CN103436575B

CN103436575B - 一种毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基及高密度发酵方法

Info

Publication number: CN103436575B
Application number: CN201310357119.XA
Authority: CN
Inventors: 唐语谦; 钟凤; 陈艺; 吴晖; 赖富饶; 肖俊梅; 余以刚; 肖性龙; 李晓凤; 刘冬梅
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: Henan billions of Zhongyuan Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2013-08-15
Filing date: 2013-08-15
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2033-08-15
Also published as: CN103436575A

Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，公开了一种毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基及高密度发酵方法。该培养基配方为：胰蛋白胨19～21g/L，酵母浸膏9～11g/L，磷酸缓冲液终浓度100mmol/L，无氨基氮源12.8～14.8g/L，生物素4×10^-4g/L，甘氨酸0.05～0.15wt%和体积浓度为0.5％的甲醇，pH为6～8。本发明还公开了一种基于上述毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基的高密度发酵方法，利用本发酵方法发酵毕赤酵母重组菌，可获得高达130mg/L以上的重组蛋白表达量。

Description

一种毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基及高密度发酵方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉及一种毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基及高密度发酵方法。

背景技术

酵母是一类单细胞低等真核生物，它既具有类似原核生物易培养、繁殖快、便于遗传操作等生长特性，又具有典型真核生物的分子和细胞生物学特性。作为真核表达系统，毕赤酵母表达外源基因具有许多其它蛋白表达系统所不具备的优点：分子遗传水平的操作简单，易于构建高稳定性的工程菌，一般不会出现外源基因随生长繁殖而丢失现象；具有强有力的乙醇氧化酶基因（AOX1）或磷酸甘油酸脱氢酶（GAP）基因启动子作为外源基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；能在胞内表达或分泌型高水平表达重组蛋白；蛋白质翻译后修饰更接近高等真核生物，如蛋白糖基化、二硫键形成等，重组蛋白容易正确折叠；重组蛋白能大批量发酵生产，影响重组蛋白产量及品质的因素易于控制。毕赤酵母表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要的作用，促进更多外源基因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工程产品。

毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4-Prx发酵生成的重组蛋白可将残留在农产品和饲料中的玉米赤霉烯酮毒素降解，从而提高农产品和饲料的品质，消除玉米赤霉烯酮毒素对养殖业及饲料工业的危害。因此，这种具有脱毒功能重组蛋白的生产将具有很好的应用前景。

在研究毕赤酵母对外源蛋白的表达时，国内外的学者发现毕赤酵母液泡中含有多种蛋白酶（李忠琴,许小平,杨海麟,王武.辣根过氧化物酶分光光度法测定黄嘌呤氧化酶的活性[J].分析化学,2006,(6):821-825.），并认为蛋白酶是影响外源蛋白表达的重要因素之一。同时发现，这些蛋白酶的酶活水平随着诱导环境中的营养物质的差异而有所不同，特别是氮源的缺乏会造成发酵液蛋白酶活力的增强（马晟利,孙德刚,吴双燕.健康青少年口腔优势菌产生过氧化氢的初步研究[J].中国微生态学杂志,2010,22(11):1008-1011.），培养基中补加一些酪蛋白水解物、胃蛋白水解物或者直接添加各类氨基酸都是控制蛋白酶活性的有效措施（Xianqin Yang,Kesen Ma.Determination of hydrogen peroxidegenerated by reduced nicotinamide adenine dinucleotide oxidase[J].AnalyticalBiochemistry,2005,344:130-134.）；另外一些学者在研究中发现，采用控制pH值的方法可以有效的控制发酵液中蛋白酶的活力，使外源蛋白的表达量达到最大。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基，利用该培养基能更有效发酵毕赤酵母重组菌以获得高蛋白产量。

本发明另一目的在于提供一种基于上述毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基的高密度发酵方法，该方法利用上述毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基，并控制发酵条件，从而获得高蛋白量。

本发明再一目的在于提供上述高密度发酵方法在发酵毕赤酵母重组菌中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基，其配方为：胰蛋白胨19～21g/L，酵母浸膏9～11g/L，磷酸缓冲液终浓度100mmol/L，无氨基氮源（YNB）12.8～14.8g/L，生物素4×10^-4g/L，甘氨酸0.05～0.15wt%和体积浓度为0.5％的甲醇，pH为6～8。

所述的毕赤酵母重组菌指以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115作为表达宿主、以获取蛋白表达为目的的基因重组菌。

优选地，所述的毕赤酵母重组菌指毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4-Prx或毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-preproHD5。

所述的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基为液体培养基。

一种基于上述毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基的高密度发酵方法，具体包含以下步骤：

（1）种液的制备：将毕赤酵母重组菌甘油菌种于麦芽汁培养基两次平板活化后，取菌种接入BMGY液体培养基中，28～30℃，200～250r/min摇瓶培养12～18h，得到种液。

（2）高密度发酵：将步骤（1）制得的种液离心收集菌体，并用灭菌蒸馏水洗涤后，接入毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基中，28～30℃，200～250r/min摇瓶培养发酵；每隔24h补加甲醇至终体积浓度为0.5%，发酵培养64～72h，终止发酵。

步骤（2）所述的离心收集菌体指在离心速率为4000～5000r/min下离心5～10min。

步骤（1）的BMGY液体培养基由以下方法制备得到：胰蛋白胨20g/L，酵母浸膏10g/L，121℃，灭菌20min后，加入100mmol/L pH6的磷酸钾，无氨基氮源（YNB）13.4g/L，生物素4×10^-4g/L，甘油10g/L。

步骤（1）中，菌种液体培养是本领域技术人员的常用操作，其中用到的麦芽汁培养基平板和BMGY培养基均采用标准配方配制。

步骤（1）中，所述的毕赤酵母重组菌甘油菌种指常规甘油-80℃保存的毕赤酵母重组菌种。为了取得很好的种子活化效果，对其进行两次平板活化，两次平板活化后再进行BMGY培养基中摇瓶培养12～18h，从而得到所需种液；因为经过了两次平板活化，所以能够确保甘油的完全去除，菌种完全恢复，有利于后期实验。

步骤（1）中限定了种液摇瓶培养时间为12～18h，这是因为此时重组菌已达到对数生长中期，生长力旺盛、菌体数量多，区别于常规的培养时间24h，该培养方法与发酵方法结合可最佳表达重组蛋白。

本发明的机理为：

本发明高密度发酵培养基中，甘氨酸最佳添加量为0.05～0.15wt%，区别于本技术领域的人员常用毕赤酵母诱导培养基BMMY，该发酵方法根据重组蛋白的氨基酸序列，选择性的加入含量较高的几种氨基酸，并根据毕赤酵母重组菌的重组蛋白合成率最终确定了甘氨酸的添加量为0.05～0.15wt%，从而实现毕赤酵母重组菌的高效率培养及表达。培养基中甘氨酸的添加会降低发酵液中蛋白酶的活性，减少了目的蛋白的降解，从而提高了重组蛋白的表达量。同时，氨基酸的添加补充了表达后期培养基中的氮源，使得细胞机体有足够的氮源维持细胞的正常生理活动和细胞活力，减少了因细胞活力降低而增加的蛋白酶的分泌量，从而降低了蛋白酶对重组蛋白的水解作用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：

（1）本发明对发酵培养基配方及其发酵条件进行了研究改进，培养基中甘氨酸的添加有利于毕赤酵母重组菌的产物合成；

（2）本发明的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养方法，pH控制在6～8，温度为28～30℃，从而保证了高产率合成重组蛋白的实现；

（3）本发明的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养方法，重组蛋白的表达量保持在60.0mg/L以上，在较优条件下可达130mg/L以上，明显优于现有发酵工艺，说明该发酵方法可有效获得高产量的重组蛋白，将为消除玉米赤霉烯酮毒素对养殖业及饲料工业的危害起重要作用，并带来良好的经济效益和环境效益。

附图说明

图1为实施例1中毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4-Prx在高密度发酵培养基合成重组蛋白含量图。其中，培养基pH为6，培养条件为28℃、200r/min发酵培养64h。

图2为实施例2中毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4-Prx在高密度发酵培养基合成重组蛋白含量图。其中，培养基pH为7，培养条件为29℃、230r/min发酵培养68h。

图3为实施例3中毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4-Prx在高密度发酵培养基合成重组蛋白含量图。其中，培养基pH为7，培养条件为30℃、230r/min发酵培养72h。

图4为实施例4中毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4-Prx在高密度发酵培养基合成重组蛋白含量图。其中，培养基pH为8，培养条件为30℃、250r/min发酵培养72h。

图5为实施例5中毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-preproHD5在高密度发酵培养基合成重组蛋白含量图。其中，培养基pH为7，培养条件为30℃、230r/min发酵培养72h。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4-Prx的高密度发酵

（1）毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4-Prx的制备：

（一）目的基因A4-Prx的扩增；

（1）质粒pPIC9K-A4-Prx的构建及其验证

①目的序列设计与合成：按Genbank上不动杆菌Acinetobacter sp.SM04的JF964958.1序列，依照表达载体pPIC9K的多克隆位点，选择AvrⅡ和NotI酶切位点，设计引物（P1，P2）用于从Acinetobacter sp.SM04的总DNA中扩增目的序列。具体序列如下：

JF964958.1序列：

ATGAGCTTGATTAATACTGAAGTTAAACCATTCCAAGCAACTGCTTACCACAACGGCCAATTTGTTGAAGTTAACGAAACTAACCTTAAAGGTAAATGGTCTGTTGTATTCTTCTATCCAGCTGACTTCACTTTCGTTTGCCCAACTGAACTTGGTGACTTAGCTGACAACTACGCTGAATTCCAAAAACTTGGTGTTGAAATTTATGCTGTATCTACTGATACACACTTCACTCACAAAGCTTGGCACGACACTTCTGAAGAAATCAAAAAAATCCAATATCCATTAGTTGGTGACCCAACTTGGACTCTTTCTAAAAACTTCGACGTTCTTATCGAATCTGAAGGTTTAGCTGACCGTGGTACTTTCGTTATCGATCCAGAAGGTAAAATCCAAATCGTTGAACTCAACGCTGGTGGTATCGGCCGTGACGCATCTGAACTTCTTCGTAAAGTAAAAGCTGCTCAATACGTACACGCTCACCCAGGTGAAGTTTGTCCAGCTAAATGGAAAGAAGGCGAAGCTACTCTTGCTCCATCTATCGACTTAGTTGGTAAAATCTAA

上游引物P1：5’-TTACCTAGGATGAGCTTGATTAATACTG-3’

下游引物P2：5’-TATATTGCGGCCGCTTAGATTTTACCA-3’

引物的终浓度为20μmol/L，-20℃储存备用。

PCR反应体系原料配比如下：

以Acinetobacter sp.SM04的总DNA为模板，PCR扩增出末端带有AvrⅡ和Not I酶切位点的目的基因，A4-Prx的基因序列PCR扩增条件：94℃预变性2min，94℃变性30s，63℃退火50s，72℃延伸60s，32个循环后于72℃继续延伸10min，4℃保存。

所述双酶切所用限制性内切酶为AvrⅡ和Not I。用电泳并用酚氯仿法或PCR纯化试剂盒回收目的片段。

②质粒构建：

a.酶切

用酚氯仿或PCR纯化试剂盒准备目的片段A4-Prx序列和质粒pPIC9K，并用内切酶AvrⅡ和Not I双酶切；

Ⅰ.原料配比如下：

选取目的片段A4-Prx序列、10×Buffer、内切酶AvrⅡ、内切酶Not I和无菌水，在37℃水浴酶切12h；电泳并用酚氯仿法或PCR纯化试剂盒回收A4-Prx过氧化物酶序列。

Ⅱ.原料配比如下：

选取质粒pPIC9K、10×Buffer、内切酶AvrⅡ、内切酶Not I和无菌水，在37℃水浴酶切12h；电泳并用酚氯仿法或PCR纯化试剂盒回收质粒pPIC9K序列。

b.连接

将酶切后的目的片段A4-Prx序列和质粒pPIC9K的摩尔比3:1混合，得到混合DNA，用T4连接酶连接；

原料配比如下：

T4连接酶 1μL

T4连接酶缓冲液 2μL

混合DNA 7μL。

选取T4连接酶、T4连接酶缓冲液和混合DNA，在4℃连接过夜，得到连接产物pPIC9K-A4-Prx；连接产物pPIC9K-A4-Prx转化大肠杆菌DH5α：将10μL上述连接产物pPIC9K-A4-Prx与100μL大肠杆菌DH5α（购于Takara公司）感受态细胞混合，冰上放置30min，然后42℃热击1～2min；再放置在冰上冷却1～2min后加入500μL的LB培养基，37℃振荡培养1h；取100μL上述培养物涂布到含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养过夜，得到大肠杆菌DH5α/pPIC9K-A4-Prx。

（二）菌株的构建和筛选：

（1）质粒的线性化与转化：

质粒的线性化：从大肠杆菌DH5α/pPIC9K-A4-Prx中提取质粒pPIC9K-A4-Prx；采用内切酶Sac I8μL、缓冲液10×H Buffer2μL、无菌水8μL和8μL质粒pPIC9K-A4-Prx，其中内切酶Sac I的浓度为2U/μL，在37℃孵育4h，用PCR纯化试剂盒纯化线性化的质粒pPIC9K-A4-Prx备用。

取5.0～9.0mL巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115（购买于Invitrogen公司）的一级种子液，接种到100mL YPD培养基（盛于1000mL的三角瓶中）中，使初始OD600值为0.2～0.3。振荡培养（28℃，200r/min）3h后测定培养液OD600值，OD600值为0.4～0.5时停止培养；离心回收细胞（6000r/min，5min，室温），用50mL无菌水洗涤菌体3次；用1.5mL1.1×TE/LiAc（或1.1×TE/LiCl）溶液洗涤菌体1次，离心（12000r/min，15s），弃上清，用500μL1.1×TE/LiAc（或1.1×TE/LiCl）溶液悬浮细胞；然后取100μL氯化锂悬浮细胞与3μL Sac I线性化处理的重组质粒pPIC9K-A4-Prx，再加入10μL变性处理的Herring Testes Carrier DNA轻轻混匀；加入600μL PEG/LiAc溶液混匀；30℃温育30min，每隔10min轻摇振荡一次，以混匀溶液；加入70μL DMSO，轻摇混匀；42℃热击15min，冰浴15min；4℃，14000r/min高速离心5min；弃上清，用500μL TE溶液悬浮细胞；取200μL涂布于MD培养基上，30℃培养2-3d，得到重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-A4-Prx。

（2）菌株的筛选：

从重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-A4-Prx菌株中挑选单菌落，进行诱导表达，首先采用菌落PCR来剔除假阳性菌株，保留阳性菌株；然后，再对阳性菌株进行再一次的诱导表达，检测其上清液中蛋白的含量及对ZEN降解的效率，选取降解效率最高的菌株的最佳菌株，得到一株重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-A4-Prx。

（2）BMGY液体培养基的配制：胰蛋白胨（购自广州健阳生物工程有限公司）20g/L，酵母浸膏（购自广州健阳生物工程有限公司）10g/L，121℃，灭菌20min后，加入100mmol/L磷酸钾（pH6），无氨基酸氮源（YNB）13.4g/L（购自广州健阳生物工程有限公司），生物素4×10^-4g/L（过滤灭菌）（购自广州健阳生物工程有限公司），甘油10g/L。

（3）毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基的制备：胰蛋白胨19g/L，酵母浸膏9g/L，121℃，灭菌20min后，加入磷酸缓冲液终浓度100mmol/L，无氨基氮源（YNB）12.8g/L，生物素4×10^-4g/L（过滤灭菌），甘氨酸（购自广州健阳生物工程有限公司）0.05wt%和甲醇0.5％（体积浓度），调节pH为6。

（4）磷酸缓冲液的配置（1mol/L pH6）：称取K₂HPO₄15.06g，KH₂PO₄59.06g，分别用66mL和434mL去离子水溶解。溶解完全后，将K₂HPO₄溶液缓慢加入KH₂PO₄溶液中，调节到pH6。

（5）种液的制备

将常规甘油-80℃保存的毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4-Prx甘油菌种划线于麦芽汁培养基平板（购买于广州卯林化学试剂公司）上，放置28℃培养箱中培养2天，直至长出单菌落；再挑取饱满的单菌落划线接种于麦芽汁培养基平板上，放置28℃培养箱中培养2天后后，取饱满的菌种接入50mLBMGY液体培养基中，28℃，200rpm摇瓶培养18h，得到种液。

（6）高密度发酵

在无菌操作室中，在火焰的保护下将步骤（4）制得的种液离心（5000r/min，5min）收集菌体，并用灭菌蒸馏水摇洗两次后，接入步骤（3）制备得到的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基中，28℃，200rpm摇瓶培养发酵；每隔24h补加甲醇至终体积浓度为0.5%，发酵培养64h后，终止发酵。对比实验：发酵培养基为BMMY，28℃、pH6、200rpm发酵64h。检测重组蛋白的表达量（结果见图1）。

由图1可见，本发明发酵方法的毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4-Prx的重组蛋白表达量高达114.23mg/L。

实施例2：毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4-Prx的高密度发酵

（1）BMGY液体培养基的制备、种液的制备同实施例1。

（2）毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母浸膏10g/L，121℃，灭菌20min后，加入磷酸缓冲液终浓度100mmol/L，无氨基氮源（YNB）13.8g/L，生物素4×10^-4g/L（过滤灭菌），甘氨酸0.10wt%和甲醇0.5％（体积浓度），调节pH为7。

（3）高密度发酵

在无菌操作室中，在火焰的保护下将步骤（1）制得的种液离心（4500r/min，8min）收集菌体，并用灭菌蒸馏水摇洗两次后，接入步骤（2）制备得到的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基中，发酵温度分别为29℃，230rpm摇瓶培养发酵；每隔24h补加甲醇至终体积浓度为0.5%，发酵培养68h后，终止发酵。对比实验：发酵培养基为BMMY，29℃、pH7、230rpm发酵68h。检测重组蛋白的表达量（结果见图2）。

由图2可见，本发明发酵方法的毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4-Prx在30℃的重组蛋白表达量高达94.73mg/L。

实施例3：毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4-Prx的高密度发酵

（1）BMGY液体培养基的制备、种液的制备同实施例1。

（3）高密度发酵

在无菌操作室中，在火焰的保护下将步骤（1）制得的种液离心（4500r/min，8min）收集菌体，并用灭菌蒸馏水摇洗两次后，接入步骤（2）制备得到的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基中，发酵温度分别为30℃，230rpm摇瓶培养发酵；每隔24h补加甲醇至终体积浓度为0.5%，发酵培养72h后，终止发酵。对比实验：发酵培养基为BMMY，30℃、pH7、230rpm发酵72h。检测重组蛋白的表达量（结果见图3）。

由图3可见，本发明发酵方法的毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4-Prx在30℃的重组蛋白表达量高达130.39mg/L。

实施例4：毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4-Prx的高密度发酵

（1）BMGY液体培养基的制备、种液的制备同实施例1。

（2）毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基：胰蛋白胨21g/L，酵母浸膏11g/L，121℃，灭菌20min后，加入磷酸缓冲液终浓度100mmol/L，无氨基氮源（YNB）14.8g/L，生物素4×10^-4g/L（过滤灭菌），甘氨酸0.15wt%和甲醇0.5％（体积浓度），调节pH为8。

（3）高密度发酵

在无菌操作室中，在火焰的保护下将步骤（1）制得的种液离心（5000r/min，10min）收集菌体，并用灭菌蒸馏水摇洗两次后，接入步骤（2）制备得到的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基中，30℃，250rpm摇瓶培养发酵；每隔24h补加甲醇至终体积浓度为0.5%，发酵培养72h后，终止发酵。对比实验：发酵培养基为BMMY，30℃、pH8、250rpm发酵72h。检测重组蛋白的表达量（结果见图4）。

由图4可见，本发明发酵方法的毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4-Prx的重组蛋白表达量高达111.54mg/L。

实施例5：毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-preproHD5的高密度发酵

（1）毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-preproHD5的制备：参照《人α-防御素5前体蛋白在毕赤酵母中分泌表达的研究》（现代食品科技,2010,Vol.26,No.11,1182-1184.）制备得到。

根据HD5前体基因序列，设计了一对扩增出目的基因引物P1’和P2’，其序列如下：

基因引物P1’：5'TTAGAATTCATGAGGACCATCGCCATCCTTGCTG'3（EcoRI），

基因引物P2’：5'TATAGCGGCCGCCTAGCGACAGCAGAGTCTGTAGA'3（NotI）。电泳鉴定后将其克隆到载体pPIC9K，并转化DH5α受体菌。

HD5前体基因片段和载体pPIC9K分别经EcoRI和NotI双酶切后，再经T4连接酶连接，构建HD5前体基因的重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-preproHD5。SacI线性化pPIC9K-preproHD5后，LiCl法转化入毕赤酵母GS115感受态细胞，立即涂布于MD平板，得到毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-preproHD5。

酵母表达质粒pPIC9K、宿主菌GS115为Invitrogen公司产品。限制性内切酶EcoRI、NotI、SacI，购自大连宝生物公司；T4连接酶购自NEB公司；酵母氮源（YNB），购自Sigma公司；其它试剂均为分析纯。培养基YPD、MD、MM、BNGY、BMMY等均按Invitrogen毕赤酵母表达操作手册配方配制。

（2）BMGY液体培养基的制备、种液的制备同实施例1。

（3）毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母浸膏10g/L，121℃，灭菌20min后，加入磷酸缓冲液终浓度100mmol/L，无氨基氮源（YNB）13.8g/L，生物素4×10^-4g/L（过滤灭菌），甘氨酸0.10wt%和甲醇0.5％（体积浓度），调节pH为7。

（4）高密度发酵

在无菌操作室中，在火焰的保护下将步骤（2）制得的种液离心（4500r/min，8min）收集菌体，并用灭菌蒸馏水摇洗两次后，接入步骤（3）制备得到的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基中，发酵温度分别为30℃，230rpm摇瓶培养发酵；每隔24h补加甲醇至终体积浓度为0.5%，发酵培养72h后，终止发酵。对比实验：发酵培养基为BMMY，30℃、pH7、230rpm发酵72h。检测重组蛋白的表达量（结果见图5）。

由图5可见，毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-preproHD5在本发明培养基中30℃的重组蛋白表达量高达188.39mg/L。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基，其特征在于配方为：胰蛋白胨19～21 g/L，酵母浸膏9～11 g/L，磷酸缓冲液终浓度100 mmol/L，无氨基氮源 12.8～14.8 g/L，生物素 4×10^-4 g/L，甘氨酸0.05～0.15 wt%和体积浓度为0.5 %的甲醇，pH为6～8；

所述的毕赤酵母重组菌指以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115作为表达宿主的基因重组菌。

2.根据权利要求1所述的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基，其特征在于：所述的毕赤酵母重组菌指毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4-Prx或毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-preproHD5；

所述毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4-Prx中的A4-Prx的核苷酸序列为SEQ ID No: 1，酶切位点为AvrⅡ和Not I。

3.根据权利要求1所述的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基，其特征在于：所述的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基为液体培养基。

4.一种基于权利要求1所述的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基的高密度发酵方法，其特征在于具体包含以下步骤：

（1）种液的制备：将毕赤酵母重组菌甘油菌种于麦芽汁培养基两次平板活化后，取菌种接入BMGY液体培养基中，28～30 ℃，200～250 r/min摇瓶培养12～18 h，得到种液；

（2）高密度发酵：将步骤（1）制得的种液离心收集菌体，并用灭菌蒸馏水洗涤后，接入毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基中，28～30℃，200～250 r/min摇瓶培养发酵；每隔24 h补加甲醇至终体积浓度为0.5 %，发酵培养64～72 h，终止发酵。

5.根据权利要求4所述的基于毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基的高密度发酵方法，其特征在于：步骤（1）所述的BMGY液体培养基由以下方法制备得到：胰蛋白胨 20 g/L，酵母浸膏10 g/L，121℃，灭菌20 min后，加入100 mmol/L pH 6的磷酸钾，无氨基氮源 13.4 g/L，生物素 4×10^-4 g/L，甘油10 g/L。

6.根据权利要求4所述的基于毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基的高密度发酵方法，其特征在于：步骤（2）所述的离心收集菌体指在离心速率为4000～5000 r/min下离心5 ～10 min。