CN102994541A - 一种共表达upr关键基因和下游靶基因增强葡萄糖氧化酶分泌的方法 - Google Patents

一种共表达upr关键基因和下游靶基因增强葡萄糖氧化酶分泌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种共表达UPR关键基因和下游靶基因增强分泌表达葡萄糖氧化酶的方法，属于基因工程技术领域。本发明采用基因重组技术将毕赤酵母UPR关键基因Haclp与下游靶基因Pdi1、Ero1、Lhs1、Kar2、Sil1分别克隆连接到毕赤酵母表达载体pPICZα与pPIC3.5K，并转化入Pichia pastoris GS115-pPIC9K-GOD保藏编号为CCTCC NO：M 2012266的菌株中，经筛选鉴定得到一株较原有菌株增强分泌表达葡萄糖氧化酶的菌株。该菌株表达的葡萄糖氧化酶在3L发酵罐上酶活585U/mL。这为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。

Description

一种共表达UPR关键基因和下游靶基因增强葡萄糖氧化酶分泌的方法
技术领域
一种共表达UPR关键基因和下游靶基因增强分泌表达葡萄糖氧化酶的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
葡萄糖氧化酶是生物领域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks将GOD固定在Clark氧电极表面，将其应用于血糖测定以来，GOD被广泛应用于食品、饲料、医药等许多相关领域。
在食品工业中，由于氧的存在，引起许多不利于产品质量的化学反应，并为许多微生物生长创造了条件。目前，许多国家已将GOD作为工人的安全抗氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中。虽然用途多样，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成过氧化氢、形成葡萄糖酸四个方面。利用其专一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析仪，能快速准确简易地测定各种食品中的葡萄糖含量，指导生产。
在医药工业中，GOD作为试剂盒、酶电极等用于血清(浆)、尿液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析;GOD制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑、牙垢和龋齿的形成防止口腔疾病和牙病的发生。此外，由于可以催化生成H2O2，还可用于对H2O2敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗。
GOD还是一种新型的酶饲料添加剂，能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。含葡萄糖氧化酶、乳酸过氧化物和乳铁蛋白的混合饲料添加剂，可用于预防牲畜胃肠道感染、腹泻，并有促进动物生长作用。
从动植物组织中提取GOD有一定的局限，酶量亦不丰富；细菌GOD产酶量少；一般采用具有GRAS资格的黑曲霉和青霉属菌株作为GOD生产菌。我国及美国均采用点青霉及产黄青霉生产GOD，日本常用尼崎青霉，俄罗斯用生机青霉，近年报道胶霉属Clioctadium、拟青霉属Paecilomyces和帚霉属Scopulariopsis也能生产GOD。但产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制性因素，国内外为此做了大量工作并取得了明显进展。目前国外生产的GOD厂家主要是德国的Boehringer和日本的TOYOBO。规模化生产高活性的GOD还有困难。发酵生产GOD的同时产生大量杂蛋白，分离提取复杂，成本高。
利用基因工程或发酵工程来研究GOD的过量表达。其酶学性质、分子改造最终为实现葡萄糖氧化酶的工业化生产奠定了一定的理论基础和策略导向。
发明内容
本发明提供了一种共表达UPR关键基因和下游靶基因增强分泌表达葡萄糖氧化酶的方法。
技术方案为：将毕赤酵母UPR关键基因Haclp连接到毕赤酵母表达载体pPICZα，下游靶基因Pdi1、Ero1、Lhs1、Kar2、Sil1（其中Pdi1、Kar2为毕赤酵母来源基因，Ero1、Lhs1、Sil1为酿酒酵母来源基因）连接到表达载体pPIC3.5K，并将下游靶基因表达质粒分别同Haclp表达质粒一起将转化入Pichia pastorisGS 115-pPIC9K-GOD。
所述Haclp、Pdi1、Kar2为毕赤GS115来源基因，所述Ero1、Lhs1、Sil1为Saccharomycescerevisiae S288c来源基因。
具体步骤如下：
1）设计引物以毕赤酵母和酿酒酵母反转录cDNA为模板扩增出Haclp、Pdi1、Ero1、Lhs1、Kar2、Sil1基因；
2）将Hac1p基因连接到毕赤酵母表达载体pPICZα，下游靶基因Pdi1、Ero1、Lhs1、Kar2、Sil1（其中Pdi1、Kar2为毕赤酵母来源基因，Ero1、Lhs1、Sil1为酿酒酵母来源基因）连接到表达载体pPIC3.5K，得到重组质粒pPICZ-Hac1，pPIC3.5K-Pdi1,pPIC3.5K-Ero1,pPIC3.5K-Lhs1,pPIC3.5K-Ka2,pPIC3.5K-Sil1；
3）将步骤2）中重组载体pPICZ-Hac1分别与pPIC3.5K-Pdi1、pPIC3.5K-Ero1、pPIC3.5K-Lhs1、pPIC3.5K-Kar2、pPIC3.5K-Sil1转化入Pichia pastoris GS115-pPIC9K-GOD得到五株分泌增强型基因工程菌。
所述引物如下：
Hac-F：5’-AGTTCGAAATGCCCGTAGATTCTTCTC-3’
Hac-R：5’-AAATATGCGGCCGCCTATTCCTGGAAGAATACAAAGTC-3’
Pdi-F：5’-CGGGATCCATGCAATTCAACTGGGATATTAAAACTGTG-3’
Pdi-R：5’-AAATATGCGGCCGCTTAAAGCTCGTCGTGAGCGTC-3’
Ero-F：5’-CGGGATCCATGAGATTAAGAACCGCCAT-3’
Ero-R：5’-AAATATGCGGCCGCTTATTGTATATCTAGCTTAT-3’
Lhs-F：5’-CGGGATCCATGCGAAACGTTTTAAGGCTTTT-3’
Lhs-R：5’-AAATATGCGGCCGCCTATAATTCATCATGCAAAATGTCT-3’
Kar-F：5’-CGGGATCCATGCTGTCGTTAAAACCATCTT-3’
Kar-R：5’-AAATATGCGGCCGCTATCTACAACTCATCATGAT-3’
Sil-F：5’-CGGGATCCATGGTCCGGATTCTTCCCAT-3’
Sil-R：5’-AAATATGCGGCCGCTCAGAGTTCATCTCTGAAATTT-3’
PCR反应体系：0.2mL PCR管中按顺序加入以下试剂：10×LAPCR buffer II（Mg2+plus）5μl;DNTP Mixture 8μl；模板DNA 1μl；上下游引物各2μl；Taq酶0.5μl；加双蒸水至终体积为50μl。
PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火90s，72℃延伸3min（30个循环）；72℃延伸10min。
用限制性内切酶BspT104 I和Not I双酶切消化纯化后的Haclp基因和载体pPICZα，用限制性内切酶SnaB I和Not I双酶切消化纯化后的Pdi1、Ero1、Lhs1、Kar2、Sil1基因和载体pPIC3.5K，并分别连接，得到重组载体pPICZ-Hac1，pPIC3.5K-Pdi1,pPIC3.5K-Ero1,pPIC3.5K-Lhs1,pPIC3.5K-Kar2,pPIC3.5K-Sil1，将pPIC3.5K-Pdi1,pPIC3.5K-Ero1,pPIC3.5K-Lhs1,pPIC3.5K-Kar2,pPIC3.5K-Sil1分别同pPICZ-Hac1一起转化Pichia pastorisGS115-pPIC9K-GOD，经筛选鉴定获得重组菌Pichia pastorisGS115-pPIC9K-GOD/pPICZ-Hac1/pPIC3.5K-Pdi1（pPIC3.5K-Ero1,pPIC3.5K-Lhs1,pPIC3.5K-Kar2,pPIC3.5K-Sil1）。
葡萄糖氧化酶酶活测定方法：GOD活性测定一般采用邻-联(二)茴香胺分光光度法。在有氧条件下，GOD催化葡萄糖脱氢产生H2O2，在过氧化物酶（POD）作用下，氧供体邻-联(二)茴香胺（DH2）被氧化成棕色产物。测540nm处吸光度的变化，根据标准曲线的结果，计算葡萄糖氧化酶活力单位。
本发明的有益效果：增强分泌型菌株在3L发酵罐上酶活585U/mL，这为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。
附图说明
图1：反转录cDNA进行分泌关键基因的RT-PCR定量图。
图2：各株分泌增强型菌株的葡萄糖氧化酶的酶活比较。
图3：分泌增强型菌株生理情况对比。
图4：分泌增强型菌株3L发酵罐上发酵产葡萄糖氧化酶情况。
具体实施方式
实施例1重组菌的构建及鉴定
1）设计引物以毕赤酵母和酿酒酵母反转录cDNA为模板扩增出Haclp、Pdi1、Ero1、Lhs1、Kar2、Sil1基因；
Hac-F：5’-A GTTCGAAATGCCCGTAGATTCTTCTC-3’
Hac-R：5’-AAATATGCGGCCGCCTATTCCTGGAAGAATACAAAGTC-3’
Pdi-F：5’-CGGGATCCATGCAATTCAACTGGGATATTAAAACTGTG-3’
Pdi-R：5’-AAATATGCGGCCGCTTAAAGCTCGTCGTGAGCGTC-3’
Ero-F：5’-CGGGATCCATGAGATTAAGAACCGCCAT-3’
Ero-R：5’-AAATATGCGGCCGCTTATTGTATATCTAGCTTAT-3’
Lhs-F：5’-CGGGATCCATGCGAAACGTTTTAAGGCTTTT-3’
Lhs-R：5’-AAATATGCGGCCGCCTATAATTCATCATGCAAAATGTCT-3’
Kar-F：5’-CGGGATCCATGCTGTCGTTAAAACCATCTT-3’
Kar-R：5’-AAATATGCGGCCGCTATCTACAACTCATCATGAT-3’
Sil-F：5’-CGGGATCCATGGTCCGGATTCTTCCCAT-3’
Sil-R：5’-AAATATGCGGCCGCTCAGAGTTCATCTCTGAAATTT-3’
0.2mL PCR管中按顺序加入以下试剂：10×LA PCR buffer II（Mg2+plus）5μl；DNTPMixture 8μl；模板DNA 1μl；上下游引物各2μl；Taq酶0.5μl；加双蒸水至终体积为50μl。按下列程序进行PCR扩增：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火90s，72℃延伸3min（30个循环）；72℃延伸10min。
2）以1%琼脂糖凝胶电泳验证并以0.8%琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，结果扩增得到Haclp、Pdi1、Ero1、Lhs1、Kar2、Sil1基因片段。
3)用限制性内切酶BspT104 I和Not I双酶切消化纯化后的Haclp基因和载体pPICZα，用限制性内切酶SnaB I和Not I双酶切消化纯化后的Pdi1、Ero1、Lhs1、Kar2、Sil1基因和载体pPIC3.5K，用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，连接产物用化学转化法转化宿主菌JM109，转化菌液涂布在含有卡那霉素（30mg/mL）的LB平板上，37℃过夜培养，以各不同基因PCR引物进行菌落PCR的方法鉴定阳性克隆子，最终获得含有Haclp、Pdi1、Ero1、Lhs1、Kar2、Sil1基因的重组表达质粒pPICZ-Hac1，pPIC3.5K-Pdi1,pPIC3.5K-Ero1,pPIC3.5K-Lhs1,pPIC3.5K-Ka2,pPIC3.5K-Sil1，用双酶切进行验证。
大肠杆菌化学转化为：取连接产物5μl加入到含有100μl JM109感受态细胞中，充分混匀后，冰浴30min；将装有混合物的Eppendorf管，42℃水浴热休克90s，然后将Eppendorf管立即转移到冰上冷却2min；向管中加入600μl LB液体培养基，置于37℃200rpm恒温摇床上培养1h，然后涂布于含有卡那霉素的平板上，37℃向上放置1h，倒置培养12-16h后观察菌落。
4）将重组质粒pPICZ-Hac1转化Pichia pastoris GS115-pPIC9K-GOD，经筛选鉴定获得重组菌Pichia pastoris GS115-pPIC9K-GOD/pPICZ-Hac1。
然后将pPIC3.5K-Pdi1,pPIC3.5K-Ero1,pPIC3.5K-Lhs1,pPIC3.5K-Kar2,pPIC3.5K-Sil1分别转入Pichia pastoris GS115-pPIC9K-GOD/pPICZ-Hac1，经筛选鉴定获得重组菌Pichiapastoris GS115-pPIC9K-GOD/pPICZ-Hac1/pPIC3.5K-Pdi1（pPIC3.5K-Ero1,pPIC3.5K-Lhs1,pPIC3.5K-Kar2,pPIC3.5K-Sil1）。
毕赤酵母GS115-pPIC9K-GOD（Pichiapastoris GS115-pPIC9K-GOD）已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2012266。
毕赤酵母的转化采用电转化法。菌株于500mL YPD中培养至OD600=1.2-1.5，1500g离心收集细胞;依次用400mL冰冷的无菌水洗两次细胞，再用40mL冰冷的1mol/L山梨醇洗一次细胞，重悬细胞于1mL 1mol/L山梨醇。100μL原生质体与5-10μg线性化质粒DNA(pPIC3.5K-Pdi1用Sac I切，pPIC3.5K-Pdi1,pPIC3.5K-Ero1,pPIC3.5K-Lhs1,pPIC3.5K-Kar2,pPIC3.5K-Sil1用Sal I)混合，转入冰冷的电转杯，放置5分钟;电击细胞与DNA的混合物(15kv，4.2-4.9ms);加入1mL冰冷的1mol/L山梨醇，继续放置30min;再加入0.5mL SOS，30°C放置2小时，偶尔摇动至菌体不易沉淀;pPICZ-Hac1转化子用1mol/L山梨醇稀释菌体后涂布于含有博莱霉素（200μg/mL）的固体MD培养基，pPIC3.5K-Pdi1,pPIC3.5K-Ero1,pPIC3.5K-Lhs1,pPIC3.5K-Kar2,pPIC3.5K-Sil1用1mol/L山梨醇稀释菌体后涂布于含有遗传霉素（2mg/mL）的固体MD培养基。30°C培养4-6天后挑取单克隆。
实施例2分泌增强型菌株的分泌关键基因RT-PCR测定和菌株生理活性影响。
培养基：种子和斜面培养基为YPD培养基（1L）：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g；斜面培养基添加琼脂20g；基本发酵培养基为BMGY培养基（1L）：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB 13.4g，100mM磷酸缓冲液（pH 6.0）；诱导培养基为BMMY培养基（1L）：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB 13.4g，100mM磷酸缓冲液（pH 6.0）；
培养方法：将30℃、200rpm下培养到OD600在1.6～1.7之间的种子以2%的接种量转入基本发酵培养基，于30℃、200rpm条件下培养；
诱导条件：在BMGY中培养至OD值为1.2-1.5时，将酵母细胞转入BMMY培养基中诱导蛋白的产生。
将分泌增强型重组菌在诱导一天后，取发酵液离心获得菌体，提取RNA，方法如下：
抽提RNA所用的研钵酒精灼烧5-10min.，其他器皿均用0.1%的DEPC水处理，24h。后高温高压灭菌两次，以去除RNA酶，所有试剂都保证没有RNA酶污染。
1)1.5ml离心管中加入1ml Trizol，取0.1g组织在液氮中研磨至粉末，加入到Trizol中，立即充分混匀。
2)将混匀的组织在15-30℃放10min，使核酸蛋白复合体物完全分离。
3)4℃，10000rpm离心20min，取上清。
4)加氯仿200μl，5M NaCl 200μl，剧烈振荡15s，室温放置3min。
5)4℃，10000rpm离心20min，样品会分成3层，取上层水相，取上清。
6)加500μl异丙醇，混匀，室温放置10min。
7)4℃，10000rpm离心15min，去上清，管底管侧形成胶状沉淀。
8)加1ml 75%乙醇，洗涤沉淀，重复两次，洗涤用4℃，7500rpm离心5min，弃上清。
9)吹干约15min。
10)加50μl DEPC处理的水，65℃溶解，-20℃（最好-80℃）保存。
将获得的RNA进行反转录，然后将反转录cDNA进行分泌关键基因的RT-PCR定量，数据如图1，转入Haclp基因的菌株较对照菌株（只转入了pPIC3.5K-Pdi1,pPIC3.5K-Ero1,pPIC3.5K-Lhs1,pPIC3.5K-Kar2,pPIC3.5K-Sil1的菌株），下游靶基因转录水平明显提高，摇瓶上酶活也有明显的增强，如图2，最高提高可达19.7%。
同时分泌增强型菌株因为过量表达分泌表达基因，生理生长情况也有明显改变，其中分泌增强型菌株的比生长速率和分泌蛋白量有明显提升，但最终细胞生长量却因为过量分泌蛋白而减少了，如图3。
实施例3分泌增强型菌株在3L发酵罐上的发酵
以Pichia pastoris GS 115-pPIC9K-GOD/pPICZ-Hac1/pPIC3.5K-Pdi1为出发菌株。
将培养好的YPD菌液以接种量为10%无菌操作接入3L全自动发酵罐(LiFlus GMBioTRON,Korea)中。初始条件为：装液量800-1000mL，初始搅拌转速为500r/min，通气量2.5vvm，以30%的磷酸溶液和25%的浓氨水控制pH为5.5，生长期的培养温度为30°C，采用搅拌关联的DO-stat控制，维持DO在30%，搅拌转速最高值设置为950r/min。
当甘油耗尽(DO迅速上升)时，DO>60%时，开始以不同指数流加方式添加50%的甘油培养基。待甘油再次耗尽，DO再次反弹，当DO>60%,开始诱导。将诱导温度降低至22°C，开始流加诱导培养基，使培养基甲醇浓度迅速达到1.8%(w/w)，通过FC2002型甲醇检测流加控制器控制甲醇残留浓度为1.8%(w/w)。分泌增强型在3L罐上的酶活达到585U/mL（图4）。
Figure IDA00002613257000011
Figure IDA00002613257000021

Claims (8)

1.一种共表达UPR关键基因和下游靶基因增强葡萄糖氧化酶分泌的方法，其特征在于，是将毕赤酵母UPR关键基因Haclp连接到毕赤酵母表达载体pPICZα上，将其下游靶基因连接到表达载体pPIC3.5K上，并将下游靶基因表达质粒与Haclp表达质粒一起转化入Pichia pastoris GS115-pPIC9K-GOD中得到的基因工程菌。 
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述下游靶基因为Pdi1或Kar2，来源于为毕赤酵母GS115。 
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述下游靶基因为Ero1、Lhs1或Sil1中任一一个，来源于Saccharomyces cerevisiae S288c。 
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Pichia pstorisGS115-pPIC9K-GOD，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2012266。 
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，构建基因工程菌的步骤如下： 
1）设计引物以毕赤酵母和酿酒酵母反转录cDNA为模板扩增出Haclp、Pdi1、Ero1、Lhs1、Kar2、Sil1基因； 
2）将Haclp基因连接到毕赤酵母表达载体pPICZα，下游靶基因Pdi1、Ero1、Lhs1、Kar2、Sil1连接到表达载体pPIC3.5K，得到重组质粒pPICZ-Hac1，pPIC3.5K-Pdi1，pPIC3.5K-Ero1,pPIC3.5K-Lhs1,pPIC3.5K-Kar2,pPIC3.5K-Sil1； 
3）将步骤2）中重组载体pPICZ-Hac1分别与pPIC3.5K-Pdi1、pPIC3.5K-Ero1、pPIC3.5K-Lhs1、pPIC3.5K-Kar2、pPIC3.5K-Sil1转化入Pichia pastoris GS115-pPIC9K-GOD得到五株分泌增强型基因工程菌。 
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述引物如下： 
Hac-F：5’-AGTTCGAAATGCCCGTAGATTCTTCTC-3’ 
Hac-R：5’-AAATATGCGGCCGCCTATTCCTGGAAGAATACAAAGTC-3’ 
Pdi-F：5’-CGGGATCCATGCAATTCAACTGGGATATTAAAACTGTG-3’ 
Pdi-R：5’-AAATATGCGGCCGCTTAAAGCTCGTCGTGAGCGTC-3’ 
Ero-F：5’-CGGGATCCATGAGATTAAGAACCGCCAT-3’ 
Ero-R：5’-AAATATGCGGCCGCTTATTGTATATCTAGCTTAT-3’ 
Lhs-F：5’-CGGGATCCATGCGAAACGTTTTAAGGCTTTT-3’ 
Lhs-R：5’-AAATATGCGGCCGCCTATAATTCATCATGCAAAATGTCT-3’ 
Kar-F：5’-CGGGATCCATGCTGTCGTTAAAACCATCTT-3’ 
Kar-R：5’-AAATATGCGGCCGCTATCTACAACTCATCATGAT-3’ 
Sil-F：5’-CGGGATCCATGGTCCGGATTCTTCCCAT-3’ 
Sil-R：5’-AAATATGCGGCCGCTCAGAGTTCATCTCTGAAATTT-3’。 
7.一种采用权利要求1方法构建的基因工程菌，其特征在于，是将毕赤酵母UPR关键基因Haclp连接到毕赤酵母表达载体pPICZα上，将其下游靶基因Pdi1连接到表达载体pPIC3.5K上，并将下游靶基因表达质粒与Haclp表达质粒一起转化入Pichia pastorisGS115-pPIC9K-GOD中得到的基因工程菌Pichia pastorisGS115-pPIC9K-GOD/pPICZ-Hac1/pPIC3.5K-Pdi1。 
8.一种权利要求7所述基因工程菌的应用方法，所述菌株Pichia pstorisGS115-pPIC9K-GOD/pPICZ-Hac1/pPIC3.5K-Pdi1的诱导条件为在BMGY中培养至OD值为1.2-1.5时，再将酵母细胞转入BMMY培养基中诱导，初始搅拌转速为500r/min，通气量2.5vvm，pH为5.5，生长期的培养温度为30°C，维持DO在30%。 
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