CN103088041A - 一种可用于高效生产角质酶的角质酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种可用于高效生产角质酶的角质酶基因及其应用，特别是一种人工的角质酶基因编码基因及其应用。将编码角质酶基因进行合成优化得到tfu，并在N端人为添加α-factor信号肽及kozark序列。本发明成功实现了人工的角质酶基因在酿酒酵母中的表达。另外，本发明结合重组菌株表达体系中启动子的优化，构建出具有产酶和性能都较好的工程菌，为后续角质酶的工业化生产奠定了一定的理论基础。

Description

一种可用于高效生产角质酶的角质酶基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种可用于高效生产角质酶的角质酶基因及其应用，特别是一种人工的角质酶基因编码基因。

背景技术

角质酶是一种可以降解角质并产生大量脂肪酸单体的水解酶，角质酶来源很广，存在于植物花粉和多种微生物中。根据来源，角质酶可分为真菌角质酶、细菌角质酶和花粉角质酶。与真菌角质酶相比，细菌角质酶具有催化效率高、环境适应能力强、基因工程异源表达技术成熟等方面的优势。本发明选用细菌角质酶作为表达的目的基因。

目前，国内重组发酵生产角质酶大多选用大肠杆菌为表达宿主，这不利于角质酶在食品和医药等行业中的应用。本发明为了进一步拓展角质酶的应用领域，更好地用于食品和医药行业中，研究选用食品级菌株酿酒酵母来表达细菌角质酶。相对大肠杆菌，酿酒酵母具有诸多优点：（1）在重组蛋白的生物生产中，以真核生物作为宿主菌，最显著的优势就是能够进行翻译后修饰，比如乙酰化、磷酸化、糖基化等，这些均是一些真核蛋白质具有生物活性的必需反应；（2）在发酵过程中不产生焦精、内毒素等，并且它具有更好的环境适应能力；（3）最重要的优势是，酿酒酵母更是契合了食用安全性，能够广泛地应用于食品医药以及保健品行业中。

国外学者大多研究的是利用重组酵母菌株生产真菌角质酶，这一方法主要存在以下几个制约因素：(1)角质酶基因表达载体中多采用半乳糖诱导型的启动子，但是作为诱导剂的半乳糖在发酵培养过程中也被当做碳源迅速消耗，因此半乳糖的消耗过快严重阻碍了重组菌生产角质酶的能力；（2）鉴于上述半乳糖的快速消耗，有学者提出在发酵罐上对半乳糖进行补料流加，以维持菌体的继续诱导产酶，但是半乳糖相比较于葡萄糖、甘油等价格较为昂贵，不适合于工业中大规模的发酵生产。

鉴于此，构建新型重组工程菌高效生产角质酶的方法更有利于角质酶今后的工业化生产，也更有利于角质酶在视频和医药行业的拓展应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可用于高效生产角质酶的角质酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其获得方法为将编码角质酶基因进行合成优化得到tfu，并在N端人为添加α-factor信号肽及kozak序列。

含有所述角质酶基因的基因工程菌及转基因细胞系为本专利的保护范围。

所述基因工程菌通过表达载体pYES2将外源角质酶基因转化酿酒酵母INVsc1所得。

含有权利要求1或2所述角质酶基因的表达载体或克隆载体也为本专利的保护范围，其中表达载体优选pYES2。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种利用所述基因工程菌表达生产角质酶的方法，将基因工程菌种子培养液按10%的接种量接种到发酵培养基中，温度为28°C、通气量为1.5vvm，转数400r/min，并在发酵第20h时进行恒速补料流加，维持葡萄糖终浓度在20g/L。

所述种子培养基组成为：葡萄糖20g，YNB1.7g，(NH₄)₂SO₄5g，pH5.6-6.0，自来水定容至1L。

所述发酵培养基组成为：葡萄糖20g，酵母粉20g，胰蛋白胨10g，KH₂PO₄3g，Na₂HPO₄·12H₂O15.6g，pH7.0，自来水定容至1L。

本发明提供了一种新的可用于高效表达生产角质酶的编码基因。此外，通过使用此基因成功实现了一种强组成型启动子表达载体在酿酒酵母中高效生产细菌角质酶，解决了采用诱导型启动子表达时的不足：(1)采用诱导型启动子表达时，作为诱导剂的半乳糖在发酵培养过程中也被当做碳源迅速消耗，因此半乳糖的消耗过快严重阻碍了重组菌生产角质酶的能力；（2）鉴于上述半乳糖的快速消耗，有学者提出在发酵罐上对半乳糖进行补料流加，以维持菌体的继续诱导产酶，但是半乳糖相比较于葡萄糖、甘油等价格较为昂贵，不适合于工业中大规模的发酵生产。本发明通过对重组菌株表达体系中启动子的优化，为后续角质酶的工业化生产奠定了一定的理论基础。

附图说明

图1启动子GAL1重构菌产角质酶分析图。

葡萄糖(●)和半乳糖（★)消耗情况，酶活分析(■)，菌体干重(▲)；

具体实施方式

材料与方法

YNB培养基：葡萄糖20g，YNB（不加氨基酸）1.7g，(NH₄)₂SO₄5g，pH5.6-6.0，固体培养基添加20g琼脂。

角质酶酶活测定：发酵液10000×g离心5min，取上清液，测其酶活。采用分光光度法进行酶活测定。反应体积为1mL，其中含20μL酶液和980μL含50mmol/L对硝基苯丁酸酯(pNPB)和50mmol/L硫磺脱氧胆酸钠(TDOC)的20mM Tris-HCl缓冲液，pH值8.0，在405nm处，记录对硝基酚的生成速率。在20°C，每分钟催化对硝基苯丁酸酯水解生成1μmol对硝基酚的酶量即为一个酶活力单位。

葡萄糖含量的测定：以高效液相色谱(HPLC)测定葡萄糖含量，色谱柱：Aminex HPX-87H(Bio-Rad)；流动相：0.005mol/L H₂SO₄；流速：0.6mL/min；柱温：35°C；进样量：5μL；检测器为示差折光检测器；样品制备：1mL发酵液在10000rpm下离心10min，取上清液500μL移入5mL容量瓶中，超纯水定容至刻度线，经0.22μm滤膜过滤，滤液供液相色谱分析。

对比例1以诱导型GAL1为启动子的重组酵母菌产角质酶

将重构质粒pY-GAL1-tfu[胡亚冬姚冬生.一种酿酒酵母附加型分泌表达载体pYES2/CT/α-factor的构建及鉴定[J].中国生物工程杂志,2009,29(12):49-53]转化到酿酒酵母中并进行诱导发酵，28°C、200r/min。如图1所示，在40h半乳糖浓度低于5g/L，与此同时，角质酶和干重都趋于稳定，几乎不再升高，说明半乳糖作为诱导剂的同时被当做C源被快速消耗，这种模式严重制约了重组菌继续产角质酶酶活，此时酶活最高为7.56U/mL。

实施例1新型角质酶编码基因

一种可用于高效生产角质酶的角质酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其获得方法为将编码角质酶基因进行合成优化得到tfu，并在N端人为添加α-factor信号肽及kozak序列，将其克隆到pYES2。

实施例2重组酵母菌的构建及鉴定

以酿酒酵母BY4741为基因模板，根据表一中的引物P1-P8获得四种强组成型的启动子：ADH1、HXT1、TEF1、TDH3，连接到质粒pYES2，以诱导型启动子GAL1为对照，构建了四种重构表达载体：pY-ADH1-tfu,pY-HXT1-tfu,pY-TEF1-tfu，pY-TDH3-tfu。将上述四种重组质粒经醋酸锂化学法转化S.cerevisiae INVsc1感受态细胞，将能在尿嘧啶缺陷性的YNB平板上生长的菌落，在平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子。挑取阳性重组子若干，利用引物tfu-F和tfu-R进行PCR验证，得到大约1095bp的片段，表明四种重构质粒已成功转入S.cerevisiae INVsc1。

表一

*划线部分为限制性内切酶

实施例3组成型启动子重构酵母菌产角质酶的分析比较

将重构菌株接种到种子培养基中，500mL摇瓶装液50mL，温度为30°C，转速200r/min，培养时间为24-31h。按10%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基（初糖浓度为20g/L），28°C、200rpm条件下培养，重组菌和对照菌相比：TEF1p,TDH3p干重和酶活均有提高；发酵90h，TEF1p具有较优的干重和酶活表达，分别为11.88U/mL、17.85g·DCW/L。ADH1无效果、HXT1酶活反而降低。

实施例4在发酵罐水平考察溶氧浓度对重组酵母菌菌产角质酶的影响

将实施例3得到的最佳的启动子TEF1重构酵母菌株作为进一步研究的对象，接种到种子培养基中，温度为30°C，转速200rpm，培养时间为24-31h。

3-L发酵罐：按10%的接种量将培养好的种子接入到3-L发酵罐中，3-L发酵罐的装液量为1.5-1.8L，28°C、1.5vvm，改变转速控制溶氧浓度，转速分别设定为300r/min、400r/min、500r/min，考察了不同搅拌速度下菌体的生长、角质酶的表达以及糖耗情况，发现当转速为400r/min时，菌体干重和酶活最优（20.56U/mL、22.7g·DCW/L），此转速下在菌体生长期能将溶氧维持在30%以上。

综上所述：溶氧浓度在TEF1重组菌发酵生产角质酶的过程中起着很重要的作用。

实施例5采用3-L发酵罐恒速流加策略进一步优化重组菌产角质酶

根据实施例4的糖耗情况，为了进一步优化重组菌的产酶效果，采用了恒速补料流加策略，在葡萄糖消耗低于10g/L时，以一定的速度进行补料流加，使葡萄糖的浓度维持在20g/L，当发酵培养基中的葡萄糖出现累加时停止流加。补料物为：葡萄糖和酵母粉，分别向发酵培养基中提供C、N源。实施例4中TEF1重组菌相比，干重和酶活分别是其的2.45、3.51倍，分别为29.7U/mL、43.7g·DCW/L。

Claims (9)

1.一种可用于高效生产角质酶的角质酶基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.权利要求1所述角质酶基因的获得方法，其特征在于将编码角质酶基因进行合成优化得到tfu，并在N端人为添加α-factor信号肽及kozak序列。

3.含有权利要求1或2所述角质酶基因的基因工程菌及转基因细胞系。

4.权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为将权利要求1所述的角质酶基因通过表达载体pYES2转化酿酒酵母INVsc1所得。

5.含有权利要求1或2所述角质酶基因的表达载体或克隆载体。

6.权利要求1所述的表达载体，其特征在于优选表达载体pYES2。

7.一种利用权利要求3所述基因工程菌表达生产角质酶的方法，其特征在于将基因工程菌种子培养液按10%的接种量接种到发酵培养基中，温度为28°C、通气量为1.5vvm，转数400r/min，并在发酵第20h时进行恒速补料流加，维持葡萄糖终浓度在20g/L。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述种子培养基组成为：葡萄糖20g，YNB1.7g，(NH₄)₂SO₄5g，pH5.6-6.0，自来水定容至1L。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基组成为：葡萄糖20g，酵母粉20g，胰蛋白胨10g，KH₂PO₄3g，Na₂HPO₄·12H₂O15.6g，pH7.0，自来水定容至1L。

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