CN105087614A - 疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因、工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因、工程菌及其应用，该疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的碱基序列如SEQ？ID？NO.2所示。本发明在不改变现有的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶氨基酸序列和蛋白结构的基础上，通过避免稀有密码子和密码子对、强的茎环结构和潜在的提前终止信号等不利于蛋白表达的因素，优化了疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因序列，使得该序列在毕赤酵母重组表达系统中能够高效表达疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶，表达活力高达370.65U/ml，较疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因原始序列的重组表达活力234.03U/ml，提高了58.38％。

Description

疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因、工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因、工程菌及其应用。

背景技术

脂肪酶(E.C.3.1.1.3)亦称酰基甘油水解酶，在自然界中主要催化三酰甘油酯的水解，还可在非水相条件下催化酯化、酯交换反应、醇解反应和酶解等反应。另外，脂肪酶具有多种底物特异性，如脂肪酸特异性脂肪酶，位置特异性脂肪酶和立体特异性脂肪酶等。脂肪酶的催化多样性和底物专一性等特征使其在粮油生产、食品工业、日用化学工业、油脂化学工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤剂工业以及药物合成等许多领域得到广泛应用。

sn-1,3，位置专一性脂肪酶，在油脂生产和油脂化工方面，应用潜力巨大；利用其位置专一性催化性能，可改变脂肪酸在甘油脂中的位置，将廉价的油脂原料加工成昂贵的功能性结构脂，如类可可脂、1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(OPO)和甘二酯等。然而，sn-1,3专一性脂肪酶成本较高，使其进一步应用受到限制。

降低脂肪酶制剂生产成本的有效途径包括：(1)通过传统微生物遗传育种方法改良脂肪酶生产菌株；(2)构建模式微生物的重组工程菌异源表达脂肪酶基因，以提高脂肪酶表达效率；(3)对产脂肪酶菌株发酵表达的工艺优化以及下游分离纯化优化；(4)通过酶固定化以及改善酶催化反应条件提高脂肪酶的反应效率和利用效率；(5)通过定向进化和理性设计等分子生物学对酶蛋白改造，改善脂肪酶的理化性质和催化性质提高脂肪酶的催化比活力等。

毕赤酵母重组表达系统在短短二十年里受到广泛关注，并迅速发展成为当前最有效、最方便的外源蛋白表达系统之一。毕赤酵母作为异源蛋白重组表达系统有以下优点：生长周期短、培养成本低、易于培养条件，适合大规模工业化生产；遗传背景清晰，易于分子和遗传改良操作；具有强启动子，转录、翻译表达和分泌外源基因的能力强，许多蛋白可达到每升克级或以上水平；具有真核系统的糖基化等翻译后修饰能力；自身分泌的蛋白少，减少检测、分离纯化的背景干扰；发酵工艺成熟，在氧气充足的条件下能够实现酵母细胞的高密度发酵；外源基因通过同源重组方式整合，遗传稳定性高等。

随着分子生物学和基因工程等领域的飞速发展，影响蛋白表达水平相关的因素和技术不断被阐释和掌握，如基因密码子的偏爱性、基因拷贝数、启动子转录效率、核糖体结合位点、分泌信号肽的转运效率、内质网和高尔基体内蛋白翻译后修饰以及宿主蛋白酶对目的蛋白的降解量等。并且这些因素和技术都被成功地应用于重组表达系统中以提高目的蛋白的表达水平。

发明内容

本发明提供了一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因、工程菌及其应用，含该基因序列能够在巴斯德毕赤酵母菌中高效表达疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶，且表达量和酶活力均较高。

一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因，碱基序列如SEQIDNO.2所示。

该脂肪酶基因是在现有的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶编码基因序列(SEQIDNO.3)的基础上，进行的优化和改良，以提高毕赤酵母中疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶的表达量。

该改良的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因序列的设计原则为：

(1)密码子和密码子对的偏爱性要与异源表达宿主巴斯德毕赤酵母的偏爱性接近，防止稀有密码子和稀有密码子对阻碍翻译的有序进行，从而提高目的蛋白的表达水平；

(2)提高mRNA的稳定性，利于mRNA的积累，从而保证翻译出更多的目的蛋白；mRNA起始端无强的茎环结构，可提高翻译起始效率；

(3)基因编码序列的GC含量要与宿主接近；

(4)合理设计修饰限制性酶切位点、重组位点、聚合酶滑动位点、TATA框、隐蔽剪接位点、转录终止信号、核糖体内部起始位点等影响蛋白表达的因素；

(5)编码序列的3’末端加上Histag标签的编码基因，可用于表达蛋白的检测和纯化；

(6)基因的两端连接限制性内切酶EcoRI和NotI的识别位点，可用于载体的连接构建。

通过重叠延伸PCR合成方法可扩增全长的coTLL序列，本发明改良的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因可通过专门的生物技术公司或机构完成。

本发明还提供了一种所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的表达载体。

作为优选，所述表达载体为pPIC9K。该表达载体为酵母表达载体。

本发明还提供了一种所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的表达盒。

本发明还提供了一种所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的工程菌。

所述的工程菌为巴斯德毕赤酵母。

进一步地，所述的工程菌为GS115菌株。

本发明所述的工程菌可用于生产疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明在不改变现有的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶氨基酸序列和蛋白结构的基础上，通过避免稀有密码子和密码子对、强的茎环结构和潜在的提前终止信号等不利于蛋白表达的因素，优化了疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因序列，使得该序列在毕赤酵母重组表达系统能够高效表达疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶，表达活力高达370.65U/ml，较疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因原始序列的重组表达活力234.03U/ml，提高了58.38％。

附图说明

图1为本发明改良的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶编码基因序列与原始序列比对的示意图。

图2为本发明脂肪酶基因的表达载体示意图。

图3为本发明表达载体pPIC9K/coTLL(A)和pPIC9K/wtTLL(B)的酶切验证电泳图；

其中，1为表达载体的电泳图；2为表达载体的酶切电泳图；M为Marker。

图4为含疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的不同重组酵母菌菌株产的脂肪酶活力的比较；其中，wt代表原始疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因，co代表序列改良后的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因，1-6代表菌株编号。

具体实施方式

本发明将疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶编码基因进行优化，获得了改良的适合毕赤酵母中高效表达的coTLL序列。

改良的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶编码基因序列与原始基因序列的比对，如图1。下面结合附图与实施例对本发明进一步说明，本发明要求保护的范围包含但并不局限于下列实施例所表述的范围。

实施例1

(1)疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶编码基因的改良

现有已公开的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶编码基因如SEQIDNO.3所示，该基因来源于疏绵状嗜热丝孢菌，与酵母不同种属，这可能是导致该基因在毕赤酵母中表达量不高的原因。

本实施例在疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶编码(TLL)氨基酸序列(SEQIDNO.1)的基础上，采用毕赤酵母偏好的密码子替换RML编码基因中在毕赤酵母中低频使用的密码子(如表1所示)，同时去掉强的茎环结构和潜在的提前终止信号等不利于蛋白表达的因素，设计出适合在巴斯德毕赤酵母中高效表达的基因序列，具体的序列如SEQIDNO.2所示，从而提高疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶编码(TLL)在毕赤酵母中的表达水平。

在此基础上，本序列在现有的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶编码基因的3’段引入组氨酸标签的编码基因，用于表达蛋白的鉴定和纯化。同时，在脂肪酶前导肽与成熟肽之间引入酵母Kex2识别位点KREAEA的编码核酸序列(AAGAGAGAAGCCGAGGCA)，用于帮助脂肪酶在毕赤酵母中的成熟。

上述内容采用的技术为本领域常规技术手段。

改良的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶编码基因可通过PCR人工合成，本实施例中基因的合成由江苏金维智公司完成；PCR产物经电泳检测，得到875bp左右大小条带，并证实获得了改良的TLL脂肪酶基因。

表1改良的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶编码基因序列、原始序列和毕赤酵母密码子使用频率的对比表。

(2)pPIC9K/coTLL和pPIC9K/wtTLL质粒的构建

将步骤(1)中获得的PCR产物用PCR回收试剂盒回收。克隆载体pUC57和PCR回收产物通过EcoRI和NotI双酶切，经过0.8％浓度的琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。

连接载体和上述回收片段的摩尔浓度比为5:1共8μl，加入1μl连接酶和1μl连接酶缓冲液，16℃进行连接过夜，获得连接产物。

将连接产物转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布于含有50mg/ml的氨苄青霉素的LB平板上，进行37℃培养过夜，进行转化筛选。挑取转化子单菌落接种到50mg/ml的氨苄青霉素LB液体培养基中，进行培养，用于质粒提取。coTLL和wtTLL基因序列通过测序验证，证实合成的基因序列正确。

将克隆到pUC57载体的基因片段通过EcoRI和NotI双酶切，连接到酵母表达载体pPIC9K中，并转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞，从而将该基因亚克隆到酵母表达载体pPIC9K中，使合成的优化基因coTLL和原始基因wtTLL分别插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K的开放读码框中(AOX1启动子和αFactor信号肽)，得到pPIC9K/coTLL和pPIC9K/wtTLL载体,载体示意图如图2所示。

提取的质粒经BglII酶切验证，电泳结果出现2400bp和7750bp左右大小条带，符合预期，证实获得了含目的基因的酵母表达载体。

(3)高效表达脂肪酶的毕赤酵母工程菌的培养和诱导表达

用SacI限制性内切酶线性化重组质粒pPIC9K/coTLL和pPIC9K/wtTLL，电转化的方法转化毕赤酵母GS115菌株，转化产物与1M山梨醇涂布于MD筛选平板，28℃培养2～3d。将MD平板上的所有转化子收集后混匀，取10⁵浓度的转化子接种到1.0、2.0、3.0和4.0mg/ml浓度G418的YPD筛选平板，28℃培养3～4d。将高浓度G418平板上生长的转化子作为后续发酵表达工程菌候选。

按Invitrogen操作指南提取酵母基因组DNA作PCR模板，利用脂肪酶基因序列的特异性引物对酵母转化子进行PCR鉴定。通过平板荧光圈法初步鉴定转化子产脂肪酶的能力，在含罗丹明B的乳化橄榄油培养基平板添加甲醇，诱导脂肪酶表达。将荧光圈直径与菌落直径比例较大的作为发酵表达的菌株。

将上述菌株GS115(pPIC9K/coTLL和pPIC9K/wtTLL)接种于20mlBMGY培养基中，28℃，200rpm培养至OD600到2～4。离心收集菌体，用BMMY培养基重悬细胞，稀释到OD₆₀₀到1，转入诱导培养阶段，间隔24h补加1.5％甲醇进行诱导，诱导表达144h。发酵液在8000rpm，4℃离心10分钟，收集上清作为脂肪酶样品。

利用对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)作为底物进行脂肪酶水解酶活测定，酶活单位U定义为：在一定条件下，单位时间1min催化底物生成1μmol对硝基苯酚(pNP)的酶量。

结果显示，GS115(pPIC9K/coTLL)菌株的发酵上清液脂肪酶活力为370.65U/ml，比TLL原始基因(wtTLL)的对应工程菌GS115(pPIC9K/wtTLL)的酶活(234.03U/ml)提高了58.38％。

同时，对同等条件下，诱导表达的6个wtTLL的酵母重组菌(wt1-6)和6个coTLL的酵母重组菌(co1-6)产脂肪酶酶活平均值进行比较发现，后6个菌株(即优化序列的重组菌)诱导表达的脂肪酶酶活的平均值为312.72，为前6个菌株(即原始序列的重组菌)对应的平均值(179.42U/ml)提高了74.30％。

Claims (8)

1.一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因，其特征在于，碱基序列如SEQIDNO.2所示。

2.一种包含权利要求1所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的表达载体。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pPIC9K。

4.一种包含权利要求1所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的表达盒。

5.一种包含权利要求1所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因的工程菌。

6.如权利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述的工程菌为巴斯德毕赤酵母。

7.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于，所述的工程菌为GS115菌株。

8.如权利要求5～7任一项所述的工程菌在生产疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶中的应用。