CN114410728A - 一种利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法 - Google Patents

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方浩
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Abstract

本发明提出了一种利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，涉及微生物技术领域。该方法包括如下步骤，将多种人工微生物混合后得到混合菌群，将混合菌群与原材料混合后发酵，即完成加工，其能够解决现目前整合生物加工产量、产率和得率低的技术问题。

Description

一种利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法。
背景技术
CBP是一种高度整合的生物炼制工艺，拥有最少的单元操作数，即一步法。研究中发现CBP蒸汽爆破玉米秸秆(steam exploded corn store，SECS)有较高的得率，优于SSF，虽然在产量上不如SHF，但得率较为接近，因此CBP拥有较大的潜力。微生物发酵法产葡糖二酸，目前的主流是重组大肠杆菌(Escherichia coli)和重组酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)发酵葡萄糖和肌醇生产，前者的最大产量为接近5g/L，由麻省理工学院的Prather教授课题组报道，酿酒酵母的最大产量为6g/L，由江南大学的Deng教授课题组报道，将酿酒酵母的产量提高到了11.21g/L。但这些高产的成果都是建立在高投入的基础上，这些工艺都需要添加10.8g/L肌醇(myo-inositol)，肌醇本身就是高附加值产品，CBP秸秆产葡糖二酸虽然产量低，15g/L SECS产0.45g/L葡糖二酸，但底物是农业废弃物，价格低廉，环保而又可再生，因此具有良好的应用前景。但现有的CBP秸秆产葡糖二酸的加工方法，其葡糖二酸的产量、产率和得率都较低，难以进行商业化应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，其能够解决现目前整合生物加工产量、产率和得率低的技术问题。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本申请提供了一种利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，包括如下步骤，将多种人工微生物混合后得到混合菌群，将混合菌群与原材料混合后发酵，即完成加工，人工微生物包括里氏木霉菌和酵母菌。该方法可以极大地促进人工微生物菌群CBP的效率。而且该法不仅可以用于提高人工微生物菌群一步法产葡糖二酸的效率，还具有普遍性(generalizability)，可用于其它由里氏木霉与酿酒酵母组成的微生物菌群的CBP效率，比如白酒糟产单细胞蛋白(single cell protein，SCP)。采用分工协作推拉策略以后SCP产量明显提高，证明了分工协作推拉策略是一种有效的、普遍适用的(generalizable)提高人工微生物菌群整合生物加工效率的方法，例如通过工程改造里氏木霉使其能够更高效地降解木质纤维素产更多的可发酵糖供给酿酒酵母，整个过程可形象地描述为推；酿酒酵母可摄入更多的可发酵糖，产更多葡糖二酸，这个过程可描述为拉。因此，我们称之为分工协作推拉。
相对于现有技术，本发明至少具有如下优点或有益效果：
本发明提供了一种利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，该方法可以极大地促进人工微生物菌群CBP的效率。而且该法不仅可以用于提高人工微生物菌群一步法产葡糖二酸的效率，还具有普遍性，可用于其它由里氏木霉与酿酒酵母组成的微生物菌群的CBP效率，比如白酒糟产单细胞蛋白。采用分工协作推拉策略以后SCP产量明显提高，证明了分工协作推拉策略是一种有效的、普遍适用的提高人工微生物菌群整合生物加工效率的方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明中酿酒酵母的质粒构建示意图，pY26-CDT1-βG(A)、pY26-CDT2-βG(B)和pY26-CDT1-CDT2-βG(C)质粒构建图；
图2为本发明效果例1中的葡糖二酸的产量、产率和得率的对照结果示意图，(A)分工协作推拉策略促进合成微生物菌群一步法产葡糖二酸的机理图；CBP 30g/L蒸汽爆破玉米秸秆历程中的滤纸酶活(B)和葡糖二酸(C)；CBP 50g/L蒸汽爆破玉米秸秆历程中的滤纸酶活(D)和葡糖二酸(E)；CBP 80g/L蒸汽爆破玉米秸秆历程中的滤纸酶活(F)和葡糖二酸(G)；
图3为本发明效果例2中的SCP产量、产率和得率的对照结果示意图，(A)以33.3g/L白酒糟为底物CBP产SCP的历程；(B)以50g/L白酒糟为底物CBP产SCP的历程；(C)以80g/L白酒糟为底物CBP产SCP的历程；(D)以100g/L白酒糟为底物CBP产SCP的历程；
图4为本发明提供的该利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法的流程示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
本申请提供了一种利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，包括如下步骤，将多种人工微生物混合后得到混合菌群，将混合菌群与原材料混合后发酵，即完成加工，人工微生物包括里氏木霉菌和酵母菌。该方法可以极大地促进人工微生物菌群CBP的效率。而且该法不仅可以用于提高人工微生物菌群一步法产葡糖二酸的效率，还具有普遍性，可用于其它由里氏木霉与酿酒酵母组成的微生物菌群的CBP效率，比如白酒糟产单细胞蛋白。采用分工协作推拉策略以后SCP产量明显提高，证明了分工协作推拉策略是一种有效的、普遍适用的提高人工微生物菌群整合生物加工效率的方法。
上述原材料包括农业废料和工业废料。通过将废料作为主要原材料使用以节约能源，实现废物利用。
上述人工微生物包括里氏木霉C10和酿酒酵母PC3。其中里氏木霉C10的构建为将里氏木霉cbh2基因置于cbh1基因的启动子和终止子之间，构建强表达盒Pcbh1-cbh2-Tcbh1，通过根瘤农杆菌转化法导入里氏木霉，筛选里氏木霉转化子，得纤维素酶高产菌株C10；酿酒酵母PC3的构建包括如下步骤：工程改造酿酒酵母使其具有代谢纤维糊精能力的方法参考文献，质粒pRS426-PGK-CDT2-CYC1、pRS426-PGK-CDT2-CYC1、pRS425-PGK-gh1-1-cyc1的构建方法参考文献。分别在质粒pRS426-PGK-CDT2-CYC1、pRS426-PGK-CDT2-CYC1、pRS425-PGK-gh1-1-cyc1上扩增cdt-1、cdt-2和gh1-1基因。由于三者的启动子与终止子一样，后续为防止引物的错配，本文将gh1-1基因反向表达。同样利用利用重叠延伸PCR技术构建片段CDT1-Kan-gh1-1、CDT2-Kan-gh1-1和CDT1-cdt2-Kan-gh1-1。cdt1-cdt2-Kan-gh1-1中CDT1和CDT2的连接借助于AatII酶切位点实现。三个片段两端均带有NTS同源臂，利用擎科的Sosoo无缝克隆试剂盒将三个目的片段与PCR线性化的pY26质粒进行连接，构建质粒pY26-CDT1-βG、pY26-CDT2-βG和pY26-CDT1-CDT2-βG，如图1所示。对于纤维糊精转途径整合基因片段的构建：分别在质粒pRS426-PGK-CDT1-CYC1、pRS426-PGK-CDT2-CYC1、pRS425-PGK-gh1-1-cyc1上扩增cdt-1、cdt-2和gh1-1基因，筛选标记Kan基因的前830bp和后858bp用相应引物进行扩增，之后利用重叠延伸PCR技术将CDT1与Kan1相连，Kan2与gh1-1相连，二轮连接构建CDT1-Kan-gh1-1片段，同理可得CDT2-Kan-gh1-1，CDT1-CDT2-Kan-gh1-1。需要注意的是片段CDT1-CDT2-Kan-gh1-1中CDT1和CDT2的连接借助于AatII酶切位点实现，或直接从质粒pY26-CDT1-βG、pY26-CDT2-βG和pY26-CDT1-CDT2-βG上扩增目的片段用于后续酿酒酵母的转化。
生工生物工程股份有限公司合成Anti-ZWT-anti-ZHER2-anti-ZIgA scaffoldwith(SSSSG)4linkers、ZWT、ZHER2、ZIgA后，分别连接在通用载体PUC19上。从相应模板上将支架蛋白、4种关键酶基因miox4、udh、INO1、INM；启动子TEF、GPD、GPM1、ENO2；终止子ADH、CYC1、RPL3、DIT1；筛选标记kan1和kan2一起利用相应引物对进行扩增(见表2-10)。目的片段准备结束后，利用重叠延伸PCR技术构建A1片段(pGPD-ZIgA-linker③-INO1-tCYC1—pTEF-ZHER2-linker②-INM1-tADH1-Kan1)，A2片段(pGPD-ZIgA-linker③-INO1-linker⑤-ZIgA-tCYC1—pTEF-ZHER2-linker②-INM1-linker①-ZHER2-tADH1-Kan1)及B片段(Kan2-pGPM1-ZWt-linker④--miox4-linker①-udh-tRPL3-pENO2-Scaffold-tDIT1)片段，将上述构建好的A1，A2片段利用擎科无缝克隆试剂盒与用引物pY26-1F/R线性化的pY26质粒连接，B片段与用引物pY26-2F/R线性化的pY26质粒连接，最终获得pY26-A1质粒、pY26-A2质粒及pY26-B质粒。
对于支架蛋白整合基因片段的构建：首先从相应模板上将4种关键酶基因miox4，udh，INO1，INM；3种affibody及scaffold；启动子TEF，GPD，GPM1，ENO2；终止子ADH，CYC1，RPL3，DIT1；筛选标记Kan基因的前830bp和后858bp用相应引物进行扩增，利用重叠延伸PCR技术构建A1，A2，B片段，或者直接从pY26-A1质粒、pY26-A2质粒及pY26-B质粒上扩增相应片段用于后续酿酒酵母的转化。片段详细信息如下所示：片段A1(5920bp)：delta1-pGPD-ZIgA-linker③-INO1-tCYC1-pTEF-ZHER2-linker②-INM1-tADH1-Kan(前830bp)片段A2(6400bp)：delta1-pGPD-ZIgA-linker③-INO1-linker⑤-ZIgA-tCYC1-pTEF-ZHER2-linker②-INM1-linker①-ZHER2-tADH1-Kan(前830bp)片段B(5862bp):Kan(后858bp)-pGPM1-ZWt-linker④--MIOX4-linker①-UDH-tRPL3-ENO2p-scaffolds-DIT1t得到片段CDT1-Kan-gh1-1、CDT2-Kan-gh1-1和CDT1-CDT2-Kan-gh1-1后，同以kan作为筛选标记(后续利用Cre-LoxP系统实现敲除)，用醋酸锂高效转化法转化至酿酒酵母PC3，涂布G418抗性平板，得到酿酒酵母重组菌株，经发酵验证选择里面SCP产量最高的菌株，命名为PC3。
上述里氏木霉C10和酿酒酵母PC3的接种比为(2.5-3.5):1。该接种比例能够保证所得到的SCP产量较高，且保证较高的发酵速率，从而提高整合生物加工的速率和得率。
上述原材料包括酒糟，里氏木霉C10和酿酒酵母PC3的混合菌群与酒糟的接种率为2-6％。接种率为混合菌群的菌液的质量与酒糟的质量比。该接种率区间能够保证混合菌群可以充分利用底物原料，从而保证所制得的SCP的产量充足的同时又不会造成原料的浪费和对本身菌群的干扰。
上述人工微生物包括里氏木霉C10和酿酒酵母LGA-1C3S2。其中酿酒酵母LGA-1C3S2的构建包括如下步骤：由LGA-1出发。工程改造酿酒酵母使其具有代谢纤维糊精能力的方法参考文献，质粒pRS426-PGK-CDT2-CYC1、pRS426-PGK-CDT2-CYC1、pRS425-PGK-gh1-1-cyc1的构建方法参考文献。分别在质粒pRS426-PGK-CDT2-CYC1、pRS426-PGK-CDT2-CYC1、pRS425-PGK-gh1-1-cyc1上扩增cdt-1、cdt-2和gh1-1基因。由于三者的启动子与终止子一样，后续为防止引物的错配，本文将gh1-1基因反向表达。同样利用利用重叠延伸PCR技术构建片段CDT1-Kan-gh1-1、CDT2-Kan-gh1-1和CDT1-cdt2-Kan-gh1-1。cdt1-cdt2-Kan-gh1-1中CDT1和CDT2的连接借助于AatII酶切位点实现。三个片段两端均带有NTS同源臂，利用擎科的Sosoo无缝克隆试剂盒将三个目的片段与PCR线性化的pY26质粒进行连接，构建质粒pY26-CDT1-βG、pY26-CDT2-βG和pY26-CDT1-CDT2-βG，如图1所示。对于纤维糊精转途径整合基因片段的构建：分别在质粒pRS426-PGK-CDT1-CYC1、pRS426-PGK-CDT2-CYC1、pRS425-PGK-gh1-1-cyc1上扩增cdt-1、cdt-2和gh1-1基因，筛选标记Kan基因的前830bp和后858bp用相应引物进行扩增，之后利用重叠延伸PCR技术将CDT1与Kan1相连，Kan2与gh1-1相连，二轮连接构建CDT1-Kan-gh1-1片段，同理可得CDT2-Kan-gh1-1，CDT1-CDT2-Kan-gh1-1。需要注意的是片段CDT1-CDT2-Kan-gh1-1中CDT1和CDT2的连接借助于AatII酶切位点实现，或直接从质粒pY26-CDT1-βG、pY26-CDT2-βG和pY26-CDT1-CDT2-βG上扩增目的片段用于后续酿酒酵母的转化。
生工生物工程股份有限公司合成Anti-ZWT-anti-ZHER2-anti-ZIgA scaffoldwith(SSSSG)4linkers、ZWT、ZHER2、ZIgA后，分别连接在通用载体PUC19上。从相应模板上将支架蛋白、4种关键酶基因miox4、udh、INO1、INM；启动子TEF、GPD、GPM1、ENO2；终止子ADH、CYC1、RPL3、DIT1；筛选标记kan1和kan2一起利用相应引物对进行扩增(见表2-10)。目的片段准备结束后，利用重叠延伸PCR技术构建A1片段(pGPD-ZIgA-linker③-INO1-tCYC1—pTEF-ZHER2-linker②-INM1-tADH1-Kan1)，A2片段(pGPD-ZIgA-linker③-INO1-linker⑤-ZIgA-tCYC1—pTEF-ZHER2-linker②-INM1-linker①-ZHER2-tADH1-Kan1)及B片段(Kan2-pGPM1-ZWt-linker④--miox4-linker①-udh-tRPL3-pENO2-Scaffold-tDIT1)片段，将上述构建好的A1，A2片段利用擎科无缝克隆试剂盒与用引物pY26-1F/R线性化的pY26质粒连接，B片段与用引物pY26-2F/R线性化的pY26质粒连接，最终获得pY26-A1质粒、pY26-A2质粒及pY26-B质粒。
对于支架蛋白整合基因片段的构建：首先从相应模板上将4种关键酶基因miox4，udh，INO1，INM；3种affibody及scaffold；启动子TEF，GPD，GPM1，ENO2；终止子ADH，CYC1，RPL3，DIT1；筛选标记Kan基因的前830bp和后858bp用相应引物进行扩增，利用重叠延伸PCR技术构建A1，A2，B片段，或者直接从pY26-A1质粒、pY26-A2质粒及pY26-B质粒上扩增相应片段用于后续酿酒酵母的转化。片段详细信息如下所示：片段A1(5920bp)：delta1-pGPD-ZIgA-linker③-INO1-tCYC1-pTEF-ZHER2-linker②-INM1-tADH1-Kan(前830bp)片段A2(6400bp)：delta1-pGPD-ZIgA-linker③-INO1-linker⑤-ZIgA-tCYC1-pTEF-ZHER2-linker②-INM1-linker①-ZHER2-tADH1-Kan(前830bp)片段B(5862bp):Kan(后858bp)-pGPM1-ZWt-linker④--MIOX4-linker①-UDH-tRPL3-ENO2p-scaffolds-DIT1t得到片段CDT1-Kan-gh1-1、CDT2-Kan-gh1-1和CDT1-CDT2-Kan-gh1-1后，同以kan作为筛选标记(后续利用Cre-LoxP系统实现敲除)，用醋酸锂高效转化法转化至酿酒酵母LGA-1菌株，涂布G418抗性平板，得到酿酒酵母重组菌株，经发酵验证选择里面葡糖二酸产量最高的菌株，命名为LGA-1C3。
得到目的基因片段A1与B片段，A2与B片段后，以kan作为筛选标记(后续利用Cre-LoxP系统实现敲除)，用醋酸锂高效转化法转化至酿酒酵母LGA-1C3菌株中，涂布G418抗性平板。获得基础表达(A1+B)重组菌株和网状表达(A2+B)重组菌株，经发酵验证选择里面葡糖二酸产量最高的菌株，命名为LGA-1C3S2。
本发明中所使用的改造来源菌株为里氏木霉Rut-C30和酿酒酵母INVSc1，二者均购自ACCT。
上述里氏木霉C10和酿酒酵母LGA-1C3S2的接种比为1:1。该接种的比例能够保证里氏木霉C10和酿酒酵母LGA-1C3S2能够充分发挥推拉功效，从而提高产物的得率。
上述原材料包括秸秆，里氏木霉C10和酿酒酵母LGA-1C3S2混合菌群与秸秆的接种率为8-12％。接种率为混合菌群的菌液的质量与秸秆的质量比。该接种率区间能够保证混合菌群能够充分利用秸秆等材料，从而保证产足够的葡糖二酸，当接种率过高或过低会导致混合菌群或原料的浪费。
上述发酵的温度为28-32℃。该温度区间能保证上述混合菌群处于高活性状态，从而提高整合生物加工的效率。
上述发酵的时间至少为7天。七天后才能保证大部分的原料已反应完，从而保证产物的含量最高。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，包括如下步骤：将里氏木霉C10在里氏木霉种子培养基中培养36h，酿酒酵母LGA-1C3S2在YPD培养基中培养到OD600值5，将里氏木霉C10与酿酒酵母LGA-1C3S2以接种比1:1混合，得到混合菌群，将混合菌群按总接种量8％(v/v)同时接入CBP产葡糖二酸培养基中，于28℃、180rpm发酵，即完成加工。
其中里氏木霉培养基包括：葡萄糖10g/L，蛋白胨1g/L，Mandels营养盐浓液5mL/瓶，Mandels微量元素浓液0.05mL/瓶，1mol/L柠檬酸缓冲液2.5mL/瓶，Tween-80 2滴/瓶，以上溶液定容至50mL，倒入250mL的三角瓶，塞上棉花塞，盖上牛皮纸，用皮筋扎紧，于121℃，灭菌30min。
其中CBP产葡糖二酸培养基包括：50g/L蒸汽爆破玉米秸秆，1g/L蛋白胨，1g/L酵母浸膏，6g/L(NH4)2SO4，2.0g/L KH2PO4，0.3g/L MgSO4，0.3g/L CaCl2，0.005g/L FeSO4，0.0016g/L MnSO4，0.0014g/L ZnSO4，0.0037g/L CoCl2，柠檬酸缓冲液0.05mol/L(终浓度)，0.1g/L吐温80。灭菌条件：121℃、30min。
实施例2
本实施例提供了一种利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，包括如下步骤：将里氏木霉C10在里氏木霉种子培养基中培养36h，酿酒酵母LGA-1C3S2在YPD培养基中培养到OD600值5，将里氏木霉C10与酿酒酵母LGA-1C3S2以接种比1:1混合，得到混合菌群，将混合菌群按总接种量12％(v/v)同时接入CBP产葡糖二酸培养基中，于32℃发酵，即完成加工。
其中里氏木霉培养基包括：葡萄糖10g/L，蛋白胨1g/L，Mandels营养盐浓液5mL/瓶，Mandels微量元素浓液0.05mL/瓶，1mol/L柠檬酸缓冲液2.5mL/瓶，Tween-80 2滴/瓶，以上溶液定容至50mL，倒入250mL的三角瓶，塞上棉花塞，盖上牛皮纸，用皮筋扎紧，于121℃，灭菌30min。
其中CBP产葡糖二酸培养基包括：50g/L蒸汽爆破玉米秸秆，1g/L蛋白胨，1g/L酵母浸膏，6g/L(NH4)2SO4，2.0g/L KH2PO4，0.3g/L MgSO4，0.3g/L CaCl2，0.005g/L FeSO4，0.0016g/L MnSO4，0.0014g/L ZnSO4，0.0037g/L CoCl2，柠檬酸缓冲液0.05mol/L(终浓度)，0.1g/L吐温80。灭菌条件：121℃、30min。
实施例3
本实施例提供了一种利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，包括如下步骤：将里氏木霉C10在里氏木霉种子培养基中培养36h，酿酒酵母LGA-1C3S2在YPD培养基中培养到OD600值5，将里氏木霉C10与酿酒酵母LGA-1C3S2以接种比1:1混合，得到混合菌群，将混合菌群按总接种量10％(v/v)同时接入CBP产葡糖二酸培养基中，于30℃、180rpm发酵，即完成加工。
其中里氏木霉培养基包括：葡萄糖10g/L，蛋白胨1g/L，Mandels营养盐浓液5mL/瓶，Mandels微量元素浓液0.05mL/瓶，1mol/L柠檬酸缓冲液2.5mL/瓶，Tween-80 2滴/瓶，以上溶液定容至50mL，倒入250mL的三角瓶，塞上棉花塞，盖上牛皮纸，用皮筋扎紧，于121℃，灭菌30min。
其中CBP产葡糖二酸培养基包括：50g/L蒸汽爆破玉米秸秆，1g/L蛋白胨，1g/L酵母浸膏，6g/L(NH4)2SO4，2.0g/L KH2PO4，0.3g/L MgSO4，0.3g/L CaCl2，0.005g/L FeSO4，0.0016g/L MnSO4，0.0014g/L ZnSO4，0.0037g/L CoCl2，柠檬酸缓冲液0.05mol/L(终浓度)，0.1g/L吐温80。灭菌条件：121℃、30min。
实施例4
本实施例提供了一种利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，包括如下步骤：将里氏木霉C10在里氏木霉种子培养基中培养36h，酿酒酵母PC3在YPD培养基中培养到OD600值5，将里氏木霉C10与酿酒酵母PC3以接种比2.5:1混合，得到混合菌群，将混合菌群按总接种量2％(v/v)同时接入CBP产SCP培养基中，于28℃、180rpm发酵，即完成加工。
其中里氏木霉培养基包括：葡萄糖10g/L，蛋白胨1g/L，Mandels营养盐浓液5mL/瓶，Mandels微量元素浓液0.05mL/瓶，1mol/L柠檬酸缓冲液2.5mL/瓶，Tween-80 2滴/瓶，以上溶液定容至50mL，倒入250mL的三角瓶，塞上棉花塞，盖上牛皮纸，用皮筋扎紧，于121℃，灭菌30min。
其中CBP产SCP培养基组成如下：50g/L白酒糟，1g/L葡萄糖，5g/L(NH4)2SO4，5g/LNH4NO3，4g/L KH2PO4，0.6g/L MgSO4，0.6g/L CaCl2，0.17mL/L Mandels微量元素营养盐(Mandels等，1981)，柠檬酸缓冲液0.05mol/L(终浓度)，灭菌条件：121℃、30min。
实施例5
本实施例提供了一种利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，包括如下步骤：将里氏木霉C10在里氏木霉种子培养基中培养36h，酿酒酵母PC3在YPD培养基中培养到OD600值5，将里氏木霉C10与酿酒酵母PC3以接种比3.5:1混合，得到混合菌群，将混合菌群按总接种量2％(v/v)同时接入CBP产SCP培养基中，于32℃、180rpm发酵，即完成加工。
其中里氏木霉培养基包括：葡萄糖10g/L，蛋白胨1g/L，Mandels营养盐浓液5mL/瓶，Mandels微量元素浓液0.05mL/瓶，1mol/L柠檬酸缓冲液2.5mL/瓶，Tween-80 2滴/瓶，以上溶液定容至50mL，倒入250mL的三角瓶，塞上棉花塞，盖上牛皮纸，用皮筋扎紧，于121℃，灭菌30min。
其中CBP产SCP培养基组成如下：50g/L白酒糟，1g/L葡萄糖，5g/L(NH4)2SO4，5g/LNH4NO3，4g/L KH2PO4，0.6g/L MgSO4，0.6g/L CaCl2，0.17mL/L Mandels微量元素营养盐(Mandels等，1981)，柠檬酸缓冲液0.05mol/L(终浓度)，灭菌条件：121℃、30min。
实施例6
本实施例提供了一种利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，包括如下步骤：将里氏木霉C10在里氏木霉种子培养基中培养36h，酿酒酵母PC3在YPD培养基中培养到OD600值5，将里氏木霉C10与酿酒酵母PC3以接种比3:1混合，得到混合菌群，将混合菌群按总接种量2％(v/v)同时接入CBP产SCP培养基中，于30℃发酵，即完成加工。
其中里氏木霉培养基包括：葡萄糖10g/L，蛋白胨1g/L，Mandels营养盐浓液5mL/瓶，Mandels微量元素浓液0.05mL/瓶，1mol/L柠檬酸缓冲液2.5mL/瓶，Tween-80 2滴/瓶，以上溶液定容至50mL，倒入250mL的三角瓶，塞上棉花塞，盖上牛皮纸，用皮筋扎紧，于121℃，灭菌30min。
其中CBP产SCP培养基组成如下：50g/L白酒糟，1g/L葡萄糖，5g/L(NH4)2SO4，5g/LNH4NO3，4g/L KH2PO4，0.6g/L MgSO4，0.6g/L CaCl2，0.17mL/L Mandels微量元素营养盐(Mandels等，1981)，柠檬酸缓冲液0.05mol/L(终浓度)，灭菌条件：121℃、30min。
效果例1
使用里氏木霉C10+酿酒酵母LGA-1C3和里氏木霉Rut-C30+酿酒酵母LGA-1(里氏木霉Rut-C30购自ACCT)在相同条件下进行发酵，作为对比例1和对比例2，并检测实施例1-3、对比例1-2所得到的葡糖二酸的产量、产率和得率，其中实施例3的、对比例1和对比例2的检测结果如图2所示，根据图2结果所示里氏木霉Rut-C30+酿酒酵母LGA-1和实施例3中的葡糖二酸的产量、产率和得率均明显较里氏木霉Rut-C30+酿酒酵母LGA-1更高，且实施例3的葡糖二酸的产量、产率和得率较里氏木霉Rut-C30+酿酒酵母LGA-1更高，因此，本发明提供的该方法能够有效提高整合生物加工效率。
效果例2
使用里氏木霉Rut-C30+酿酒酵母INVSc1(里氏木霉Rut-C30和酿酒酵母INVSc1均购自ACCT)在相同条件下进行发酵，作为对比例3，并检测实施例4-6和对比例3所得到的SCP的产量、产率和得率，其中实施例6和对比例3中SCP的产量、产率和得率的检测结果如图3所示，根据图3结果所示，实施例6中SCP的产量、产率和得率均高于对比例3，因此，本发明提供的该方法能够有效提高整合生物加工效率。
综上所述，本发明提供了一种利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法：
该方法可以极大地促进人工微生物菌群CBP的效率。而且该法不仅可以用于提高人工微生物菌群一步法产葡糖二酸的效率，还具有普遍性，可用于其它由里氏木霉与酿酒酵母组成的微生物菌群的CBP效率，比如白酒糟产单细胞蛋白。采用分工协作推拉策略以后SCP产量明显提高，证明了分工协作推拉策略是一种有效的、普遍适用的提高人工微生物菌群整合生物加工效率的方法。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，其特征在于，包括如下步骤，将多种人工微生物混合后得到混合菌群，将所述混合菌群与原材料混合后发酵，即完成加工，所述人工微生物包括里氏木霉菌和酵母菌。
2.根据权利要求1所述的利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，其特征在于，所述原材料包括农业废料和工业废料。
3.根据权利要求2所述的利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，其特征在于，所述人工微生物包括里氏木霉C10和酿酒酵母PC3。
4.根据权利要求3所述的利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，其特征在于，所述里氏木霉C10和酿酒酵母PC3的接种比为(2.5-3.5):1。
5.根据权利要求4所述的利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，其特征在于，所述原材料包括酒糟，所述里氏木霉C10和酿酒酵母PC3的混合菌群与所述酒糟的接种率为2-6％。
6.根据权利要求2所述的利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，其特征在于，所述人工微生物包括里氏木霉C10和酿酒酵母LGA-1C3S2。
7.根据权利要求6所述的利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，其特征在于，所述里氏木霉C10和酿酒酵母LGA-1C3S2的接种比为1:1。
8.根据权利要求6所述的利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，其特征在于，所述原材料包括秸秆，所述里氏木霉C10和酿酒酵母LGA-1C3S2混合菌群与所述秸秆的接种率为8-12％。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，其特征在于，所述发酵的温度为28-32℃。
10.根据权利要求9所述的利用人工微生物提高整合生物加工效率的方法，其特征在于，所述发酵的时间至少为7天。
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