华(微生物学报，2005，45(2)：236-240)等将xynB基因在毕赤酵母中进行了表达，经5L发酵罐诱导培养5d后，重组木聚糖酶分泌表达量为207mg/L。

毕赤酵母异源基因表达系统是近年来应用得较多的酵母表达系统，既具有原核表达系统操作简单、高分泌表达、易于调控等特点，还具有真核细胞特有的翻译后修饰功能。另外，该表达系统还利于进行菌体高密度发酵。这些优点使得毕赤酵母被广泛用作外源基因表达系统，表达各种外源蛋白。研究发现，根据毕赤酵母密码子偏爱性进行密码子优化可以提高外源基因表达水平10-50倍(Sinclair and Choy，ProteinExpression and Purification，2002，26：96-105；Nikolay et al.，ProteinExpression and Purification.2002，2002，24：18-24)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过密码子优化技术改造的耐热木聚糖酶基因xynB。

本发明提供的基因(xynB)，是如下1)或2)：

1)其编码序列如序列表中序列1的第58-1044所示；

2)其编码序列如序列表中序列1所示。

含有上述基因的表达盒、重组载体或转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。

上述重组载体具体可以是将上述基因插入酵母表达载体的多克隆位点中得到的重组表达载体。

上述酵母表达载体可以为pPIC9K。

含有上述基因的重组菌也属于本发明的保护范围之内。

进一步讲，上述重组菌是将上述的重组载体导入毕赤酵母得到的重组菌。

本发明的另一目的在于提供一种生产木聚糖酶的方法。

本发明提供的方法是将上述的重组菌进行发酵，得到所述木聚糖酶。

上述发酵可以包括基础培养、甘油分批补料培养和甲醇诱导三个阶段；所述基础培养阶段的温度为30℃，时间为18-24小时，pH值为3.5-4.5；所述甘油分批补料培养阶段的温度为30℃，DO＞20％，pH值为3.5-4.5；所述甲醇诱导阶段的DO＞15％、发酵温度30℃，pH值为5.5-6.5。

采用以上技术方案后，本发明的重组毕赤酵母经5L发酵罐高密度发酵结果显示，诱导表达228h后发酵上清液酶活达到最高，为41,000U/mL，粗蛋白含量达10.1g/L。杨梦华等(微生物学报，2005，45(2)：236-240))将该基因(序列表中序列2所示的基因)在毕赤酵母的进行表达，经5L发酵罐诱导培养5d后，木聚糖酶分泌表达量为207mg/L。因此，该研究经过密码子优化，大大提高了该基因的表达量，为其工业化应用提供了重要途径。

附图说明

图1为本发明发酵罐发酵毕赤酵母产重组木聚糖酶xynB过程中酶活力、蛋白质浓度变化情况(a)及重组蛋白分泌的SDS-PA6E检测(b)。

图2为本发明发酵罐发酵毕赤酵母产重组木聚糖酶xynB的最适pH(a)及pH稳定性(b)。

图3为本发明发酵罐发酵毕赤酵母产重组木聚糖xynB的最适温度(a)及温度稳定性(b)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，所用原料如分子试剂、克隆表达载体、菌株以及发酵用原材料均可从商业途径获得；如无特殊说明，采用方法均为常规方法。

实施例1耐热木聚糖酶基因xynB密码子优化

利用Codon Usage Database(http://www.kazusa.or.jp/codon/)分析xynB基因(编码序列如序列表中序列2所示)中毕赤酵母稀有密码子分布。进而利用在线软件DNAWorks进行密码子优化，得到密码子优化基因xynBop(编码序列如序列表中序列1所示)。利用DNAMAN(LynnonBiosoft，USA)进行BLAST比对分析，xynBop与xynB相似性为77.8％，表明原宿主菌与毕赤酵母密码子用法差异较大，具有较大优化潜力。

实施例2重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-xynBop的构建

利用在线软件SignalP3.0server(http://www.cbs.dtu.dk/services/signalP)分析极端嗜热菌海栖热袍菌MSB8木聚糖酶基因的信号肽编码序列，发现该基因编码19AA信号肽(序列1或2所示1-57bp)，将编码成熟木聚糖酶的xynBop基因序列(序列1的第58位-1044位)送交生工生物工程(上海)有限公司进行全基因合成，合成前在xynBop的5’和3’末端分别引入了SnaBI和AvrII酶切位点，以方便表达载体构建。上海生工合成基因后将其连接在克隆载体pUC57(生工生物工程有限公司)上，可直接利用SnaBI/AvrII进行酶切，与经同样双酶切的pPIC9K(Invitrogen)连接，即得到重组载体pPIC9K-xynBop，经过酶切和测序验证，序列正确。

实施例3毕赤酵母His⁺Mut⁺多拷贝转化子筛选及PCR验证

重组载体pPIC9K-xynBop利用SalI线性化后电转化毕赤酵母GS115(购自Invitrogen公司)。

将转化后的MD选择培养基上得到的His⁺转化子(His⁺转化子指阳性转化子)分别在含4.0mg/mL、8.0mg/mL G418的YPD/G418(YPD：1％yeast extract，2％peptone，2％dextrose)平板上筛选、再进行Mut⁺(methanol use plus)/Mut^s(methanol useslow)鉴别及PCR分析。Mut⁺/Mut^s的鉴别：用灭菌牙签挑取单克隆，在MM及MD平板上以一定的方式划线或点His⁺转化子，确保先在MM平板上点，每个克隆换一次牙签，为分离Mut⁺/Mut^s表型，若有对照，在MD及MM平板上各点上对照(GS115/His⁺Mut^sAblumin及GS115/His⁺Mut⁺β-gal)，30℃孵育2d后，观察菌落生长情况(Mut^s在MD平板正常生长而在MM平板上生长很小或不长，Mut⁺则可在MM平板上正常生长)。

PCR分析毕赤酵母整合：1.5mL离心管中加入500μL酵母培养物，离心收集菌体，用500μL灭菌水重新悬浮，-70℃冷冻10min或浸于液氮1min，沸水煮沸5min，剧烈振荡2min，再重新冷冻、煮沸处理一次，10,000g离心5min，取上清作为PCR模板。反应体系：10×反应buffer，5μL；dNTPs(各2.5mM)，4uL；5’AOX1引物(10μM)，1μL；3’AOX1引物(10μM)，1μL；细胞裂解上清，5μL；Ex Taq(5U/μL)，0.25μL；加水至50μL。退火温度54℃，延伸时间1min，其余按PCR标准程序进行。PCR结束后取5μL，1.0％琼脂糖凝胶分析结果。GS115/mut+整合可见两条带，一条与目的基因相关，另一条为AOX1基因(大约2.2kb)，GS115/Muts整合，可见与目的基因相关的一条带。

经His⁺转化子筛选，G418抗性筛选，Mut⁺和Mut^s筛选。最终从含8.0mg/mL G418的YPD/G418平板上筛选得到Mut⁺菌株，命名为pP9K-xynBop/GS115。

实施例4毕赤酵母高密度发酵产耐高温木聚糖酶

发酵方法按照Pichia Fermentation Process Guidelines(Version B，053002，Invitrogen)。采用5L的发酵罐(BIOTECH，上海保兴生物设备工程有限公司)。种子培养基BMGY；发酵基本培养基BSM，甘油分批补料培养基和100％甲醇诱导培养基参照Pichia Fermentation Process Guidelines(Version B，053002，Invitrogen)。整个发酵过程采用分批培养、甘油流加培养、100％甲醇诱导培养三个阶段。

从含G418平板筛选得到抗性菌株再经过摇瓶诱导发酵培养，选择酶活较高的几个菌株用于高密度发酵培养研究。其中摇瓶培养：将pPIC9K-xynBop/GS115菌株在BMGY培养基培养16～18h，3,000g离心5min，收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体OD600至1.0左右，诱导目标蛋白表达。以上培养条件为500mL三角瓶装量100mL培养基，温度30℃，转速250rpm。诱导96h，取样分析酶活。

发酵罐高密度发酵表达：采用5L的发酵罐。种子培养基BMGY；发酵基本培养基BSM(85％H₃PO₄，26.7mL；CaSO₄，0.93g；K₂SO₄，18.2g；MgSO₄·7H₂O，14.9g；KOH，4.13g；甘油，40.0g，加蒸馏水水至1L)；甘油分批补料培养基：50％(W/V)甘油高压灭菌后，加入PTM₁(CuSO₄·7H₂O，6.0g；NaI，0.08g；MnSO₄·H₂O，3.0g；Na₂MoO₄·2H₂O，0.2g；硼酸，0.02g；CoCl₂，0.5g；ZnCl₂，20.0g；FeSO₄·7H₂O，65.0g；生物素，0.2g；浓硫酸，5.0mL；加水至1L)12mL/L甘油；100％甲醇诱导培养基：100％甲醇，加入PTM₁ 12mL/L甲醇。

发酵过程：①种子培养：选择摇瓶发酵中重组蛋白表达水平较高的菌株，从保藏的甘油管吸取0.2mL菌液(pPIC9K-xynBop/GS115)接种200mL BMGY培养基，30℃，250rpm过夜培养至OD₆₀₀ 10.0左右。②分批培养(基础培养)：装量2.0L(发酵基本培养基BSM)，发酵罐灭菌，28％浓氨水调pH 4.0，加入PTM₁ 4.35mL/L起始发酵液，接种量10％，转速700rpm，通气量1.0vvm，发酵18～24h，溶氧DO从100％逐渐下降，直至5％左右，维持一段时间后回升至60％左右，温度30℃。③甘油分批补料培养：待分批培养至甘油耗尽(根据DO spikes操作，30s内溶氧迅速上升至接近70％又迅速下降)，流加50％(W/V)(即500g/L甘油水溶液)的甘油，流速18.4mL/h/L起始发酵液，控制温度30℃、pH4.0、始终监视DO，通过调整流加速度、转速和通气量等保持DO＞20％。流加时间4-5h，待OD₆₀₀达180～220左右，停止流加。④100％甲醇诱导培养：停止流加甘油后，根据DO spikes，饥饿30min左右，流加100％甲醇诱导，在4h内使流速从3.6mL/h/L起始发酵液增加至10.9mL/h/L起始发酵液左右，监控DO＞15％、控制温度30℃、调pH 6.0。发酵过程中取样分析细胞浓度、酶活和蛋白含量。将空载体pPIC9K按照实施例3的方法导入GS115中，然后进行实施例4的发酵，结果显示发酵液中无上述蛋白产生。

重组毕赤酵母经5L发酵罐高密度发酵结果显示(见图1a)，诱导表达228h后发酵上清液酶活达到最高，为41,000U/mL，粗蛋白含量达10.1g/L；发酵上清液SDS-PAGE检测如图1b所示。杨梦华等(微生物学报，2005，45(2)：236-240))将该基因(序列表中序列2所示的基因)在毕赤酵母的进行表达，经5L发酵罐诱导培养5d后，木聚糖酶分泌表达量为207mg/L。因此，该研究经过密码子优化，大大提高了该基因的表达量，为其工业化应用提供了重要途径。

其中，酶活测定法是：木聚糖酶活力的测定参照DNS法：0.1mL适当稀释的酶液，加入到0.9mL用50mM pH 6.0柠檬酸缓冲液配制的1％的桦木木聚糖底物溶液中，90℃反应10min，用DNS法测定释放的还原糖量，同时以木糖作标准。酶活定义是：木聚糖酶活力单位(U)的定义为：在上述条件下，每分钟水解木聚糖生成1μmol木糖所需要的酶量。

实施例5重组木聚糖酶的性质

将实施例4的高密度发酵液在4℃条件下，10000rpm离心10min，取上清作为粗酶液，测定重组酶的性质。

(1)重组木聚糖酶的最适pH和pH稳定性

最适pH值的测定：采用不同缓冲体系的缓冲液(50mM)溶解底物，于90℃，按照标准方法测定酶活，以最大值为100％，分别计算各pH下的相对酶活。缓冲体系及其范围分别为：柠檬酸-柠檬酸钠，3.0-6.0；磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液：6.0-8.0；MES：5.5-6.5；MOPS：7.0-7.5；CHES：8.0-10.0；CAPS：10.0-11.0；磷酸-NaOH：11.0-12.0。

pH稳定性的测定：将酶液与50mM不同pH的缓冲液混合后，于90℃保温30min，立即冰水浴冷却30min，按标准方法测定酶活，以未经处理的酶液为对照，分别计算各pH处理后的残余酶活。

(2)重组木聚糖酶最适反应温度和温度稳定性

最适反应温度的测定：将1％的桦木木聚糖溶于最适pH缓冲液内作为反应底物，于不同温度下测定木聚糖酶活，反应时间为10min。以最大酶活为100％，分别计算各温度下的相对酶活。

温度稳定性的测定：将酶液与50mM的最适pH缓冲液混合，将此体系置于不同温度的水浴锅中保温30min，立即冰水浴冷却30min，按标准方法测定残余酶活(以未经处理的酶为对照)。

在不同pH条件下测定的木聚糖酶活力结果如图2(a)所示，该酶在pH 5.5的柠檬酸缓冲液中活性最高。由图2(b)可看出，该酶具有较宽的pH稳定性，当pH为12，在90℃保温30min时，仍有85％的残余酶活力，而pH为4时，酶活力几乎没发生变化。

不同温度下测定木聚糖酶的最适反应温度如图3(a)所示。该木聚糖酶的最适反应温度为100℃，95℃和105℃下相对酶活分别为73.4％和63.0％。由图3(b)可知，该酶在pH 5.5的柠檬酸缓冲液中105℃保温30min，残余酶活力几乎没有发生改变，表现出较好的热稳定性。

Claims

1.一种基因，是如下1）或2）：

1）其编码序列如序列表中序列1的第58-1044位核苷酸所示；

2）其编码序列如序列表中序列1所示。

2.含有权利要求1所述基因的表达盒。

3.含有权利要求1所述基因的转基因细胞系。

4.含有权利要求1所述基因的重组载体。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是将权利要求1所述基因插入酵母表达载体的多克隆位点中得到的重组表达载体。

6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述酵母表达载体为pPIC9K。

7.含有权利要求1所述基因的重组菌。

8.如权利要求7所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是将权利要求4或5所述的重组载体导入毕赤酵母得到的重组菌。

9.一种生产木聚糖酶的方法，是将权利要求7或8所述的重组菌进行发酵，得到所述木聚糖酶。

10.如权利要求9所述的生产木聚糖酶的方法，其特征在于：所述发酵包括基础培养、甘油分批补料培养和甲醇诱导三个阶段；所述基础培养阶段的温度为30℃，时间为18-24小时，pH值为3.5-4.5；所述甘油分批补料培养阶段的温度为30℃，DO＞20%，pH值为3.5-4.5；所述甲醇诱导阶段的DO＞15%、发酵温度30℃，pH值为5.5-6.5。