CN105274112A - 一种在酸性条件下诱导表达的启动子 - Google Patents

一种在酸性条件下诱导表达的启动子 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种在酸性条件下诱导表达的启动子，属于生物工程技术领域。本发明的启动子是从黑曲霉分离的若干启动子，其能在黑曲霉中驱动和/或调节有效连接的核酸的表达。已在黑曲霉中研究了本发明启动子的表达模式且一些启动子显示弱表达，而一些具有强活性。本发明为促进霉菌发酵生产有机酸以及其它需要在酸性条件进行发酵生产的产品提供了有效的方法和新的思路。

Description

一种在酸性条件下诱导表达的启动子
技术领域
本发明涉及一种在酸性条件下诱导表达的启动子，属于生物工程技术领域。
背景技术
黑曲霉是重要的工业生产菌，作为生物反应器广泛应用于酶、抗生素、有机酸等物质的生产。同时，黑曲霉是食品安全级菌株，具有广阔的应用前景。传统的对黑曲霉的改造方法是诱变和筛选，但这种不定向的诱变使得筛选的工作量巨大，而且并不一定可以筛选到优良性状的转化子。随着黑曲霉基因组测序工作的完成，转录组数据不断对黑曲霉基因组表达谱进行挖掘，黑曲霉的代谢网络模型不断得到完善，黑曲霉高产柠檬酸机制和高效分泌蛋白的机制得到更深层次的阐述。在此基础上，通过分子改造对黑曲霉的代谢进行调控来实现目的产物的积累已经有成功的报道。
目前对黑曲霉进行代谢改造，大多利用组成型启动子(PgpdA、Pmbf)来启动基因表达，在菌体生长阶段，这些基因就已经开始表达，因此不利于基因工程菌的生物量的积累。诱导型启动子则包括糖化酶基因(gla)启动子、木聚糖酶基因(xln)启动子和乙醇脱氢酶(alc)启动子等，这些启动子都需要在培养基中特异添加相应的底物来诱导基因表达，而且表达强度不如组成型启动子，此外xln启动子受到葡萄糖的抑制，gla启动子的表达强度则受葡萄糖浓度的影响而变化，无法在主要碳源为葡萄糖的培养基中稳定地进行高强度表达外源基因。考察黑曲霉生产柠檬酸的发酵过程，柠檬酸在pH<3时开始积累，因此，需要在菌体生长阶段，尽可能不表达外源基因，而在菌体产酸阶段，大量表达外源基因。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了酸诱导的启动子，解决了区分菌体生长和菌体产酸这两个阶段的问题，使外源基因可以只在产酸阶段大量表达，为霉菌发酵生产有机酸以及其它需要在酸性条件进行发酵生产的产品提供了有效的方法和新的思路。
本发明的第一个目的是提供一种酸诱导的启动子，所述启动子的核苷酸序列是：
(1)SEQIDNO.1或
(2)与SEQIDNO.1的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或
(3)在SEQIDNO.1的基础上进行碱基插入和/或缺失得到的，具有驱动和/或调节表达功能的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子的核苷酸序列SEQIDNO.1，命名为Pgas。
在本发明的一种实施方式中，所述酸诱导指的酸性环境是指pH2左右。
本发明的第二个目的是提供启动子在调控基因表达方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是在霉菌中诱导基因的表达。
在本发明的一种实施方式中，所述应用，是将含有所述启动子的遗传构建体转化到霉菌细胞中，在酸性条件下进行培养；所述遗传构建体中的启动子与异源核酸序列连接，异源核酸序列受启动子的调控。
本发明还要求保护含有所述核苷酸片段或者所述启动子的遗传构建体、表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述遗传构建体含有本发明的启动子、与本发明的启动子有效连接的异源核酸序列、3’转录终止子。
本发明还要求保护含有所述启动子的重组菌。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是将依次含有启动子、异源基因序列、终止子的表达框转化到宿主细胞中得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌、藻类、真菌、酵母、植物、昆虫或动物宿主细胞中的任意一种。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是按照如下方法构建得到的：(1)合成或者扩增得到SEQIDNO.1的酸诱导启动子片段(命名为Pgas)，将启动子、异源基因序列(即想要调控表达的基因)、trp终止子依次连接载体上，构建重组质粒；(2)从重组质粒上扩增得到依次含有启动子、异源基因序列、终止子的表达框，然后将表达框转入宿主菌中，筛选阳性克隆子，即为重组菌。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主菌为黑曲霉，所述异源基因为GFP。
在本发明的一种实施方式中，所述黑曲霉为H915-1。
本发明的有益效果：
本发明成功地从黑曲霉中克隆获得一个酸诱导启动子，并提供了一种仅在酸性条件下启动基因表达的方法，为代谢改造黑曲霉发酵生产有机酸和其它酸性条件下合成的产品奠定了一定的基础。
附图说明
图1所示为Pgas和PgpdA启动下的GFP在不同pH下的荧光；
图2所示为不同pH下各转化子的GFP荧光强度；gpdA、pth、aat、patI、gas分别代表以启动子PgpdA、Ppth、Paat、PpatI、Pgas控制GFP基因表达的转化子。
具体实施方式
实施例1：黑曲霉基因组DNA的提取
将黑曲霉孢子接种到ME液体培养基中，35℃250r/min培养48h，用mirocloth收集菌球，用无菌超纯水洗涤3遍，滤干水分，迅速液氮冷冻。用液氮研磨的方法将组织充分磨碎，采用QIAGEN公司DNeasyPlantMiniKit提取丝状真菌基因组。
实施例2：酸诱导启动子的获取
对NCBIGEODatasets中黑曲霉在不同pH下的转录组数据(Series号GSE11725)进行分析，找到4个基因的表达量随pH下降而增加，将黑曲霉基因组序列中这四个基因的上游约1.5kb碱基序列提交到Berkeleymodels(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)进行启动子预测，均可以找到核糖体结合位点，预测到4个启动子Pgas、PpatI、Ppth、Paat。
Pgas通过引物gas-F和gas-R(序列分别如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3)进行扩增，两端含有EcoRI和SmaI酶切位点。PpatI通过引物pat-F和pat-R(序列分别如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5)进行扩增，两端含有SacI和BamHI酶切位点。Ppth通过引物pth-F和pth-R(序列分别如SEQIDNO.6、SEQIDNO.7)进行扩增，两端含有SacI和BamHI酶切位点。Paat通过引物aat-F和aat-R(序列分别如SEQIDNO.8、SEQIDNO.9)进行扩增，两端含有EcoRI和BamHI酶切位点。所有的启动子连接到pMD-19(simple)上进行测序。
引物序列如下：
gas-F:GAATTCCTGCTCTCTCTCTGCTCTCTTTCT
gas-R:CCCGGGGTGAGGAGGTGAACGAAAGAAGAC
pat-F:GAGCTCTTAGGAAACCTACCATCCATCGTA
pat-R:GGATCCTGTGCTGCTTGACTGGACGTTCA
pth-F:GAGCTCTATGTGTCACGAGTTAGAAAGGA
pth-R:GGATCCGTGGCCTACATGCTCTGAAACA
aat-F:GAATTCCGCTATCTCCATCTGATAGCCATA
aat-R:GGATCCGATTGCTTGTCGATTATACAGCGT
实施例3：酸诱导启动子表达系统的构建
GFP(序列为SEQIDNO.10)参照文献由全序列合成得到(ChiuW,NiwaY,ZengW,HiranoT,KobayashiH,SheenJ.EngineeredGFPasavitalreporterinplants.CurrBiol.1996；6:325-30.)，序列5’和3’端分别加入BamHI和PstI位点，trp终止子通过trp-F和Ttrp-R(序列分别如SEQIDNO.11、SEQIDNO.12)以pAN7-1为模板扩增得到，序列的5’和3’端分别加入PstI和HindIII位点。Ttrp由HindⅢ和PstⅠ酶切，sGFP由PstⅠ和BamHI酶切，连接到pUC18上，得到pGT。GFP-Ttrp片段通过引物GFP-F1(序列为SEQIDNO.13)和Ttrp-R，以pGT载体为模板进行扩增，得到的片段反向连接pMD19，得到pMD-GFP-Ttrp载体。gas启动子和pMD-GFP-Ttrp载体分别以EcoRI和SmaI进行酶切并连接，得到GFP表达载体。用引物gas-F和Ttrp-R扩增Pgas-GFP-Ttrp表达框；采用类似的方法，构建含有启动子PpatI、Ppth、Paat的表达框PpatI-GFP-Ttrp、Paat-GFP-Ttrp、、Ppth-GFP-Ttrp。
潮霉素抗性表达框通过引物gpd-F和Ttrp-R-2(序列分别如SEQIDNO.14、SEQIDNO.15)从质粒pAN7-1中扩增得到。
引物：
trp-F：CTGCAGAGATCCACTTAAACGTTACTGAAATC
Ttrp-R：AAGCTTTCGAGTGGAGATGTGGAGTGG
GFP-F1:GATCCATGGTGAGCAAGG
gpd-F:CAATTCCCTTGTATCTCTACACACAG
Ttrp-R-2:TCGAGTGGAGATGTGGAGTGG
实施例4：黑曲霉原生质体的制备和转化
按3×105/ml的浓度接种孢子至ME液体培养基，30℃、200r/min培养过夜。用mirocloth收集菌球，并用无菌水清洗菌球。称取一定量的溶壁酶，并用渗透压稳定剂KMC溶解，用无菌滤膜过滤除菌。称取一定量菌球，加入到酶解液中，37℃100r/min震荡培养约3h直至菌丝完全消化为原生质体，4℃1000rpm离心10min，弃上清，加入相同体积预冷的STC，4℃1000rpm离心10min，弃上清，洗涤2次，加入100μLSTC，混匀。100μL黑曲霉原生质体中加入10ul线性化核酸片段(即实施例3扩增得到的含有表达框的片段)和330μLPEG缓冲液，冰上放置20min，加入2mLPEG，室温放置10min，依次加入4mLSTC和4mL于48℃预热的上层培养基，铺板于含有150mg/L潮霉素的下层培养基上。平板在35℃倒置培养4-7天，直至出现菌落，挑取单菌落继代。每个菌落进行3次单孢子继代。提取基因组，并用特异性引物对阳性菌落进行PCR验证。
实施例5：黑曲霉荧光强度的测定
将黑曲霉孢子以3×105/ml接种至不同pH(pH分别为2.0、3.0、4.0和5.0)的LBL培养基中，35℃、120r/m培养24h，镜检，以蓝光为激发光检测菌丝体荧光。可见野生型对照在pH2.0和5.0下，均几乎没有荧光；组成型启动子PgpdA转化子在pH5.0下有极强荧光，在pH2.0下有较强荧光；Pgas转化子在pH5.0下荧光非常弱，而在pH2.0下有较强荧光(图1)，说明Pgas为酸诱导启动子。
35℃120r/m继续培养48h，用miracloth收集菌丝体，用WS溶液洗涤菌体后吸干菌体表面水分，将菌体转移到MP裂解介质C中，提取菌体总蛋白。对所有样品的总蛋白用天根公司BCA蛋白质定量试剂盒进行蛋白浓度测定并最终稀释至相同浓度。用Cytation3细胞成像多功能检测系统进行荧光测定，激发光485nm，吸收光535nm。
结果见图2，PgpdA在各个pH下均有较强的荧光，但随着pH的下降，荧光强度逐步减弱；Pgas在pH5.0、4.0和3.0下，荧光强度都很弱，仅在pH2.0下有较强的荧光，荧光强度高于PgpdA在pH2.0时的荧光强度，但比PgpdA在pH5.0时的荧光弱，为酸诱导的启动子。而含有PpatI、Ppth、Paat启动子的转化子，并没有明显的酸诱导情况。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列是：
(1)SEQIDNO.1或
(2)与SEQIDNO.1的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或
(3)在SEQIDNO.1的基础上进行碱基插入和/或缺失得到的，具有驱动和/或调节表达功能的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述启动子的遗传构建体。
3.根据权利要求2所述的遗传构建体，其特征在于，所述遗传构建体含有所述启动子、与所述启动子有效连接的异源核酸序列、3’转录终止子。
4.含有权利要求1所述启动子的表达载体。
5.权利要求1所述启动子在调控基因表达方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是将含有所述启动子的遗传构建体转化到霉菌细胞中，在酸性条件下进行培养；所述遗传构建体中的启动子与异源核酸序列连接，异源核酸序列受启动子的调控。
7.含有权利要求1所述启动子的重组菌。
8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以细菌、藻类、真菌、酵母、植物、昆虫或动物为宿主细胞，将含有启动子、异源基因序列、终止子的表达框转化到宿主细胞中得到的。
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