CN104711273A - 一种重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的制备方法及其应用 - Google Patents

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本发明公开了一种重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的制备方法及其应用。将本发明的Agod基因导入里氏木霉Tu6△tku70中构建的重组里氏木霉Tu6△tku70::Agod能够成功地表达重组黑曲霉葡萄糖氧化酶，而且表达量较高，发酵液中的酶活力可达到137U/mL，是目前产葡萄糖氧化酶菌株中摇瓶发酵酶活力的最高水平。将发酵液中的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶通过镍柱纯化后测定的酶活力可达到342U/mL，重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的比活力为155U/mg蛋白。采用本发明的方法制备的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶具有很好的热稳定性和较好的酸碱耐受性，发酵工艺简单，不需转接，原料廉价易得，成本大大降低，可广泛应用于食品医疗领域中。

Description

一种重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域中一种重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的制备方法及其应用。
背景技术
葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,E.C.1.1.3.4)是一种同型二聚体糖蛋白，由两个相同的多肽链通过二硫键共价结合组成，同时含有两个非共价结合的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅因子，该酶以分子氧作为电子受体，可以氧化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。
葡萄糖氧化酶由于底物专一性强、催化效率高、无毒副作用，在医疗诊断、食品加工、饲料及纺织工业中均有广泛的应用价值。葡萄糖氧化酶能够特异性识别葡萄糖，因此被广泛应用于临床中葡萄糖含量的检测，如尿糖的检测、血糖的测定，可以有效监测糖尿病人的尿糖、血糖含量。同时，葡萄糖氧化酶作为一种天然的食品添加剂，可以去除葡萄糖、脱除氧气，而且催化反应生成的葡萄糖酸对人体无害，生成的过氧化氢能够起到有效的杀菌抑菌作用，防止变质，延长食品保质期。
葡萄糖氧化酶广泛分布于动植物及微生物体内，但是动植物体内的葡萄糖氧化酶含量低而且提取纯化工艺复杂；目前葡萄糖氧化酶主要来源于微生物体内，如黑曲霉及青霉，但是仍然存在产量低和提取纯化难度大的问题。葡萄糖氧化酶在其它微生物表达宿主中的表达水平也普遍不高(表1)，虽然在巴斯德毕赤酵母及酿酒酵母中的表达量较高，但是发酵过程中均需要转接而且需要用大量的甲醇进行诱导，程序繁琐，成本高，更为重要的是巴斯德毕赤酵母不是美国食品药品监督管理局(FDA)认证的安全的微生物(GRAS微生物)，生物安全性存在隐患，不适合应用于食品和医疗领域中。因此，开发产量高、安全性高、发酵提纯工艺简单、成本低的新的表达系统是十分必要的。
表1、产葡萄糖氧化酶的菌株及其表达量
菌株名称 产量 参考文献
Aspergillus niger BTL 7.5U/mL Hatzinikolaou et al,1995
Aspergillus niger ZBY-7 6U/mL Tongbu et al,1996
Aspergillus niger AM111 2.5U/mL Fiedurek et al,2000
Saccharomyces cerevisiae 125U/mL Malherbe et al,2003
Pichia pastoris 99U/mL Y.Meng et al,2013
Penicillium variabileP16 5.52U/mL Petruccioli et al,1999
Trichoderma reesei QM9414 25U/mL 母敬郁et al,2006
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何制备高产量、高活性、高安全性和成本低的黑曲霉葡萄糖氧化酶。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了人工合成的用于编码重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的核酸分子。
本发明所提供的人工合成的用于编码重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的核酸分子，是Agod基因或RNA分子，
所述Agod基因为如下a)-f)中任一所述的DNA分子或cDNA分子：
a)其编码序列是SEQ ID No.1的第4682-6520位的DNA分子或cDNA分子；
b)其编码序列是SEQ ID No.1的第4733-6520位的DNA分子或cDNA分子；
c)其编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子或cDNA分子；
d)其编码序列是SEQ ID No.2的第52-1821位的DNA分子或cDNA分子；
e)与a)或b)或c)或d)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且与a)或b)或c)或d)限定的核苷酸序列具有相同功能的cDNA分子或基因组DNA分子；
f)在严格条件下与a)或b)或c)或d)限定的核苷酸序列杂交，且与a)或b)或c)或d)具有相同功能的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述RNA分子为如下g)-j)中任一所述的RNA分子：
g)其编码序列是将SEQ ID No.1的第4682-6520位中的T均替换为U，其它核苷酸不变得到的RNA分子；
h)其编码序列是将SEQ ID No.1的第4733-6520位中的T均替换为U，其它核苷酸不变得到的RNA分子；
i)其编码序列是将SEQ ID No.2中的T均替换为U，其它核苷酸不变得到的RNA分子；
j)其编码序列是将SEQ ID No.2的第52-1821位中的T均替换为U，其它核苷酸不变得到的RNA分子。
其中，SEQ ID No.1由8763个核苷酸组成，SEQ ID No.1的第4682-6499位与SEQ ID No.2的第1-1818位完全相同；SEQ ID No.1的第4682-4732位与SEQ ID No.2的第1-51位完全相同，是里氏木霉的信号肽编码序列；SEQ ID No.1的第4733-6499位与SEQ ID No.2的第52-1818位完全相同，是黑曲霉葡萄糖氧化酶的编码序列；SEQID No.1的第6500-6517位是6个组氨酸的编码序列；SEQ ID No.1的第6518-6520位与SEQ ID No.2的第1819-1821位完全相同，是终止密码子。
上述核酸分子，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的核酸分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的核酸分子的核苷酸序列具有75％或者更高同一性且具有相同的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID No.1的第4682-6520位所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；与本发明的SEQ IDNo.1的第4733-6520位所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；与本发明的SEQ ID No.2的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；与本发明的SEQ ID No.2的第52-1821位所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述人工合成的用于编码重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的核酸分子相关的遗传材料。
本发明所提供的与所述人工合成的用于编码重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的核酸分子相关的遗传材料，为下述B1)至B5)中至少一种：
B1)含有所述人工合成的用于编码重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的核酸分子的表达盒；
B2)含有所述人工合成的用于编码重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的核酸分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；
B3)含有所述人工合成的用于编码重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的核酸分子的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B4)含有所述人工合成的用于编码重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B2)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B5)含有所述人工合成的用于编码重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的核酸分子的转基因动物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因动物细胞系、或含有B2)所述重组载体的转基因动物细胞系。
上述遗传材料中，B1)所述的含有人工合成的用于编码重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的核酸分子的表达盒(Agod基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的DNA分子，该DNA不但可包括启动Agod基因转录的启动子，还可包括终止Agod基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。Agod基因表达盒中，启动Agod基因转录的启动子具体可为Pcbh1。Pcbh1的核苷酸序列可为SEQ IDNo.1的第2778-4681位。终止Agod基因转录的终止子具体可为Tcbh1。Tcbh1的核苷酸序列可为SEQ ID No.1的第6521-8763位。B1)所述表达盒的核苷酸序列具体可为SEQ ID No.1的第2778-8763位所示的核苷酸序列。
可用现有的表达载体构建含有所述Agod基因表达盒的重组载体。
上述遗传材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。上述与所述人工合成的用于编码重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的核酸分子相关的遗传材料中，B2)所述重组载体具体可为pPSK-AGOD-His6，其核苷酸序列为SEQ ID No.1。
上述遗传材料中，B3)所述重组微生物为含有所述人工合成的用于编码重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的核酸分子的重组里氏木霉，具体可为含有SEQ ID No.1的第4733-6520位所示的核苷酸序列(Agod基因的核苷酸序列)的重组里氏木霉。
上述遗传材料中，B4)所述的转基因植物细胞系和B5)所述的转基因动物细胞系不包括繁殖材料。所述转基因动物细胞系可为昆虫细胞。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种重组细胞的构建方法。
本发明所提供的重组细胞的构建方法，包括向受体细胞中导入所述Agod基因，得到产重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的重组细胞。
所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。
上述构建方法中，所述微生物为真菌、细菌、酵母或藻。
上述构建方法中，所述真菌可为木霉属真菌。所述木霉属真菌具体可为里氏木霉(Trichoderma reesei)。
上述构建方法中，向受体细胞中导入所述Agod基因中，所述Agod基因通过含有所述Agod基因的表达盒导入所述受体细胞。所述表达盒中，启动Agod基因转录的启动子具体可为Pcbh1，Pcbh1的核苷酸序列可为SEQ ID No.1的第2778-4681位。所述表达盒中，终止Agod基因转录的终止子具体可为Tcbh1，Tcbh1的核苷酸序列可为SEQID No.1的第6521-8763位。所述表达盒的核苷酸序列具体如SEQ ID No.1的第2778-8763位所示的核苷酸序列。
上述构建方法中，所述表达盒通过Agod基因线性表达载体导入所述受体细胞，Agod基因线性表达载体是用限制性核酸内切酶Ase1酶切SEQ ID No.1所示的Agod基因表达载体(pPSK-AGOD-His6)得到的含有所述Agod基因的DNA片段。
上述按照重组细胞的构建方法构建的重组细胞也属于本发明的保护范围。
为解决上述技术问题，本发明还提供了制备重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的方法。
本发明所提供的制备重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的方法，包括培养所述重组细胞，得到重组黑曲霉葡萄糖氧化酶。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述1)或2)或3)所述的应用：
1)所述人工合成的用于编码重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的核酸分子在制备重组黑曲霉葡萄糖氧化酶中的应用；
2)所述与人工合成的用于编码重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的核酸分子相关的遗传材料在制备重组黑曲霉葡萄糖氧化酶中的应用；
3)所述重组细胞在制备重组黑曲霉葡萄糖氧化酶中的应用。
本申请中，所述葡萄糖氧化酶(重组黑曲霉葡萄糖氧化酶)的氨基酸序列可为SEQID No.5。
实验证明，将本发明的Agod基因导入里氏木霉Tu6△tku70中构建的重组里氏木霉Tu6△tku70::Agod能够成功地表达重组黑曲霉葡萄糖氧化酶，而且表达量较高，发酵液中的酶活力可达到137U/mL，是目前产葡萄糖氧化酶菌株中摇瓶发酵酶活力的最高水平；将发酵液中的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶通过镍柱纯化得到的蛋白溶液中的酶活力可达到342U/mL；重组里氏木霉Tu6△tku70::Agod表达得到的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的比活力为155U/mg蛋白，而且发酵工艺简单，不需转接，原料廉价易得，成本大大降低。采用本发明的方法制备的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的具有很好的热稳定性，在50℃保温4小时后残余相对酶活力维持在80％以上，在60℃保温4小时后残余相对酶活力依然维持在60％以上；在4℃低温条件下反应酶活力可达到80％，温度适应范围广；该酶在pH3.0-11之间均保持着80％以上的活性，具有较好的酸碱耐受性。因此，采用本发明方法制备的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶可广泛应用于食品医疗领域中。
附图说明
图1为重组质粒pSK-pyr4-1-pyr4-2的结构示意图。
图2为Tu6△tku70::Agod基因组DNA和Tu6△tku70基因组DNA的PCR扩增目的基因得到的产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道M为分子量为250-10000bp的DNAMarker，泳道1为Tu6△tku70基因组DNA的PCR扩增目的基因得到的产物，泳道2为Tu6△tku70::Agod基因组DNA的PCR扩增目的基因得到的产物。
图3为Tu6△tku70的发酵液、Tu6△tku70::Agod的发酵液和纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白溶液的12％SDS-PAGE电泳图。其中，泳道M为分子量为14.4-116KD的蛋白质Marker，泳道1为Tu6△tku70的发酵液，泳道2为Tu6△tku70::Agod的发酵液，泳道3为纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白溶液。
图4为葡萄糖氧化酶标准曲线。
图5为重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的不同温度条件下的相对酶活力曲线。
图6为重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod在50℃和60℃温度条件下不同保温时间的残余相对酶活力曲线。
图7为重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod在不同pH值条件下的相对酶活力曲线。
图8为重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod在不同pH值条件下保温1h后的残余相对酶活力曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的大肠杆菌(Escherichia coli)XL10-Gold(秦丽娜，董志扬.里氏木霉纤维素酶CBH1高效分泌表达系统研究.2012.)由本实验室保存，公众可从中国科学院微生物研究所获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70由本实验室保存，即为下述文献中的△tku70菌株:Zhang Guangtao,Lukas Hartl,AndreSchuster,etal.Gene targeting in a nonhomologous end joining deficientHypocrea jecorina.Journal of Biotechnology,2009,139:146-151。公众可从中国科学院微生物研究所获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的相关培养基及溶液如下：
里氏木霉产孢培养基：200g马铃薯、20g葡萄糖、20g琼脂粉，加入自来水定容至1L，自然pH，115℃高压蒸汽灭菌20分钟。
里氏木霉工业发酵培养基：1.5g玉米芯、0.9g麸皮、30mL 1.5％(质量百分浓度)玉米浆，pH值为4.8，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
里氏木霉基础培养基(MM)：5g(NH4)2SO4、15g KH2PO4、0.6g MgSO4、0.6g CaCl2、0.005g FeSO4·7H2O、0.0016g MnSO4·H2O、0.0014g ZnSO4·7H2O、0.002g CoCl2，加入蒸馏水定容至1L，pH值为5.3，115℃高压蒸汽灭菌20分钟。
LB培养基：10g蛋白胨、10g氯化钠、5g酵母提取物，加入蒸馏水定容至1L，然pH，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
裂解液由水和溶质组成，溶质及其浓度为：150mg/L裂解酶(lysing enzyme)(Sigma,产品目录号为：L1412-5G)、15mg/L纤维素酶(cellulase，ONOZUKA R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.CO,产品目录号：130918-01))和1.2M硫酸镁。
邻联茴香胺溶液由溶剂和溶质组成，pH值为6.0，溶剂为缓冲液6，溶质及其浓度为3.1mM邻联茴香胺。
18％(质量百分浓度)β-D-葡萄糖溶液：18gβ-D-葡萄糖，加入蒸馏水定容至100mL，过滤灭菌备用。
辣根过氧化物酶溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为去离子水，溶质及其浓度为90U/mL辣根过氧化物酶，4℃保存备用。
不同pH值的缓冲液的配制方法如下：
pH值为2.0的甘氨酸-盐酸缓冲液(命名为缓冲液1)：浓度为0.2M的甘氨酸溶液50mL,浓度为0.2M的盐酸44mL,加水至200mL。
pH值为2.5的甘氨酸-盐酸缓冲液(命名为缓冲液2)：浓度为0.2M的甘氨酸溶液50mL,浓度为0.2M的盐酸32.4mL,加水至200mL。
pH值为3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液(命名为缓冲液3)：浓度为0.2M的甘氨酸溶液50mL,浓度为0.2M的盐酸11.4mL,加水至200mL。
pH值为4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(命名为缓冲液4)：浓度为0.1M的柠檬酸溶液61.45mL,浓度为0.2M的磷酸氢二钠溶液38.55mL。
pH值为5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(命名为缓冲液5)：浓度为0.1M的柠檬酸溶液48.50mL,浓度为0.2M的磷酸氢二钠溶液51.50mL。
pH值为6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(命名为缓冲液6)：浓度为0.1M的柠檬酸溶液36.85mL,浓度为0.2M的磷酸氢二钠溶液63.15mL。
pH值为7.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(命名为缓冲液7)：浓度为0.1M的柠檬酸溶液17.65mL,浓度为0.2M的磷酸氢二钠溶液82.35mL。
pH值为8.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(命名为缓冲液8)：浓度为0.2M的甘氨酸溶液50mL,浓度为0.2M的氢氧化钠溶液4mL,加水至200mL。
pH值为9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(命名为缓冲液9)：浓度为0.2M的甘氨酸溶液50mL,浓度为0.2M的氢氧化钠溶液8.8mL,加水至200mL。
pH值为10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(命名为缓冲液10)：浓度为0.2M的甘氨酸溶液50mL,浓度为0.2M的氢氧化钠溶液32mL,加水至200mL。
pH值为11.0的磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液(命名为缓冲液11)：浓度为0.05M的磷酸氢二钠溶液50mL,浓度为0.1M的氢氧化钠溶液3.3mL,加水至100mL。
pH值为12.0的磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液(命名为缓冲液12)：浓度为0.05M的磷酸氢二钠溶液50mL,浓度为0.1M的氢氧化钠溶液26.9mL,加水至100mL。
实施例1、重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的制备与鉴定
一、表达重组黑曲霉葡萄糖氧化酶重组菌体细胞的制备
表达重组黑曲霉葡萄糖氧化酶重组菌体细胞的制备，包括向受体细胞中导入所述Agod基因，得到产重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的重组细胞。其中所述Agod基因的编码序列是SEQ ID No.1的第4733-6520位的DNA分子，用于编码SEQ ID No.5的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶。具体方法如下：
1、重组黑曲霉葡萄糖氧化酶表达载体构建
制备SEQ ID No.1的核苷酸序列所示的Agod基因表达载体pPSK-AGOD-His6，Agod基因表达载体pPSK-AGOD-His6表达SEQ ID No.5的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶，pPSK-AGOD-His6含有SEQ ID No.1的第2778-8763位核苷酸序列所示的Agod基因表达盒，Agod基因表达盒中，SEQ ID No.1的第2778-4681位是启动Agod基因转录的启动子Pcbh1，SEQ ID No.1的第4682-4732位是里氏木霉的信号肽编码序列；SEQ ID No.1的第4733-6499位是黑曲霉葡萄糖氧化酶的编码序列；SEQ ID No.1的第6500-6517位是6个组氨酸的编码序列；SEQ ID No.1的第6518-6520位是终止密码子；SEQ ID No.1的第6521-8763位是终止Agod基因转录的终止子Tcbh1。
pPSK-AGOD1-His6是Agod1基因(来源于黑曲霉)的表达载体，pPSK-AGOD1-His6是将pPSK-AGOD-His6中的SEQ ID No.1第4682-6520位所示的核苷酸序列替换为SEQID No.3所示的Agod1基因，SEQ ID No.1的其它核苷酸序列不变得到的重组载体。
2、筛选基因表达盒的构建
以Fpyr4-1(5’-AAGCTTGACTAGACTGACCCCCCCG-3’)(下划线为HindIII酶切位点)和Rpyr4-1(5’-CATATGCAACTGCATCCAAACCATCCTACC-3’)(下划线为NdeI酶切位点)为引物，进行PCR扩增，得到promoter-pyr4-terminator片段，约2.9kb，命名为pyr4-1，其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的第689-3608位所示的核苷酸序列；以Fpyr4-2(5’-CATATGGACTAGACTGACCCCCCC G-3’)(下划线为NdeI酶切位点)和Rpyr4-2(5’-GGATCCATCGATGGCGACCACCGAATGGGT TTC-3’)(下划线分别为BamHI和ClaI的酶切位点)为引物，进行PCR扩增，得到promoter部分序列，约1kb，命名为pyr4-2，其核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4的第3609-4590位所示的核苷酸序列。对酶切后的pBlueScript SK(+)载体、pyr4-1和pyr4-2片段进行胶回收后，通过酶切连接的方法构建载体pSK-pyr4-1-pyr4-2(图1)。连接反应体系包括：2μL 10*T4DNA Ligase buffer，6μL pyr4-1(2920bp；23.93ng/μL)，7.2μL pyr4-2(982bp；6.68ng/μL)，0.3μL pBlueScript SK(+)(3kb；44.54ng/μL)，0.2μL T4DNALigase(5U/μL)和4.3μL ddH2O，在22℃条件下反应10min进行连接。
3、里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70原生质体制备
1)取新鲜培养的斜面或平板上里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70的孢子，用适量无菌水洗涤孢子制成孢子悬液，采用200目筛子过滤除去残余的菌丝，得到过滤的孢子悬液。将过滤的孢子悬液接种到装有100mL MM培养基的500mL三角瓶中，28℃培养13-14h，至菌丝伸展，得到里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70的培养液。
2)将里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70的培养液经200目筛子过滤，收集筛子上的里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70菌体，采用无菌水洗涤筛子上的里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70菌体2-3次，最后用1.2M的硫酸镁溶液洗涤筛子上里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70菌体一次。
3)将筛子上的里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70菌体冲洗到装有15mL裂解液的三角瓶中，30℃反应1.5h，显微镜下观察原生质体产生的情况，1h后每隔10min取样观察一次。
4)当原生质体大量产生并仍有大量菌丝存在时，加入等体积的浓度为0.6M的山梨醇溶液终止步骤3)的裂解反应，得到里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70原生质体溶液，将里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70原生质体溶液经200目筛子过滤除去残余的菌丝，室温3000rpm离心10min收集里氏木霉(Trichoderm areesei)Tu6△tku70原生质体沉淀，得到里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70原生质体。
5)将里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70原生质体用浓度为1.0M山梨醇溶液重悬，室温3000rpm离心10min，弃上清，收集里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70原生质体；
6)重复步骤5)操作一次，将里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70原生质体悬浮于200μL浓度为1.0M的山梨醇溶液中，得到里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70原生质体的山梨醇溶液，使用血球板计数器观察并计数。
4、重组黑曲霉葡萄糖氧化酶表达载体的里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70原生质体转化
1)将重组质粒pSK-pyr4-1-pyr4-2、重组质粒pPSK-AGOD-His6和重组质粒pPSK-AGOD1-His6通过化学方法分别转化入大肠杆菌(Escherichia coli)XL10-Gold细胞中，分别得到重组大肠杆菌细胞XL10-Gold/pSK-pyr4-1-pyr4-2、重组大肠杆菌细胞XL10-Gold/pPSK-AGOD-His6和重组大肠杆菌细胞XL10-Gold/pPSK-AGOD1-His6，培养重组大肠杆菌细胞XL10-Gold/pSK-pyr4-1-pyr4-2、重组大肠杆菌细胞XL10-Gold/pPSK-AGOD-His6和重组大肠杆菌细胞XL10-Gold/pPSK-AGOD1-His6，对重组大肠杆菌细胞XL10-Gold/pSK-pyr4-1-pyr4-2中的pSK-pyr4-1-pyr4-2重组质粒、重组大肠杆菌细胞XL10-Gold/pPSK-AGOD-His6中的pPSK-AGOD-His6重组质粒和重组大肠杆菌细胞XL10-Gold/pPSK-AGOD1-His6中的pPSK-AGOD1-His6重组质粒进行大量抽提，分别得到重组质粒pSK-pyr4-1-pyr4-2、重组质粒pPSK-AGOD-His6和重组质粒pPSK-AGOD1-His6。采用Ase1(NEB,#R0526V)分别对重组质粒pPSK-AGOD-His6和重组质粒pPSK-AGOD1-His6进行线性化酶切，在300μL的酶切反应液中加入30μL浓度为3M的醋酸钠溶液(pH5.2)，4μL Precipitation Carrier和835μL无水乙醇，充分混匀后在4℃条件下12000rpm离心15min，弃上清，收集白色沉淀，采用70％乙醇洗涤沉淀两次，将沉淀用双蒸水溶解，使线性化片段的浓度达到微克级，分别得到线性化的pPSK-AGOD-His6片段(含有Agod基因表达盒)和线性化的pPSK-AGOD1-His6片段(含有Agod1基因表达盒)；
2)将重组质粒pSK-pyr4-1-pyr4-2分别与线性化的pPSK-AGOD-His6片段和线性化的pPSK-AGOD1-His6片段按摩尔比1:(3-10)的比例混合(总体积不超过20μL，分别得到重组质粒pSK-pyr4-1-pyr4-2与线性化的pPSK-AGOD-His6片段的混合液，重组质粒pSK-pyr4-1-pyr4-2与线性化的pPSK-AGOD1-His6片段的混合液；将20μL的重组质粒pSK-pyr4-1-pyr4-2与线性化的pPSK-AGOD-His6片段的混合液加入到200μL的3中步骤6)的里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70原生质体的山梨醇溶液中，得到重组质粒pSK-pyr4-1-pyr4-2、线性化的pPSK-AGOD-His6片段和里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70原生质体的混合溶液；将20μL的重组质粒pSK-pyr4-1-pyr4-2与线性化的pPSK-AGOD1-His6片段的混合液加入到200μL的3中步骤6)的里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70原生质体的山梨醇溶液中，得到重组质粒pSK-pyr4-1-pyr4-2、线性化的pPSK-AGOD1-His6片段和里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70原生质体的混合溶液；分别将重组质粒pSK-pyr4-1-pyr4-2、线性化的pPSK-AGOD-His6片段和里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70原生质体的混合溶液，重组质粒pSK-pyr4-1-pyr4-2、线性化的pPSK-AGOD1-His6片段和里氏木霉(Trichoderma reesei)Tu6△tku70原生质体的混合溶液轻轻混匀，分别加入50μL体积百分浓度为50％PEG4000溶液，混合均匀，冰浴30min，随后分别加入1mL体积百分浓度为50％PEG4000，混合均匀20-25℃放置20min，分别得到Tu6△tku70::Agod原生质体溶液和Tu6△tku70::Agod1原生质体溶液，对照组原生质体溶液采用等体积的双蒸水代替线性化的片段，命名为Tu6△tku70原生质体溶液；
3)在步骤2)的Tu6△tku70::Agod原生质体溶液、Tu6△tku70::Agod1原生质体溶液和Tu6△tku70原生质体溶液中分别加入1mL浓度为1M的山梨醇溶液，分别得到Tu6△tku70::Agod原生质体山梨醇溶液、Tu6△tku70::Agod1原生质体山梨醇溶液和Tu6△tku70原生质体山梨醇溶液，混匀后分别将Tu6△tku70::Agod原生质体山梨醇溶液、Tu6△tku70::Agod1原生质体山梨醇溶液和Tu6△tku70原生质体山梨醇溶液分别分装入EP管中，每种溶液4管，与稍冷却的含有浓度为1M山梨醇的MM培养基混匀后，分别铺于含有浓度为1M山梨醇的MM底层培养基上(MM培养基中不含抗生素)，分别得到Tu6△tku70::Agod原生质体培养板、Tu6△tku70::Agod1原生质体培养板和Tu6△tku70原生质体培养板；
4)将Tu6△tku70::Agod原生质体培养板、Tu6△tku70::Agod1原生质体培养板和Tu6△tku70原生质体培养板放于30℃恒温培养箱培养4-7d，分别得到Tu6△tku70::Agod原生质体转化子、Tu6△tku70::Agod1原生质体转化子和Tu6△tku70原生质体转化子；
5)分别将Tu6△tku70::Agod原生质体转化子、Tu6△tku70::Agod1原生质体转化子和Tu6△tku70原生质体转化子置于PDA平板上，30℃培养4-7d，待孢子成熟后，用无菌水将孢子洗出制成孢子悬液，分别得到重组菌株Tu6△tku70::Agod孢子悬液、Tu6△tku70::Agod1孢子悬液和Tu6△tku70孢子悬液，分别将Tu6△tku70::Agod孢子悬液、Tu6△tku70::Agod1孢子悬液和Tu6△tku70孢子悬液采用双蒸水进行103-107梯度稀释，分别得到Tu6△tku70::Agod孢子悬液梯度稀释液、Tu6△tku70::Agod1孢子悬液梯度稀释液和Tu6△tku70孢子悬液梯度稀释液，分别将Tu6△tku70::Agod孢子悬液梯度稀释液、Tu6△tku70::Agod1孢子悬液梯度稀释液和Tu6△tku70孢子悬液梯度稀释液涂布于MM+0.1％Triton X100的平板上进行30℃培养。待长出菌丝后，抽提基因组DNA，分别得到Tu6△tku70::Agod基因组DNA、Tu6△tku70::Agod1基因组DNA和Tu6△tku70基因组DNA，进行PCR验证：以Tu6△tku70::Agod基因组DNA为模板，以AGOD-F(5’-CTCCCACACTACATTAGGTCTAAC-3’)和AGOD-R(5’-TGCTAGCGTAGTCCTCAAGGATG G-3’)为引物，进行PCR扩增及测序验证，结果表明Tu6△tku70::Agod基因组DNA中的Agod基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1的第4733-6520位所示的核苷酸序列，Tu6△tku70::Agod基因组DNA可表达SEQ ID No.5所示的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶，SEQ ID No.1的第4733-6520位为重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的编码序列。图2为Tu6△tku70::Agod基因组DNA和Tu6△tku70基因组DNA的PCR扩增目的基因得到的产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中Tu6△tku70::Agod基因组DNA的PCR扩增产物中含有大小约为1.8kb的目的片段,与PCR测序结果相吻合；Tu6△tku70基因组DNA的PCR扩增产物中不含有目的基因。
二、重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的制备与鉴定
1、将步骤一中的重组菌株Tu6△tku70::Agod、Tu6△tku70::Agod1和Tu6△tku70分别加入到在30mL玉米浆工业发酵培养基中，接种后的玉米浆工业发酵培养基中孢子的含量为1×107cfu/mL，在30℃，200rpm条件下发酵6d，离心收集发酵液，分别得到Tu6△tku70::Agod的发酵液、Tu6△tku70::Agod1的发酵液和Tu6△tku70的发酵液。
2、将Tu6△tku70::Agod的发酵液、Tu6△tku70::Agod1的发酵液和Tu6△tku70的发酵液通过镍柱纯化后分别得到纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白溶液、纯化的Tu6△tku70::Agod1蛋白溶液和纯化的Tu6△tku70蛋白溶液。镍柱纯化采用Bindingbuffer，Binding buffer的pH值7.2，由溶质和溶剂组成，溶剂为pH值7.2，浓度为20mM的磷酸缓冲液，溶质及其浓度为500mM氯化钠。Elution buffer为含有浓度为0.5M咪唑的Binding buffer。将Tu6△tku70::Agod的发酵液、Tu6△tku70::Agod1的发酵液、Tu6△tku70的发酵液、纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白溶液、纯化的Tu6△tku70::Agod1蛋白溶液和纯化的Tu6△tku70蛋白溶液进行12％SDS-PAGE电泳。图3为Tu6△tku70的发酵液、Tu6△tku70::Agod的发酵液和纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白溶液的12％SDS-PAGE电泳图，Tu6△tku70::Agod的发酵液中含有分子量为70KDa的蛋白质条带，纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白溶液中含有分子量为70KDa的蛋白质条带，结果表明黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶在里氏木霉中成功分泌表达，且表达量高；Tu6△tku70::Agod1的发酵液和纯化的Tu6△tku70::Agod1蛋白溶液中不含有分子量为70KDa的蛋白质，未表达出黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶。将纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白进行质谱鉴定，鉴定结果表明纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白的氨基酸序列为SEQID No.5所示，是黑曲霉葡萄糖氧化酶，命名为重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod。
将纯化后的样品4℃保存备用，用于后期的酶学性质测定。
实施例2、重组黑曲霉葡萄糖氧化酶酶活测定及酶学性质研究
一、重组黑曲霉葡萄糖氧化酶酶活测定
1、重组黑曲霉葡萄糖氧化酶浓度的测定
采用鼎国Folin-酚蛋白定量试剂盒以folin-酚法分别测定实施例1制备的Tu6△tku70::Agod的发酵液中的蛋白质的浓度和纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白溶液中的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的浓度，以牛血清白蛋白(BSA)做标准曲线，分别测得Tu6△tku70::Agod的发酵液中的蛋白质的质量浓度为7mg/mL，纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白溶液中的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为2mg/mL。
2、葡萄糖氧化酶标准曲线的制作
以Sigma公司的葡萄糖氧化酶(G7141)为标准品，将葡萄糖氧化酶标准品配置成如下浓度梯度的葡萄糖氧化酶标准品溶液：0.2U/mL、0.25U/mL、0.3U/mL、0.4U/mL、0.6U/mL、0.8U/mL、1.0U/mL和1.2U/mL。在EP管中加入2.5mL浓度为260μM的邻联茴香胺溶液(用缓冲液6将浓度为3.1mM的邻联茴香胺溶液稀释获得)，0.3mL 18％(质量百分浓度)β-D-葡萄糖溶液和0.1mL 90U/mL的辣根过氧化物酶溶液，30℃保温2min，加入0.1mL上述各浓度的葡萄糖氧化酶标准品溶液，反应10min后加2mL浓度为2M的H2SO4溶液终止反应，在500nm处测吸光值OD500，绘制标准曲线(图4)。
3、重组黑曲霉葡萄糖氧化酶酶活测定
采用缓冲液6分别将蛋白质质量浓度为7mg/mL的Tu6△tku70::Agod的发酵液稀释成蛋白质质量浓度为0.014mg/mL的Tu6△tku70::Agod的发酵液稀释液(待测酶液)，重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为2mg/mL的纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白溶液稀释成重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白溶液稀释液(待测酶液)。
取2个EP管，依次编号为1和2，分别向每个EP管中加入2.5mL浓度为260μM的邻联茴香胺溶液(用缓冲液6将浓度为3.1mM的邻联茴香胺溶液稀释获得)，0.3mL 18％(质量百分浓度)β-D-葡萄糖溶液和0.1mL 90U/mL的辣根过氧化物酶溶液，30℃保温2min。然后向1号EP管中加入0.1mL质量浓度为0.014mg/mLTu6△tku70::Agod的发酵液稀释液，得到Tu6△tku70::Agod的发酵液的酶解反应液；向2号EP管中加入0.1mL重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白溶液稀释液，得到纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白溶液稀释液的酶解反应液。在30℃(酶解反应温度)反应10min，依次向1号和2号EP管中分别加入2mL浓度为2M的H2SO4溶液终止反应，分别得到Tu6△tku70::Agod的发酵液的酶解反应后的溶液和纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白溶液的酶解反应后的溶液。分别测定Tu6△tku70::Agod的发酵液的酶解反应后的溶液和纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白溶液的酶解反应后的溶液在500nm处的吸光值OD500(简称为实验组OD500)，将上述蛋白质质量浓度为0.014mg/mL Tu6△tku70::Agod的发酵液稀释液(待测酶液)进行热灭活后作为上述Tu6△tku70::Agod的发酵液稀释液(待测酶液)的酶活测定的空白对照；将上述重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白溶液稀释液(待测酶液)进行热灭活后作为上述纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白溶液稀释液(待测酶液)酶活测定的空白对照。根据标准曲线，分别计算Tu6△tku70::Agod的发酵液和纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白溶液中的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的酶活力，酶活力的计算公式为：酶活力(U/mL)＝(实验组OD500-空白对照组OD500-0.2251)/0.6713*稀释倍数。
一个酶活力单位为在30℃，pH6.0条件下每分钟氧化1mmol葡萄糖生成葡萄糖酸及过氧化氢所需酶量。
结果如表2所示：Tu6△tku70::Agod发酵液中的黑曲霉霉葡萄糖氧化酶Agod的酶活力(编号为1)为137U/mL，重组里氏木霉Tu6△tku70::Agod表达得到的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的比活力为155U/mg，是目前摇瓶发酵中的最高水平；镍柱纯化后的纯化的Tu6△tku70::Agod蛋白溶液中的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod(编号为2)的酶活力可达到342U/mL，重组里氏木霉Tu6△tku70::Agod表达得到的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的比活力为155U/mg。
表2、重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的酶活力测定
注：表2中数值为三次重复实验的平均值。
二、重组黑曲霉葡萄糖氧化酶的酶学性质研究
1、重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的酶活最适温度及热稳定性研究
将步骤一的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液，按照步骤一中的酶活测定方法将酶解反应温度分别替换为4℃、10℃、20℃、30℃、40℃和50℃，进行酶活力测定(待测酶活力)，酶活力最高时的反应温度即为该酶的最适反应温度，以酶解反应温度为10℃时的纯化的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod蛋白溶液中的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的酶活力做对照，测定吸光值OD500。相对酶活力的计算公式如下：相对酶活力＝待测酶活力/对照酶活力×100％。结果如图5所示，表明该酶的最适反应温度为10℃，且从4℃到50℃之间相对酶活力均维持在60％以上，温度适应范围广。
将步骤一的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液(待测酶液)分别在50℃和60℃温度条件下均保温1h、2h、3h和4h后，按照步骤一中的酶活测定方法分别测定在50℃和60℃温度条件下保温1h、2h、3h和4h后的纯化的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的酶活力(残余待测酶活力)，以30℃温度条件下未保温的纯化的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod蛋白溶液中的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod酶活力做对照，测定吸光值OD500，绘制50℃和60℃温度条件下不同保温时间的纯化的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod蛋白溶液中的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod酶活力的热稳定性曲线。残余相对酶活力的计算公式如下：残余相对酶活力＝残余待测酶活力/对照酶活力×100％。结果如图6所示，从曲线可以看出，在50℃保温4h后纯化的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的酶活力依然维持在80％以上，在60℃保温4h后纯化的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的酶活力依然维持在60％以上，表明重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod具有较好的热稳定性。
2、重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的酶活最适pH值及酸碱稳定性研究
采用不同pH值的缓冲液稀释浓度为3.1mM的邻联茴香胺溶液，分别得到含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液1，含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液2，含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液3，含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液4，含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液5，含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液6，含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液7，含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液8，含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液9和含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液10。按照步骤一中的酶活测定方法分别测定加入上述10种不同pH值的含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的酶活力(待测酶活力)，每个样品设三个重复，酶活力最高时的pH即为该酶的最适pH，以加入含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液4的纯化的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的酶活力做对照，测定吸光值OD500，绘制相对酶活力曲线，从图7中可以看出该酶的最适反应pH值为4.0。相对酶活力的计算公式如下：相对酶活力＝待测酶活力/对照酶活力×100％。
采用缓冲液1对重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为2mg/mL纯化的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod蛋白溶液进行稀释得到重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液1；采用缓冲液2对重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为2mg/mL纯化的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod蛋白溶液进行稀释得到重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液2；采用缓冲液3对重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为2mg/mL纯化的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod蛋白溶液进行稀释得到重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液3；采用缓冲液5对重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为2mg/mL纯化的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod蛋白溶液进行稀释得到重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液5；采用缓冲液6对重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为2mg/mL纯化的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod蛋白溶液进行稀释得到重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液6；采用缓冲液7对重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为2mg/mL纯化的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod蛋白溶液进行稀释得到重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液7；采用缓冲液9对重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为2mg/mL纯化的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod蛋白溶液进行稀释得到重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液9；采用缓冲液10对重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为2mg/mL纯化的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod蛋白溶液进行稀释得到重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液10；采用缓冲液11对重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为2mg/mL纯化的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod蛋白溶液进行稀释得到重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液11；采用缓冲液12对重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为2mg/mL纯化的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod蛋白溶液进行稀释得到重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液12，将上述10种不同pH值的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液在30℃保温1h后，按照步骤一中的酶活测定方法分别测定上述10种重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液中的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的酶活力(残余待测酶活力)，其中重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液1的酶活力测定加入含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液1，重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液2的酶活力测定加入含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液2，重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液3的酶活力测定加入含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液3，重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液5的酶活力测定加入含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液5，重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液6的酶活力测定加入含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液6，重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液7的酶活力测定加入含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液7，重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液9的酶活力测定加入含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液9，重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液10的酶活力测定加入含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液10，重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液11的酶活力测定加入含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液11，重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液12的酶活力测定加入含有浓度为260μM的邻联茴香胺的缓冲液12。以在30℃条件下未做保温的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的质量浓度为0.004mg/mL的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod的蛋白溶液稀释液6中的重组黑曲霉葡萄糖氧化酶Agod酶活力值作为对照，测定吸光值OD500，绘制残余相对酶活力曲线，残余相对酶活力的计算公式如下：残余相对酶活力＝残余待测酶活力/对照酶活力×100％。从图8中可以看出该酶在pH3.0-11之间均保持着80％以上的活性，表明该酶对酸碱的耐受性较好。

Claims (10)

1.核酸分子，是Agod基因或RNA分子，
所述Agod基因为如下a)-f)中任一所述的DNA分子或cDNA分子：
a)其编码序列是SEQ ID No.1的第4682-6520位的DNA分子或cDNA分子；
b)其编码序列是SEQ ID No.1的第4733-6520位的DNA分子或cDNA分子；
c)其编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子或cDNA分子；
d)其编码序列是SEQ ID No.2的第52-1821位的DNA分子或cDNA分子；
e)与a)或b)或c)或d)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且与a)或b)或c)或d)限定的核苷酸序列具有相同功能的cDNA分子或基因组DNA分子；
f)在严格条件下与a)或b)或c)或d)限定的核苷酸序列杂交，且与a)或b)或c)或d)具有相同功能的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述RNA分子为如下g)-j)中任一所述的RNA分子：
g)其编码序列是将SEQ ID No.1的第4682-6520位中的T均替换为U，其它核苷酸不变得到的RNA分子；
h)其编码序列是将SEQ ID No.1的第4733-6520位中的T均替换为U，其它核苷酸不变得到的RNA分子；
i)其编码序列是将SEQ ID No.2中的T均替换为U，其它核苷酸不变得到的RNA分子；
j)其编码序列是将SEQ ID No.2的第52-1821位中的T均替换为U，其它核苷酸不变得到的RNA分子。
2.与权利要求1所述核酸分子相关的遗传材料，为下述B1)至B5)中至少一种：
B1)含有权利要求1所述核酸分子的表达盒；
B2)含有权利要求1所述核酸分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；
B3)含有权利要求1所述核酸分子的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B4)含有权利要求1所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B2)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B5)含有权利要求1所述核酸分子的转基因动物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因动物细胞系、或含有B2)所述重组载体的转基因动物细胞系。
3.重组细胞的构建方法，包括对受体细胞中导入权利要求1所述Agod基因，得到产葡萄糖氧化酶的重组细胞。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述微生物为真菌、细菌、酵母或藻。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述真菌为木霉属真菌。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：所述木霉属真菌为里氏木霉。
8.按照权利要求3-7中任一所述方法构建的重组细胞。
9.制备葡萄糖氧化酶的方法，包括培养权利要求3-8中任一所述重组细胞，得到葡萄糖氧化酶。
10.下述1)或2)或3)所述的应用：
1)权利要求1所述核酸分子在制备葡萄糖氧化酶中的应用；
2)权利要求2所述遗传材料在制备葡萄糖氧化酶中的应用；
3)权利要求8所述重组细胞在制备葡萄糖氧化酶中的应用。
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