CN104480083A - 一种脂肪酶、工程菌及其制备方法 - Google Patents

一种脂肪酶、工程菌及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种脂肪酶、工程菌及其制备方法。所述脂肪酶，其基因序列为由SEQ ID No.1所示的基因序列，或其同源的功能相同的基因序列。所述工程菌其宿主菌为毕赤酵母，在His位点处插入有所述的脂肪酶的基因序列。工程菌的制备方法为：(1)构建脂肪酶基因表达载体；(2)构建分子伴侣组合基因表达载体；(3)制备脂肪酶表达转基因工程菌；(4)制备脂肪酶高表达工程菌。利用所述工程菌制备脂肪酶的步骤为：A、活化获取种子液；B发酵罐发酵；C离心，收集上清液。所述脂肪酶，在工程菌中异源表达量，具有外泌性，单位酶活高，生产方便，具有良好的经济效益。

Description

一种脂肪酶、工程菌及其制备方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，更具体地，涉及一种脂肪酶、工程菌及其制备方法。
背景技术
脂肪酶(Triacylglycerol acylhydrolase,Lipase EC3.1.1.30),又称甘油三酯水解酶，可催化酯化反应、醇解反应、氨解反应等。在有机溶剂中稳定性好，具有高度的位置选择性和异构体选择性。Candida rugosa原名Candida cylindracea，皱褶假丝酵母脂肪酶(C.rugosa lipases，CRLs)在化工、能源、食品、医疗等领域有广泛的应用，是目前工业应用最为广泛的商品化脂肪酶之一。在原始的C.rugosa菌株中，几种同工酶的表达量从高到低，依次是LIP1、LIP3、LIP2、LIP5和LIP4。
现已经报道是CRL1脂肪酶的不高，Brocca[Design,total synthesis,and functional overexpression of the Candida rugosa lip1gene coding for a major industrial lipase[J].Protein Sci.1998,7(6):1415-1422.]等首次用全基因合成方法将密码子CTG突变为TCN，合成了的lip1基因，并在Saccharomyces cerevisiae和Pichia pastoris中异源表达，都得到有活性的蛋白，且转入P.pastoris的转化子在1-L摇瓶中pH 6.0条件下，发酵280小时酶活达到150U/mL，且对C8和C10长度的脂类显示较高的水解活力。2005年Chang[Multiple mutagenesis of the Candida rugosa LIP1gene and optimum production of recombinant LIP1expressed in Pichia pastoris[J].Appl Microbiol Biotechnol.2005,67(2):215-224.]等应用RT-PCR技术从C.rugosa(X64703)菌株中克隆lip1基因，利用Overlap extension PCR技术将该基因中的19个编码丝氨酸的CTG密码子突变为TCT，以P.pastoris KM71为宿主菌株，表达产物经纯化后，以三丁酸甘油酯为底物，酶活力为253.3U/mL。此外，Xunzhang Wang[Scale-up fermentation of recombinant Candida rugosa lipase expressed in Pichia pastoris using the GAP promoter]将lip1构建到含有GAP启动子的载体，并在毕赤酵母中过异源表达，在5L发酵罐中60h时酶活力仅有653.94U/mL，反应扩大至30L时，在72h的最高酶活力达到7,663U/mL，在800L的巨大的发酵罐中，最高酶活力仅有14,000U/mL。
可以看出，当前构建的工程菌在产量方面仍然不够，活性方面仍不够理想，经济效益不高。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种脂肪酶、工程菌及其制备方法，其目的在于通过改变脂肪酶密码子和工程菌的基因结构，由此解决目前工程菌生产脂肪酶，酶活不高经济效益不理想的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种脂肪酶，所述脂肪酶，其基因序列为：
(1)由SEQ ID No.1所示的基因序列；或
(2)与序列SEQ ID No.1限定的基因序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的基因序列；或
(3)SEQ ID No.1所示的基因序列经增加、确实或替换一个或多个密码子具有同等活性的由(1)衍生的基因。
按照本发明的另一方面，提供了一种工程菌，其宿主菌为毕赤酵母，在His位点处插入有如权利要求1所述的脂肪酶的基因序列。
优选地，所述工程菌，其脂肪酶的基因序列拷贝数大于或等于2。
优选地，所述工程菌，在其AOX1位点插入有分子伴侣组合基因，用于提高所述脂肪酶的表达量。
优选地，所述工程菌，其分子伴侣组合基因为pGAPZAEro1p-pPICZABip，其序列为：
(1)由SEQ ID No.2所示的基因序列；或
(2)与序列SEQ ID No.2限定的基因序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的基因序列；或
(3)SEQ ID No.2所示的基因序列经增加、确实或替换一个或多个密码子具有同等活性的由(1)衍生的基因。
优选地，所述工程菌，其脂肪酶基因上游，具有酿酒酵母的α-factor信号肽基因序列。
优选地，所述工程菌，其宿主菌为甲醇利用快型毕赤酵母，优选GS115型毕赤酵母。
按照本发明的另一方面，提供了一种所述的工程菌的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建脂肪酶基因表达载体：以用于His位点插入的毕赤酵母表达体系质粒为载体，依次包含AOX1强启动子、酿酒酵母的α-factor信号肽、以及所述脂肪酶基因片段；
(2)构建分子伴侣组合基因表达载体：以用于在AOX1位点插入功能基因的毕赤酵母表达体系质粒为载体，插入的两段功能性基因，其中第一功能性基因依次包含AOX1强启动子和分子伴侣Bip基因片段，第二功能性基因依次包含GAP强启动子和分子伴侣ERO1p基因片段；
(3)制备脂肪酶表达转基因工程菌：以毕赤酵母为宿主菌，将步骤(1)中构建的脂肪酶基因表达载体转入，经过抗性筛选阳性克隆子，获得重组工程菌；
(4)制备脂肪酶高表达工程菌，以步骤(3)中获得的重组工程菌为宿主菌，将步骤(2)中构建的分子伴侣组合基因表达载体转入，经过抗性筛选获得阳性克隆子，再经发酵定量筛选获得所述工程菌。
优选地，所述工程菌的制备方法，其步骤(1)所述用于His位点插入的毕赤酵母表达体系质粒为PAO815质粒。
优选地，所述工程菌的制备方法，其步骤(2)所述用于在AOX1位点插入功能性基因的毕赤酵母表达体系质粒为pPICZA/pGAPZA质粒。
优选地，所述工程菌的制备方法，其所述步骤(4)发酵定量筛选的发酵时间为120小时,接种量在1％至6％，优选接种量为4％。
按照本发明的另一方面，提供了一种脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：
A、将所述的工程菌在酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基中，26℃至30℃，培养16小时至20小时，得到种子液；
B、将步骤A中获得的种子液转接到发酵罐中，接种量在3％至10％之间，培养8小时至10小时，补加碳源，培养至发酵罐内培养液OD600在150至160之间，流加甲醇和山梨醇混合补料，维持溶氧值在15％至50％之间，获得发酵液；
C、将步骤B中的发酵液离心，收集上清液，即制得所述脂肪酶。
优选地，所述脂肪酶的制备方法，其步骤B所述碳源为甘油的水溶液，其质量浓度在40％至60％之间。
优选地，所述脂肪酶的制备方法，其步骤B所述甲醇和山梨醇混合补料，其中甲醇和山梨醇的体积比在3:1至1:3之间。
优选地，所述脂肪酶的制备方法，其步骤B所述发酵罐中采用的发酵培养基为FM22发酵培养基。 
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
(1)本发明提供的脂肪酶，由于对CRL1进行了全基因序列密码子优化，将其在毕赤酵母使用频率较低的密码子同义突变为使用频率较高的密码子，因此大幅提高了脂肪酶的异源表达量。
(2)本发明提供的工程菌，一方面引入高效启动子，使得脂肪酶的表达量进一步提高，同时引入酿酒酵母的α-factor信号肽序列，使得利用PAO815构建的表达载体在毕赤酵母中异源表达时，可使重组工程菌分泌所需蛋白质至培养基中，具有外泌性，因此该工程菌发酵产物中单位酶活大幅提高。
(3)本发明构建的重组工程菌具有最高的CRL1表达量，其表达的脂肪酶具有较高催化活力，拥有良好的工业应用性。体外构建多拷贝表达载体电转毕赤酵母GS115，筛选到高拷贝数的概率大，重组工程菌所产生的lip1脂肪酶酶活力高，存在于发酵上清液中，方便使用，高密度发酵可进一步提高lip1的异源表达量，从而可以降低获得脂肪酶高效表达的操作成本和脂肪酶扩大培养的经济成本。
附图说明
图1是脂肪酶基因表达载体图谱；其中，图1a为拷贝数为1时脂肪酶基因表达载体结构图，图1b为拷贝数为2时脂肪酶基因表达载体结构图；
图2是分子伴侣表达载体图谱；
图3是密码子优化前后密码子适应性指数变化图，其中图3a为优化前密码子适应指数，CAI＝0.55,图3b优化后密码子适应指数，CAI＝0.85；
图4是密码子优化后的密码子使用频率分布图，其中图4a为优化前密码子使用频率分布，图4b为优化后密码子使用频率分布；
图5是密码子优化前后的密码子使用中的GC含量图，其中图a为优化前密码子使用中的GC含量，
图b为优化后密码子使用中的GC含量；
图6是重组工程菌GS115/PAO815-α-2mCRL187#和GS115/87-ZA-EROBIP 7#在摇瓶发酵中产生CRL1的过程中脂肪酶活力、总蛋白质含量图；
图7是实施例4双分子伴侣表达重组工程菌GS115/87-ZA-ERO1pBIP 7#在3L发酵罐中甲醇-山梨醇混合诱导产生CRL1的过程中脂肪酶活力、总蛋白质含量、湿重和OD600的变化。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的脂肪酶，其基因序列为：
(1)由SEQ ID No.1所示的基因序列；或
(2)与序列SEQ ID No.1限定的基因序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的基因序列；或
(3)SEQ ID No.1所示的基因序列经增加、确实或替换一个或多个密码子具有同等活性的由(1)衍生的基因。
本发明提供的工程菌，其宿主菌为毕赤酵母，优选为甲醇利用快型，更优选GS115型毕赤酵母。在其His位点处，插入有本发明提供的脂肪酶的基因序列，优选地拷贝数大于或等于2。
所述工程菌在AOX1位点插入有分子伴侣组合基因，用于提高所述脂肪酶的表达量。所述分子伴侣组合基因为pGAPZAEro1p-pPICZABip，其序列为：
(1)由SEQ ID No.2所示的基因序列；或
(2)与序列SEQ ID No.2限定的基因序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的基因序列；或
(3)SEQ ID No.2所示的基因序列经增加、确实或替换一个或多个密码子具有同等活性的由(1)衍生的基因。
优选地，所述脂肪酶基因上游，最好是紧邻脂肪酶基因，具有酿酒酵母的α-factor信号肽基因序列。
本发明提供的工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建脂肪酶基因表达载体：以用于His位点插入的毕赤酵母表达体系质粒为载体，依次包含5’AOX1强启动子、酿酒酵母的α-factor信号肽、以及所述脂肪酶基因片段，所述脂肪酶基因片段包括5’AOX1-TT片段、His4(组氨酸脱氢酶基因)、3’AOX1、PBR322以及Ampicillin；所述用于His位点插入的毕赤酵母表达体系质粒为PAO815质粒，其结构如图1所示。
(2)构建分子伴侣组合基因表达载体：以用于在AOX1位点插入功能性基因的毕赤酵母表达 体系质粒为载体，插入两段功能性基因，其中第一功能性基因依次包含5’AOX1强启动子和分子伴侣ERO1p基因片段，第二依次包含GAP强启动子和分子伴侣BIP基因片段；所述用于在AOX1位点插入功能性基因的毕赤酵母表达体系质粒为pPICZA/pGAPZA质粒。其结构如图2所示。
(3)制备脂肪酶表达转基因工程菌：以毕赤酵母为宿主菌，将步骤(1)中构建的脂肪酶基因表达载体转入，经过抗性筛选阳性克隆子，获得重组工程菌；
(4)制备脂肪酶高表达工程菌：以步骤(3)中获得的重组工程菌为宿主菌，将步骤(2)中构建的分子伴侣组合基因表达载体转入，经过抗性筛选获得阳性克隆子，再经发酵定量筛选获得所述工程菌。优选地，发酵定量筛选的发酵时间为120小时，因为此时酶活达到峰值，最高可达1758.5U/mL，接种量在1％至6％，优选接种量为4％。
应用所述工程菌，制备本发明提供的脂肪酶，其具体步骤为：
A、将本发明提供的工程菌在酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基中，26℃至30℃，培养16小时至20小时，得到种子液；
B、将步骤A中获得的种子液转接到发酵罐中，接种量在3％至10％之间，培养8小时至10小时，补加碳源，培养至发酵罐内培养液OD600在150至160之间，流加甲醇和山梨醇混合补料，维持溶氧值在15％至50％之间,用于诱导脂肪酶的产生，获得发酵液。所述碳源优选为甘油的水溶液，其质量浓度在40％至60％之间；所述甲醇和山梨醇混合补料，其中甲醇和山梨醇的体积比在3:1至1:3之间；所述发酵罐中优选采用的发酵培养基为FM22发酵培养基。
C、将步骤B中的发酵液离心，收集上清液，即制得所述脂肪酶。
当前工程菌产量不高，其产生的脂肪酶酶活有限，主要原因是：现有报道中使用的lip1的基因仅将非常规使用的密码子CTG进行了突变，并没有针对低频密码子和稀有密码子进行优化改造，lip1中的GC含量高、RNA二级结构的复杂性高均会降低mRNA的转录和翻译效率；单一优化后克隆至载体中表达，尽管可一定幅度提高表达量，但与其对应的表达调控路径没有得到优化，仍然会制约其超高表达和活性发挥。
本发明一方面通过优化脂肪酶密码子，提高脂肪酶的表达量，从而提高脂肪酶产量；另一方面共表达分子伴侣组合，有助于CRL1的蛋白质的正确折叠，从而提高其表达量，此外还通过3L发酵罐进行了高密度发酵，进一步扩大培养。
以下为实施例：
表1 是本发明中使用的PCR引物
实施例1
一种脂肪酶，其基因序列为由SEQ ID No.1所示的基因序列。在密码子优化前后，密码子适应性指数变化如图3所示。密码子优化后的密码子使用频率分布图如图4所示。密码子优化前后的密码子使用中的GC含量如图5所示。
实施例2
一种工程菌，其宿主菌为GS115型毕赤酵母，基因结构如图1所示。
在其His位点处，插入有实施例1的脂肪酶的基因序列，拷贝数为2。其上游紧邻插入有酿酒酵母的α-factor信号肽基因序列。
在其AOX1位点插入有分子伴侣组合基因，用于提高所述脂肪酶的表达量。所述分子伴侣组合基因为pGAPZAEro1p-pPICZABip，其序列为由SEQ ID No.2所示的基因序列。
实施例3
实施例2提供的工程菌，按照如下方法制备：
(1)构建脂肪酶基因表达载体，其结构如图1b所示。
具体步骤如下：
步骤1：含有α-factor信号肽的mpFLD-vgb-CRL1的表达载体构建。以本实验室预先构建的表达载体pFLD-vgb-TLL为模板，使用引物对M-F1/R1(表格1)通过突变全质粒PCR的方法，扩增得到mPFLD-vgb-TLL。扩增条件为：98℃预变性5min；98℃变性10s，68℃退火6min，18个循环；68℃延伸10min；15℃保温。体系如下：质粒PFLD-vgb-TLL为模板2ul，10uM M-F11ul，10uM M-R11ul，2×Primer star 25ul，ddH2O 21ul；利用0.8％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测到PCR扩增片段约6.1Kb；加入3ul Dpn I消化，37℃反应3小时，使用Omega公司的Gel Extraction Kit试剂盒胶回收之后直接转化大肠杆菌；抽质粒，Xho I、Not I双酶切验证，并送样至上海桑尼公司测序。以引物对CRL1-F1/R1(表格1)，以PUC57-CRL1为模板扩增CRL1，Xho I,Not I双酶切PCR胶回收产物，同时双酶切表达载体mPFLD-vgb-TLL，双酶切胶回收产物通0.8％(w/v)琼脂糖凝 胶电泳检测并酶连8小时以上；转化大肠杆菌筛选，双酶切验证之后送样至上海桑尼进行测序，得到表达载体mPFLD-vgb-CRL1。
步骤2：含有α-factor信号肽的CRL1胞外表达载体构建。以mPFLD-vgb-CRL1质粒为模板，利用引物对PAO815-CRL1-F1/R1(表格1)进行PCR扩增含有α-factor信号肽的CRL1，PCR产物胶回收之后经过EcoR I酶切，胶回收得到a-factor-CRL1；PAO815载体，线性化去磷酸化之后胶回收纯化；将a-factor-CRL1酶切胶回收产物与PAO815线性化去磷酸化胶回收产物酶连后转化大肠杆菌，验证正确即可得到表达载体PAO815-α-CRL。
步骤3：CRL1基因中消除BamH I和Bgl II的载体的突变。以PAO815-M-F1/R1为引物，以PAO815-α-CRL1为模板，利用MEGAWHOLE的方法进行两次PCR，即可PCR得到9.1kb大小的条带，Dpn I消化胶回收之后转化大肠杆菌，筛选即可得到PAO815-α-mCRL1。
步骤4：体外构建含有多个CRL1拷贝表达载体的构建。以引物对BDK-F1/R1,PAO815-α-mCRL1质粒作为模板，PCR扩增表达框，表达框结构5’(Bgl II)-AOX-mCRL1-AOXTT-3’(BamH I)，表达框胶回收之后，BamH I和Bgl II双酶切再次胶回收，BamH I线性化并去磷酸化PAO815-α-mCRL1载体，将表达框胶回收产物与去磷酸化线性化的PAO815-α-mCRL1载体，进行酶连；转化大肠杆菌筛选得到表达载体PAO815-α-XmCRL1(X＝1,2)。
(2)构建分子伴侣组合基因表达载体pGAPZAEro1p-pPICZABip，其结构如图2所示。
其具体步骤为：
步骤1：以GS115基因组为模板，使用引物对BIP-F/R(见表1)扩增分子伴侣BIP，PCR产物经Xho I I和Not I双酶切后，连接至用相同的内切酶双酶切后的表达载体pPICZA中，构建成重组质粒pPICZA-BIP。
步骤2：以GS115基因组为模板，使用引物对Ero-F/R(见表1)扩增分子伴侣Eor1p，PCR产物经Xho I和Not I双酶切后，连接至用相同的内切酶双酶切后的表达载体pPICZA中，在此基础上消除分子伴侣Eor1p中的Bgl II的酶切位点，构建成重组质粒pGAPZA-Ero1p。
步骤3：使用BamH I和Bgl II双酶切表达载体pGAPZA-Ero1p，同时将表达载体pPICZA-BIP进行线性化和去磷酸化，胶回收后酶连转化，筛选得到含有两个分子伴侣组合的分子伴侣表达载体pGAPZAEro1p-pPICZABip。
(3)制备脂肪酶表达转基因工程菌：
具体步骤如下：
步骤1：CRL1多拷贝表达载体在毕赤酵母中的异源表达。用SalⅠ在37℃下反应2-3h进行线性化PAO815-α-XmCRL1(X＝1,2,3)后胶回收；将宿主菌P.pastoris GS115的单菌落活化，取50-100μL YPD液体培养物，接种到100mL YPD液体培养基中，28℃，200rpm培养生长至OD600＝1.3-1.5，按照Invitrogen的方法利用电转化仪将线性化完全的质粒电转入毕赤酵母，涂布于MD筛选平板上，28℃培养2-3天。
步骤2：重组工程菌的筛选与摇瓶发酵。将筛选平板上的生长的毕赤酵母重菌株 GS115/PAO815-α-XmCRL1用无菌牙签挑至BMMY酶活检测平板上，倒置于28℃培养，每隔24h向平板盖上加入250μL甲醇，诱导3-4d。每天观察重组菌株在酶活性检测平板上的生长状况及水解圈大小，挑选菌落直径和水解圈直径比值小的重组菌株进行摇瓶发酵筛选；使用玻璃珠法提取酵母基因组，使用引物对CRL1-F1/R1，以酵母基因组为模板，PCR验证重组表达载体在毕赤酵母GS115中成功表达。将重组工程菌接种至5mL YPD液体培养基中活化，按照接种量1.0％-6.0％将活化的重组工程菌接种至50mL BMMY液体培养基(pH 7.0)中，28℃、200rpm培养，每隔24h加入0.5％(v/v)甲醇，120h后取发酵液上清液测定酶活力。
步骤3：摇瓶发酵产生lip1脂肪酶活力的测定。采用滴定法测定脂肪酶活力，具体方法如下：酶活检测体系如下：4mL橄榄油乳化液，5mL Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0)，1mL稀释发酵液上清。反应条件：将反应体系放入40℃水浴温育10min后，加入15mL终止液(乙醇:丙酮＝1:1，v/v)终止反应。反应结束后滴加几滴酚酞指示滴定终点，用0.05M NaOH滴定计算酶水解橄榄油产生的脂肪酸量。酶活力单位(U)定义：在40℃，pH 8.0条件下，以橄榄油为底物，脂肪酶每分钟催化产生1μmoL游离脂肪酸所需的酶量。
步骤4：摇瓶发酵蛋白质总含量的测定和SDS-PAGE蛋白胶的鉴定。蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝的测定方法；制配SDS-PAGE胶(12％分离胶，5％浓缩胶)，将30μL发酵上清液与30μL上样缓冲液混匀后，煮沸10min。点样量10～20μL，跑胶结束后染色、脱色至出现清晰地条带。即得到一株摇瓶发酵酶活力高达1200U/ml的高酶活菌株GS115/PAO815-α-2mCRL187#，蛋白质含量为1.0018g/l，经过SDS-PAGE胶鉴定发酵液上清中的CRL1条带大小为64kDa左右。
重组工程菌GS115/PAO815-α-2mCRL187#和GS115/87-ZA-EROBIP 7#在摇瓶发酵中产生CRL1的过程中脂肪酶活力、总蛋白质含量如图6所示。
(4)制备脂肪酶高表达工程菌：
步骤1：分子伴侣组合在GS115/PAO815-α-2mCRL187#的共表达
将重组质粒pGAPZAEro1p-pPICZABip用Mss I(FD)在37℃下反应30min进行线性化回收；制备GS115/PAO815-α-2mCRL187#的酵母感受态细胞，将分子伴侣二次电转入GS115/PAO815-α-2mCRL187#，YPDS-Zeocin抗性筛选平板上，放入28℃的恒温培养箱培养2～3天。
其他步骤同制备脂肪酶表达转基因工程菌，步骤3及步骤4。
实施例4
应用实施例3中的工程菌，制备本发明提供的脂肪酶，其具体步骤为：
A、将本发明提供的工程菌在酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基中，26℃，培养20小时，得到种子液；
具体步骤为：将-80℃保存的重组工程菌接种至5/50mL的酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基中，在26℃培养20小时。
B、将步骤A中获得的种子液转接到发酵罐中，接种量为10％之间，培养10小时，补加碳源， 即甘油的水溶液，其质量浓度为50％之间，培养至发酵罐内培养液OD600在150至160之间，流加甲醇和山梨醇混合补料，其中甲醇和山梨醇的体积比为1:1，维持溶氧值在15％至50％之间,用于诱导脂肪酶的产生，获得发酵液。所述发酵罐中采用的发酵培养基为FM22发酵培养基。
具体步骤如下：
3L发酵罐高密度发酵研究共表达分子伴侣对于CRL1的分泌表达的方法。包括下列步骤：
步骤1：3L发酵罐分批补料培养。以10％的接种量将活化的种子液接种到起始装液量为1.2L的FM22基础盐培养基中；发酵采用分批补料的方式，即发酵经过10小时甘油生长阶段，甲醇诱导产酶阶段，发酵过程中，需要每隔8h取样，测定脂肪酶活力、细胞湿重和蛋白含量。
步骤2：生物量的测定。每次从发酵罐取样后，应立即进行生物量的测定。用移液枪吸取1.8mL的发酵液；室温下12,000rpm离心3min后，将上清液吸干，称量细胞的湿重。每次测定生物量时要测定3次取均值。
其他步骤同实施例3制备脂肪酶表达转基因工程菌，步骤3及步骤4。
C、将步骤B中的发酵液离心，收集上清液，即制得所述脂肪酶。
重组工程菌GS115/87-ZA-ERO1pBIP 7#在3L发酵罐中，经过30h左右的基础甘油生长期和流加甘油补料生长期，菌体的湿重能达到154.8g/L，菌体的OD值也能达到163.35。发酵诱导开始后，pH设为5.5，诱导温度设为27℃，在补加甲醇-山梨醇混合补料之后，在发酵164h时，菌体湿重达到412.7g/L，OD600达到472.4，蛋白质含量达到5.043g/L；在发酵时间130h，酶活力达到最大值，最高酶活为13,490U/mL(图5)。其双分子伴侣表达重组工程菌GS115/87-ZA-ERO1pBIP 7#在3L发酵罐中甲醇-山梨醇混合诱导产生CRL1的过程中脂肪酶活力、总蛋白质含量、湿重和OD600的变化，如图7所示。
实施例5
应用实施例3中的工程菌，制备本发明提供的脂肪酶，其具体步骤为：
A、将本发明提供的工程菌在酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基中，28℃，培养18小时，得到种子液；
具体步骤为： 
将-80℃保存的重组工程菌接种至5/50mL的酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基中，在28℃培养18小时。
B、将步骤A中获得的种子液转接到发酵罐中，接种量为3％之间，培养8小时，补加碳源，即甘油的水溶液，其质量浓度为40％之间，培养至发酵罐内培养液OD600在150至160之间，流加甲醇和山梨醇混合补料，其中甲醇和山梨醇的体积比为3:1，维持溶氧值在15％至50％之间,用于诱导脂肪酶的产生，获得发酵液。所述发酵罐中采用的发酵培养基为FM22发酵培养基。
具体步骤如下：
步骤1：3L发酵罐分批补料培养。以3％的接种量将活化的种子液接种到起始装液量为1.2L的FM22基础盐培养基中；发酵采用分批补料的方式，即发酵经过甘油生长阶段8小时，甲醇诱导 产酶阶段，发酵过程中，需要每隔8h取样，测定脂肪酶活力、细胞湿重和蛋白含量。
步骤2：生物量的测定。每次从发酵罐取样后，应立即进行生物量的测定。用移液枪吸取1.8mL的发酵液；室温下12,000rpm离心3min后，将上清液吸干，称量细胞的湿重。每次测定生物量时要测定3次取均值。
其他步骤同实施例3制备脂肪酶表达转基因工程菌，步骤3及步骤4。
C、将步骤B中的发酵液离心，收集上清液，即制得所述脂肪酶。
重组工程菌GS115/87-ZA-ERO1pBIP 7#在3L发酵罐中，经过30小时的基础甘油生长期和流加甘油补料生长期，菌体的湿重能达到152.1g/L，菌体的OD值也能达到156。发酵诱导开始后，pH设为5.5，诱导温度设为27℃，在补加甲醇-山梨醇混合补料之后，在发酵160h时，菌体湿重达到408.2g/L，OD600达到465.4，蛋白质含量达到4.891g/L；在发酵时间130h，酶活力达到最大值，最高酶活为13,090U/mL。
实施例6
应用实施例3中的工程菌，制备本发明提供的脂肪酶，其具体步骤为：
A、将本发明提供的工程菌在酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基中，30℃，培养16小时，得到种子液；
具体步骤如下：
将-80℃保存的重组工程菌接种至5/50mL的酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基中，在30℃培养16小时。
B、将步骤A中获得的种子液转接到发酵罐中，接种量为6％之间，培养9小时，补加碳源，即甘油的水溶液，其质量浓度为60％之间，培养至发酵罐内培养液OD600在150至160之间，流加甲醇和山梨醇混合补料，其中甲醇和山梨醇的体积比为1:3，维持溶氧值在15％至50％之间,用于诱导脂肪酶的产生，获得发酵液。所述发酵罐中采用的发酵培养基为FM22发酵培养基。
具体步骤如下：
步骤1：3L发酵罐分批补料培养。以6％的接种量将活化的种子液接种到起始装液量为1.2L的FM22基础盐培养基中；发酵采用分批补料的方式，即发酵经过甘油生长9小时阶段，甲醇诱导产酶阶段，发酵过程中，需要每隔8h取样，测定脂肪酶活力、细胞湿重和蛋白含量。
步骤2：生物量的测定。每次从发酵罐取样后，应立即进行生物量的测定。用移液枪吸取1.8mL的发酵液；室温下12,000rpm离心3min后，将上清液吸干，称量细胞的湿重。每次测定生物量时要测定3次取均值。
其他步骤同实施例3制备脂肪酶表达转基因工程菌，步骤3及步骤4。
C、将步骤B中的发酵液离心，收集上清液，即制得所述脂肪酶。
重组工程菌GS115/87-ZA-ERO1pBIP 7#在3L发酵罐中，经过30小时的基础甘油生长期和流加甘油补料生长期，菌体的湿重能达到148.1g/L，菌体的OD值也能达到155.5。发酵诱导开始后，pH设为5.5，诱导温度设为27℃，在补加甲醇-山梨醇混合补料之后，在发酵164h时，菌体湿重达 到401.7g/L，OD600达到462.1，蛋白质含量达到4.934g/L；在发酵时间130h，酶活力达到最大值，最高酶活为12,980U/mL。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶，其基因序列为：
(1)由SEQ ID No.1所示的基因序列；或
(2)与序列SEQ ID No.1限定的基因序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的基因序列；或
(3)SEQ ID No.1所示的基因序列经增加、确实或替换一个或多个密码子具有同等活性的由(1)衍生的基因。
2.一种工程菌，其特征在于，其宿主菌为毕赤酵母，在His位点处插入有如权利要求1所述的脂肪酶的基因序列。
3.如权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌在AOX1位点插入有分子伴侣组合基因，所述分子伴侣组合基因优选为pGAPZAEro1p-pPICZABip，其序列为：
(1)由SEQ ID No.2所示的基因序列；或
(2)与序列SEQ ID No.2限定的基因序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的基因序列；或
(3)SEQ ID No.2所示的基因序列经增加、确实或替换一个或多个密码子具有同等活性的由(1)衍生的基因。
4.如权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述脂肪酶基因上游，具有酿酒酵母的α-factor信号肽基因序列。
5.如权利要求2至4任意一项所述的工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建脂肪酶基因表达载体：以用于His位点插入的毕赤酵母表达体系质粒为载体，依次包含AOX1强启动子、酿酒酵母的α-factor信号肽、以及如权利要求1所述的脂肪酶基因片段；
(2)构建分子伴侣组合基因表达载体：以用于在AOX1位点插入功能基因的毕赤酵母表达体系质粒为载体，插入的两段功能性基因，其中第一功能性基因依次包含AOX1强启动子和分子伴侣Bip基因片段，第二功能性基因依次包含GAP强启动子和分子伴侣ERO1p基因片段；
(3)制备脂肪酶表达转基因工程菌：以毕赤酵母为宿主菌，将步骤(1)中构建的脂肪酶基因表达载体转入，经过抗性筛选阳性克隆子，获得重组工程菌；
(4)制备脂肪酶高表达工程菌，以步骤(3)中获得的重组工程菌为宿主菌，将步骤(2)中构建的分子伴侣组合基因表达载体转入，经过抗性筛选获得阳性克隆子，再经发酵定量筛选获得如权利要求2至4任意一项所述的工程菌。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述用于在AOX1位点插入功能性基因的毕赤酵母表达体系质粒为pPICZA/pGAPZA质粒。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)发酵定量筛选的发酵时间为120小时,接种量在1％至6％，优选接种量为4％。
8.如权利要求1所述的脂肪酶，其制备方法，包括以下步骤：
A、将如权利要求2至4任意一项所述的工程菌在酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基中，26℃至30℃，培养16小时至20小时，得到种子液；
B、将步骤A中获得的种子液转接到发酵罐中，接种量在3％至10％之间，培养8小时至10小时，补加碳源，培养至发酵罐内培养液OD600在150至160之间，流加甲醇和山梨醇混合补料，维持溶氧值在15％至50％之间，获得发酵液；
C、将步骤B中的发酵液离心，收集上清液，即制得所述脂肪酶。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤B所述碳源为甘油的水溶液，其质量浓度在40％至60％之间。
10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤B所述甲醇和山梨醇混合补料，其中甲醇和山梨醇的体积比在3:1至1:3之间。
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