CN109957028A

CN109957028A - 提高分泌型蛋白的成熟肽产生的方法

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Publication number: CN109957028A
Application number: CN201711405041.9A
Authority: CN
Inventors: 宣姚吉; 徐正军; 牛其文
Original assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Current assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2019-07-02
Anticipated expiration: 2037-12-22
Also published as: CN109957028B

Abstract

本申请提供了用于表达成熟肽的融合蛋白以及编码所述融合蛋白的核酸分子、产生所述融合蛋白或成熟肽的方法。

Description

提高分泌型蛋白的成熟肽产生的方法

技术领域

本申请大体上涉及生物工程领域。具体而言，本申请提供了提高分泌型蛋白的成熟肽产生的方法，其中通过改造包含前导肽和成熟肽的前体蛋白的结构来提高成熟肽的产生。

背景技术

在生物学领域中，一些分泌型蛋白在细胞内最初表达时为包含前导肽和成熟肽的前体蛋白，随后在胞外分泌的过程中，前导肽被切除，成熟肽被分泌至胞外并发挥生物学作用。

例如，米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor mieheilipase,RML)是分泌型蛋白中的一种，其具有较强sn-1,3选择性以及高活力的特性，已被广泛用于结构脂质的酶法合成，如SOS、OPO、DAG的合成，处理鱼油富集DHA等多不饱和脂肪酸以及手性医药中间体及某些生物材料的制备。

天然的米黑根毛霉脂肪酶产量低、成分不稳定，提取困难，使得其无法工业化生产。因此，针对米黑根毛霉脂肪酶的研究主要集中在其酶学性质、应用范围以及在基因工程菌中的高效表达。1988年，诺维信公司的Boel和Huge-jensen确定了编码米黑根毛霉脂肪酶的cDNA序列，并确定米黑根毛霉脂肪酶前体蛋白是由米黑根毛霉脂肪酶成熟肽、70个氨基酸残基的前体肽及24个氨基酸残基的信号肽构成，通过酶切割前体蛋白的MET-SER之间的肽键而得到269个氨基酸残基的米黑根毛霉脂肪酶成熟肽。1989，Huge-jensen将米黑根毛霉脂肪酶的前体蛋白基因插入米曲霉的载体中，利用α-淀粉酶基因的启动子和糖化酶的终止子进行表达得到胞外分泌的rRML。利用该表达载体得到的rRML中有70％的N-端氨基酸序列与天然酶一致，而另外的30％的重组酶比天然酶少一个丝苏氨酸残基。此外，重组酶的等电点为4.3，其与米黑根毛霉脂肪酶一致，含糖量为1.2％，免疫性质也与天然酶高度相似。目前诺维信公司市场上销售的米黑根毛霉脂肪酶也是利用基因工程技术以米曲霉为载体表达的基因改性脂肪酶，液体酶商品名为20000L，固定化酶商品名为LipozymeRM IM。然而，尽管真菌米曲霉是一种优良的表达载体，但其自身会分泌各种非目标蛋白，例如：在诺维信的Lipozyme RM的酶液中，非目的蛋白淀粉酶的含量远高于目的蛋白RML，此外，还有很多其他杂蛋白如蛋白酶等，这导致其应用受到很大限制。目前，尽管诺维信将RML液体经过再次提纯，获得商品名为388的RML，但因其价格昂贵，进一步限制了其在工业中的应用。

因此，对于分泌型蛋白(例如米黑根毛霉脂肪酶)的基因工程制备方法的改进是本领域迫切需要的。

发明概述

第一方面，本申请提供了融合蛋白，其包含第一前导肽部分、柔性肽接头和成熟肽部分。在一些实施方案中，第一前导肽部分、柔性肽接头和成熟肽部分沿融合蛋白的N端至C端的方向存在于融合蛋白。

在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含位于第一前导肽部分的N端侧的信号肽。

在一些实施方案中，柔性肽接头和成熟肽之间包括第一酶切位点。

在一些实施方案中，融合蛋白进一步包含第二前导肽部分，第二前导肽部分位于第一前导肽部分和成熟肽部分之间。第一前导肽部分和第二前导肽部分可以相同或不同，优选相同。

在一些实施方案中，第二前导肽部分位于第一前导肽部分和柔性肽接头之间。

在一些实施方案中，第一前导肽部分和第二前导肽部分之间包括第二酶切位点。

在一些实施方案中，柔性肽接头包含氨基酸序列(GS)_a(GGS)_b(GG GS)_c(GGGGS)_d，其中a、b、c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1。在一些实施方案中，柔性肽接头包含氨基酸序列GGGSGGGS、GGGSGGGS、GGSGGSGGS、GSGSGSGSGS、GSGGSGS、GGSGGG S、GGGSGGGGS、GSGGSGGGS、GGGGSGGS、GSGGGSGGGGSG GGGS、GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GSGGGGSGGGGSGGGGS、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS、GGSGGSGGSGGS或GGGGSGG GSGS。在一些实施方案中，柔性肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)₂。

在一些实施方案中，信号肽部分、第一前导肽部分、第二前导肽部分、成熟肽部分独立地来自微生物来源脂肪酶。在一些实施方案中，微生物为细菌、真菌或酵母。在一些实施方案中，微生物为真菌。在一些实施方案中，微生物为霉菌。在一些实施方案中，微生物为米黑根毛霉菌、米根霉菌或华根霉菌。

在一些实施方案中，第一前导肽部分、第二前导肽部分、成熟肽部分来自同一微生物物种来源的脂肪酶。

在一些实施方案中，第一和/或第二酶切位点独立地或共同地为kex2/ste13酶切位点。

在一些实施方案中，信号肽和/或第一前导肽部分和/或第二前导肽部分以及成熟肽部分来自米黑根毛霉脂肪酶，第一和第二酶切位点均为kex2/ste13酶切位点，柔性肽接头为GGGGSGGGGS。

在一些实施方案中，信号肽部分选自黑根毛霉脂肪酶的信号肽、华根霉脂肪酶的信号肽、米根霉脂肪酶的信号肽、a-因子信号肽、α-淀粉酶信号序列、葡糖淀粉酶信号序列、血清白蛋白信号序列、菊粉酶导肽、转化酶信号序列、杀手蛋白质信号序列或溶菌酶信号序列。

在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID No：5或SEQ ID No：7所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID No：5或SEQ ID No：7所示的氨基酸序列经取代、替换和/或增加1个或2个或3个氨基酸的活性变体。

第二方面，本申请提供了编码第一方面所述的融合蛋白的核酸分子。

在一些实施方案中，核酸分子包含SEQ ID No：6或SEQ ID No：8所示的序列。

第三方面，本申请提供了含有第二方面所述的核酸分子的载体。

第四方面，本申请提供了含有第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的载体的宿主细胞。

在一些实施方案中，所述宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为毕赤酵母(pichia pastoris)。在一些具体实施方案中，第一前导肽部分和/或第二前导肽部分和/或信号肽以及成熟肽部分的编码序列根据毕赤酵母的偏好密码子进行优化。

第五方面，产生成熟肽的方法，其包括在允许融合蛋白表达的情况下，培养第四方面所述的宿主细胞，以及允许对所述融合蛋白进行切割，从而产生所述成熟肽。

附图说明

图1示出了融合蛋白pro/RML、2pro/RML、RMLprolinker和RML2prolinker的示意图。

图2示出了pNP标准曲线。

图3示出了pro/RML、2pro/RML、RMLprolinker和RML2prolinker各自的发酵酶活的比较。

图4示出了pro/RML、2pro/RML、RMLprolinker和RML2prolinker的SDS-PAGE电泳图，从左至右依次为：Marker、RMLprolinker、pro/RML、RML2prolinker、2pro/RML。

序列说明

SEQ ID No：1为pro/RML的氨基酸序列。

SEQ ID No：2为SEQ ID No：1的编码序列。

SEQ ID No：3为2pro/RML的氨基酸序列。

SEQ ID No：4为SEQ ID No：3的编码序列。

SEQ ID No：5为RMLprolinker的氨基酸序列。

SEQ ID No：6为SEQ ID No：5的编码序列。

SEQ ID No：7为RML2prolinker的氨基酸序列。

SEQ ID No：8为SEQ ID No：7的编码序列。

详细描述

如前文所述，在生物学领域中，一些分泌型蛋白在细胞内最初表达时为包含前导肽和成熟肽的前体蛋白，随后在胞外分泌的过程中，前导肽被切除，成熟肽被分泌至胞外并发挥生物学作用。成熟肽产率与多种因素相关，其中切割效率是其中一个比较重要的因素。本申请的发明人通过改造包含前导肽和成熟肽的前体蛋白的结构提高了成熟肽的产率。不受任何理论的束缚，本申请的发明人认为成熟肽的产率提高与切割效率的提高有关。

本申请的发明人现以米黑根毛霉脂肪酶为例进行了研究。在已有的表达米黑根毛霉脂肪酶的方法中，可以在米黑根毛霉脂肪酶成熟肽和前导肽之间增加kex2/ste13酶切位点，使得前导肽能够在分泌过程中能够被切除，但切除效果并不理想，带有前导肽的proRML会大量分泌，而这种形态的proRML比酶活低，只有成熟肽RML的1％左右。如果能够提高前导肽的切割效率，就能得到更多的RML成熟蛋白，从而提高了RML的酶活产量。

本申请的发明人改造了米黑根毛霉脂肪酶的前体蛋白，其中原前导肽部分和成熟肽部分之间增加了额外的前导肽部分(例如，后面接酶切位点，例如kex2/ste13酶切位点)和/或柔性肽接头，如此改造后的前提蛋白在宿主细胞(例如，毕赤酵母)中表达时，米黑根毛霉脂肪酶成熟肽的产生能力得到提升。除非另外指明，本申请中所有的术语均具有本领域技术人员通常所理解的含义。

在一些实施方案中，融合蛋白还包含位于第一前导肽部分的N端侧的信号肽。

本领域技术人员能够理解，“融合蛋白”指具有两个或更多个功能性肽片段的蛋白分子。在本申请的背景下，“融合蛋白”可以理解为对天然分泌型蛋白的前体蛋白的改造后的形式。

本文所用的“前导肽”、“成熟肽”和“信号肽”按照分泌型蛋白相关的含义进行理解。“前导肽”、“成熟肽”和“信号肽”优选为分泌型蛋白的天然存在的各组分的形式。

在一些实施方案中，柔性肽接头和成熟肽之间包括第一酶切位点。例如，kex2/ste13酶切位点KREAEAEA或KREAEA。

在一些实施方案中，融合蛋白还包含第二前导肽部分，第二前导肽部分位于第一前导肽部分和成熟肽部分之间。第一前导肽部分和第二前导肽部分可以是相同的。第一前导肽部分和第二前导肽部分可以是不同的。

在一些实施方案中，第一前导肽部分和第二前导肽部分之间包括第二酶切位点。例如，第二酶切位点可以为kex2/ste13酶切位点KREAEAEA或KREAEA。

在一些实施方案中，柔性肽接头包含氨基酸序列(GS)_a(GGS)_b(GG GS)_c(GGGGS)_d，其中a、b、c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1。柔性肽接头的实例包括但不限于GGGSGGGS、GGGSGGGS、GGSGGSGGS、GSGSGSGSGS、GSGGSGS、GGSGGGS、GGGSGGG GS、GSGGSGGGS、GGGGSGGS、GSGGGSGGGGSGGGGS、GSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GSGGGGSGGGGSGGGGS、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS、GGSGGSGGSGGS或GGGGSGGGSGS。在一些具体实施方案中，柔性肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)₂。

在一些实施方案中，本申请的各项发明可应用于微生物来源脂肪酶，因此，信号肽部分、第一前导肽部分、第二前导肽部分、成熟肽部分独立地来自微生物来源脂肪酶。在一些实施方案中，微生物为细菌、真菌或酵母。微生物的实例包括但不限于：犁头霉属(Absida)菌株，具体为Absidia blakesleena和伞枝犁头霉(Absida corymbifera)；无色杆菌属(Achromobacter)菌株，具体为解毒无色杆菌(Achromobacter iophagus)；产气单孢菌属(Aeromonas)菌株；链格孢属(Alternaria)菌株，具体为甘蓝链格孢(Alternariabrassiciola)；曲霉属(Aspergillus)菌株，具体为黑曲霉(Aspergillus niger)和黄曲霉(Asperillus flavus)；无色杆菌属菌株，具体为解毒无色杆菌；短梗霉属(Aureobasidium)菌株，具体为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)；芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，具体为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstrearothermophilus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；白僵菌属(Beauveria)菌株；索丝菌属(Brochothrix)菌株，具体为热杀索丝菌(Brochothrix thermosohata)；念珠菌属(Candida)菌株，具体为柱状念珠菌(Candida cylindracea)、Candidaparalipolytica和南极念珠菌(Candida antarctica)；色杆菌属(Chromobacter)菌株，具体为粘稠色杆菌(Chromobacter viscosum)；鬼伞属(Coprinus)菌株，具体为灰盖鬼伞(Coprinus cinerius)；镰孢属(Fusarium)菌株，具体为尖镰孢(Fusarium oxysporum)、腐皮镰孢(Fusarium solani)、豌豆腐皮镰孢(Fusarium solani pisi)和大刀粉红镰孢(Fusarium roseum culmorum)；地霉属(Geotricum)菌株，具体为潘氏地霉(Geotricumpenicillatum)；汉逊氏酵母属(Hansenula)菌株，具体为异常汉逊氏酵母(Hansenulaanomala)；腐质霉属(Humicola)菌株，具体为短孢腐质霉(Humicola brevispora)、短腐质霉变种(Humicola brevis var)、短腐质霉高温变种(Humicola brevis var.thermoidea)和特异腐质霉(Humicola insolens)；Hyphozyma菌株；乳杆菌属(Lactobacillus)菌株，具体为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)；绿僵菌属(Metarhizium)菌株；毛霉属(Mucor)菌株；拟青霉属(Paecilomyces)菌株；青霉属(penicillium)菌株，具体为圆弧青霉(Penicillium cyclopium)、皮落青霉(Penicillum crustosum)和扩展青霉(Penicilliumexpansum)；假单胞菌属(Pseudomonas)菌株，具体为绿浓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、假单胞菌属产碱杆菌(Pseudomonas alcaligenes)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)，嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、Pseudomonas mephitica lipolytica、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、植物假单胞菌(Pseudomonas plantari)、类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)和Pseudomonas wisconsinensi；丝核菌属菌株(Rhizoctonia)，具体为茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)；根毛霉属(Rhizomucor)菌株，具体为米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)；根霉菌属(Rhizopus)菌株，具体为华根霉(Rhizopuschinensis)、米根霉(Rhizopus oryzae)、日本根霉(Rhizopus japonicus)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)和结节根霉(Rhizopus nodosus)；红冬孢酵母属(Rhodosporidium)菌株，具体为念珠状红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)；红酵母属(Rhodotorula)菌株，具体为粘红酵母(Rhodotorula glutinis)；掷孢酵母属(Sporobolomyces)菌株，具体为Sporobolomyces shibatanus；嗜热霉属(Thermomyces)菌株，具体为细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)；Thiarosporella菌株，具体为Thiarosporella phaseolina；木霉属(Trichoderma)菌株，具体为哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)；和/或轮枝孢菌属(Verticillium)菌株。

在一些实施方案中，微生物为霉菌。霉菌的实例包括但不限于：犁头霉属(Absida)菌株，具体为Absidia blakesleena和伞枝犁头霉(Absida corymbifera)；曲霉属(Aspergillus)菌株，具体为黑曲霉(Aspergillus niger)和黄曲霉(Asperillus flavus)；短梗霉属(Aureobasidium)菌株，具体为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)；地霉属(Geotricum)菌株，具体为潘氏地霉(Geotricum penicillatum)；腐质霉属(Humicola)菌株，具体为短孢腐质霉(Humicola brevispora)、短腐质霉变种(Humicola brevis var)、短腐质霉高温变种(Humicola brevis var.thermoidea)和特异腐质霉(Humicolainsolens)；拟青霉属(Paecilomyces)菌株；青霉属(penicillium)菌株，具体为圆弧青霉(Penicillium cyclopium)、皮落青霉(Penicillum crustosum)和扩展青霉(Penicilliumexpansum)；根毛霉属(Rhizomucor)菌株，具体为米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)；根霉菌属(Rhizopus)菌株，具体为华根霉(Rhizopus chinensis)、米根霉(Rhizopus oryzae)、日本根霉(Rhizopus japonicus)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)和结节根霉(Rhizopusnodosus)；嗜热霉属(Thermomyces)菌株，具体为细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)；和/或木霉属(Trichoderma)菌株，具体为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和里氏木霉(Trichoderma reesei)。

在一些实施方案中，微生物为根霉属或根毛霉属。根霉属或根毛霉属微生物的实例包括但不限于根毛霉属(Rhizomucor)菌株，具体为米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)；根霉菌属(Rhizopus)菌株，具体为华根霉(Rhizopus chinensis)、米根霉(Rhizopusoryzae)、日本根霉(Rhizopus japonicus)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)和结节根霉(Rhizopus nodosus)。

在一些实施方案中，第一前导肽部分、第二前导肽部分、成熟肽部分来自不同微生物物种来源的脂肪酶。例如，已有报道(参见Expression in Pichia pastoris andcharacterization of Rhizomucor miehei lipases containing a new propeptideregion.Wang Z,et al.J Gen Appl Microbiol.2016；62(1):25-30)，用华根霉脂肪酶和米根霉脂肪酶的前导肽替换米黑根毛霉脂肪酶的前导肽，米黑根毛霉脂肪酶成熟肽也能够进行分泌表达。因此，分类学相近(例如，同一属下)的微生物的前导肽和成熟肽按照本申请的教导组装时预期能够获得成功。

在一些实施方案中，第一和/或第二酶切位点独立地或共同地为kex2/ste13酶切位点。例如第一酶切位点为kex2/ste13酶切位点、第二酶切位点为kex2/ste13酶切位点、或者第一和第二酶切位点为kex2/ste13酶切位点。

在一些实施方案中，信号肽可以与前导肽和/或成熟肽为相同生物来源。例如，信号肽可以为黑根毛霉脂肪酶的信号肽、华根霉脂肪酶的信号肽、米根霉脂肪酶的信号肽。

在一些实施方案中，信号肽相对于前导肽和/或成熟肽可以为异源的。在一些实施方案中，信号肽可以为a-因子信号肽，也可以为invitrogen在PichiaPink^TMExpressionSystem操作手册中所述的信号肽，例如，信号肽可以是下述表1中列举的信号肽：

表1

在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID No：5或SEQ ID No：7所示的氨基酸序列。SEQ ID No：5或SEQ ID No：7所示的氨基酸序列可以具体拆解为以下单元：

信号肽部分：MRFPSIFTAVLFAASSALA

第一前导肽部分：VPIKRQSNSTVDSLPPLIPSRTSAPSSSPSTTDPEAPAMSRNGPLPSDVETKYGMALNATSYPDSVVQAM

第一酶切位点部分：KREAEAEA

第二前导肽部分：VPIKRQSNSTVDSLPPLIPSRTSAPSSSPSTTDPEAPAMSRNGPLPSDVETKYGMALNATSYPDSVVQAM

肽接头部分：GGGGSGGGGS

第二酶切位点部分：KRKREAEAEA

成熟肽部分：SIDGGIRAATSQEINELTYYTTLSANSYCRTVIPGATWDCIHCDATEDLKIIKTWSTLIYDTNAMVARGDSEKTIYIVFRGSSSIRNWIADLTFVPVSYPPVSGTKVHKGFLDSYGEVQNELVATVLDQFKQYPSYKVAVTGHSLGGATALLCALGLYQREEGLSSSNLFLYTQGQPRVGDPAFANYVVSTGIPYRRTVNERDIVPHLPPAAFGFLHAGEEYWITDNSPETVQVCTSDLETSDCSNSIVPFTSVLDHLSYFGINTGLCT

在一些实施方案中，融合蛋白包含与SEQ ID No：5或SEQ ID No：7所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与SEQ IDNo：5或SEQ ID No：7所示的氨基酸序列具有至少96％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与SEQ ID No：5或SEQ ID No：7所示的氨基酸序列具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与SEQ ID No：5或SEQ ID No：7所示的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，融合蛋白包含与SEQ ID No：5或SEQ ID No：7所示的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。

应当理解的是，本领域技术人员可根据本发明公开的第一前导肽部分、第二前导肽部分或成熟肽部分，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加1个或数个氨基酸(例如，1个、2个、3个、4个、5个或6个)，而获得融合蛋白的活性变体。因此，本发明所要求保护的融合蛋白还包括SEQ ID No：5或SEQ ID No：7所示的氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或数个氨基酸的活性变体。本发明的核酸分子也包括编码所述融合蛋白的活性变体的核酸分子。

在一些实施方案中，核酸分子包含与SEQ ID No：6或SEQ ID No：8所示的核酸分子具有至少95％序列同一性的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包含与SEQ ID No：6或SEQ ID No：8所示的核酸分子具有至少96％序列同一性的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包含与SEQ ID No：6或SEQ ID No：8所示的核酸分子具有至少97％序列同一性的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包含与SEQ ID No：6或SEQ ID No：8所示的核酸分子具有至少98％序列同一性的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包含与SEQ ID No：6或SEQ ID No：8所示的核酸分子具有至少99％序列同一性的核酸分子。

此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而，本发明所要求保护的核酸分子还包括由SEQ ID No：6或SEQ ID No：8所示的核酸分子经取代、缺失和/或增加1个或数个核苷酸(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个)所获得的核酸分子。

第三方面，本申请提供了含有第二方面所述的核酸分子的载体。所述载体可以是源自pAO815质粒的载体。

第四方面，本申请提供了含有第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以选自细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为毕赤酵母(pichia pastoris)，优选为毕赤酵母GS115。在一些具体实施方案中，第一前导肽部分和/或第二前导肽部分和/或信号肽以及成熟肽部分的编码序列根据毕赤酵母的偏好密码子进行优化。

第五方面，本申请提供了产生成熟肽的方法，其包括在允许融合蛋白表达的情况下，培养第四方面所述的宿主细胞，以及允许对所述融合蛋白进行切割，从而产生所述成熟肽。

实施例

提供以下实施例仅是对本申请的一些实施方案进行举例说明，没有任何限制的目的或性质。

I.实验材料

1.实验菌株和质粒

实施例中所涉及的菌株为毕赤酵母GS115(Invitrogen,货号C175-00)、大肠杆菌DH5a(TAKARA：Catalog#.D9057A)。

实施例中所涉及的质粒为pAO815质粒(Invitrogen，货号V180-20)、pAO-pro/RML质粒(参见实施例1)，pAOmu-2pro/RML质粒(参见实施例1)。

II.培养基和溶液

实施例中所涉及的培养基如下：

LB液体培养基：0.5％酵母提取物，1％胰化蛋白胨，1％NaCl，pH7.0。

LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂浓度1.5％。

YPD液体培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。

YPD固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂浓度2％。

MGYS固体培养基：1.34％酵母氮源碱(YNB)含硫酸铵不含氨基酸，1％甘油，1M山梨醇，4×10-5％D-生物素，2％琼脂。

BMMY-橄榄油筛选培养基：A组分：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源碱(YNB)含硫酸铵不含氨基酸，4×10-5％D-生物素，0.5％甲醇(灭菌后加入)，0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH6.6，2％琼脂。B组分：组分B橄榄油底物溶液：量取4％PVA溶液150ml，加橄榄油50ml，用高速匀浆机8000rpm乳化3min，暂停1min后再乳化3min，制备底物溶液。灭菌的100mlA组分与12mlB组分混合，加入1ml0.1％罗丹明B。

BMGY液体培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源碱(YNB)含硫酸铵不含氨基酸，1％甘油，4×10-5％D-生物素，0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH6.6。

BMMY液体培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源碱(YNB)含硫酸铵不含氨基酸，0.5％甲醇(灭菌后加入)，4×10-5％D-生物素(灭菌后加入)，0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH6.6。

改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)。

所使用的限制性内切酶为SacI、HindIII、EcoRI、AvrII(购自纽英伦生物技术(北京)有限公司)。所使用的PCR酶为TaKaRaTaq、HSDNAPolymerase(购自宝生物工程(大连)有限公司)。所使用的T4DNA连接酶购自富酶泰斯有限公司。基因合成由上海生工生物有限公司完成。

实施例1：不同米黑根毛霉脂肪酶(RML)的毕赤酵母载体的制备

在本实施例中，发明人共构建了四种RML的毕赤酵母载体用于表达四种融合蛋白：pro/RML、2pro/RML、RMLprolinker和RML2prolinker(示意图可参见图1，从左至右为N端至C段的方向)，具体示意性结构如下：

pro/RML：信号肽部分+前导肽部分+kex2/ste13酶切位点+成熟肽部分；

2pro/RML：信号肽部分+第一前导肽部分+kex2/ste13酶切位点+第二前导肽部分+kex2/ste13酶切位点+成熟肽部分；

RMLprolinker：信号肽部分+第一前导肽部分+GGGGSGGGGS柔性肽接头+kex2/ste13酶切位点+成熟肽部分；

RML2prolinker：信号肽部分+第一前导肽部分+kex2/ste13酶切位点+第二前导肽部分+GGGGSGGGGS柔性肽接头+kex2/ste13酶切位点+成熟肽部分。

下文中以融合蛋白的名称表示载体的名称。

四种载体以及转化菌株的制备过程如下：

1.pro/RML载体：

根据米黑根毛霉脂肪酶基因的氨基酸序列(GenBank：A02536.1)以及毕赤酵母密码子偏爱性，设计获得pro/RML的插入片段的DNA序列，并且在前导肽(其编码序列如SEQ IDNO：2第58-267位碱基所示)和成熟肽(其编码序列如SEQ ID NO：2第286-1092位碱基所示)之间增加了蛋白酶kex2和ste13的酶切位点(其编码序列如SEQ ID NO：2第268-285位碱基所示)。该DNA序列如SEQ ID NO：2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

将SEQ ID NO：2序列进行全基因合成并直接克隆至pAO815表达载体中，得到含有SEQ ID NO：2序列的毕赤酵母表达载体pAO-pro/RML。

将pAO-pro/RML用SalI线性化，利用LiAC法制备毕赤酵母GS115菌株的感受态细胞，再通过电转化将线性化的pAO-pro/RML片段转化GS115感受态细胞，转化物涂布于MGYS平板上，30℃培养3天，将大量平板上的单克隆挑于BMMY-橄榄油筛选平板上，从中挑取活力表现最好的阳性克隆，命名为pro/RML。

2.2pro/RML载体：

取米黑根毛霉脂肪酶基因的氨基酸序列(GenBank：A02536.1)的前导肽序列，根据毕赤酵母密码子偏爱性，设计得到两拷贝串联的米黑根毛霉脂肪酶基因前导肽序列的DNA序列2RMLpro，在两个前导肽的末端都增加了kex2/ste13酶切位点，如SEQ ID NO：4所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

将SEQ ID NO：4序列进行全基因合成，得到pUC57-2pro载体。

将pAO-pro/RML用HindIII和EcoRI将RML的成熟肽序列切下，与用HindIII和EcoRI酶切的pmAO-PLC载体(构建方法详见CN201510946696.1实施例1中描述。)连接，得到pAOmu-RML载体。用AvrII和HindIII将pUC57-2pro载体上的两拷贝前导肽2pro序列切下，与用AvrII和HindIII酶切的pmAO-RML载体连接，得到pmAO-2pro/RML载体。

将pAOmu-2pro/RML用SalI线性化，利用LiAC法制备毕赤酵母GS115菌株的感受态细胞，再通过电转化将线性化的pmAO-2pro/RML片段转化GS115感受态细胞，转化物涂布于MGYS平板上，30℃培养3天，将大量平板上的单克隆挑于BMMY-橄榄油筛选平板上，从中挑取活力表现最好的阳性克隆，命名为2pro/RML。

3.RMLprolinker载体：

设计引物如下：

RMLproL-1：GCGCCTAGGCGAAACGATGAGATTTC

RMLproL-2：ACCACCTCCAGAACCTCCACCACCCATAGCTTGAA CGACAGAATC

RMLproL-3：TGGAGGTTCTGGAGGTGGTGGATCTAAAAGAGAG GCTGAAGCTTCC

RMLproL-4：CCGGAATTCTTAAGTACACAAACC

以发明人之前构建的pAO-pro/RML为模板，使用重叠PCR方法在RML的前导肽部分和成熟肽部分之间增加柔性肽接头。在pAO-pro/RML上使用限制性内切酶AvrII和EcoRI将RML片段切除，与使用限制性内切酶AvrII和EcoRI进行酶切的重叠PCR产物进行连接，得到pAO-RMLprolinker载体，其中插入片段序列如SEQ ID NO：6所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。将pAO-RMLprolinker用限制性内切酶SalI线性化，利用LiAC法制备毕赤酵母GS115菌株的感受态细胞，再通过电转化将线性化的pAO-RMLprolinker线性化片段转化GS115感受态细胞，将转化产物涂布于MGYS平板上，30℃培养3天，将大量平板上的单克隆挑于BMMY-橄榄油筛选平板上，从中挑取活力表现最好的阳性克隆。将菌株命名为RMLprolinker。

4.RML2prolinker载体：

设计引物如下：

2pro-1：GACTAAGCTTCCATCGACGGAGGTA

2pro-2：ACCACCTCCAGAACCTCCACCACCCATGGCCTGTACTA CTGAATC

2pro-3：TGGAGGTTCTGGAGGTGGTGGATCTAAACGTAAGAGGG AGGCTGAAGCCGAA

2pro-4：CCGGAATTCTTAAGTACACAAACCGG

以发明人之前构建的pAOmu-2pro/RML为模板，使用重叠PCR方法，在RML的前导肽部分和成熟肽部分之间增加柔性肽接头。在pAOmu-2pro/RML上使用限制性内切酶HindII和EcoRI将RML序列切除，与使用限制性内切酶HindII和EcoRI进行酶切的重叠PCR产物进行连接，获得pAOmu-2proRMLprolinker载体，其中插入片段序列如SEQ ID NO：8所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。将pAOmu-2proRMLprolinker用限制性内切酶BglII线性化，利用LiAC法制备毕赤酵母GS115菌株的感受态细胞，再通过电转化将线性化的pAOmu-2proRMLprolinker线性化片段转化GS115感受态细胞，将转化物涂布于MGYS平板上，30℃培养3天，将大量平板上的单克隆挑于BMMY-橄榄油筛选平板上，从中挑取活力表现最好的阳性克隆，将菌株命名为RML2prolinker。

实施例2：四种载体的RML成熟肽产生能力测试

将实施例1所获得的pro/RML(作为对照)、2pro/RML(作为对照)、RMLprolinker和RML2prolinker菌株在YPD液体培养基中进行活化，平行接种于3瓶BMGY液体培养基中，过夜培养，使其OD600保持在2-6之间，转接至BMMY液体培养基中，初始OD600为4，在初始时，用2％的甲醇进行诱导，在24h和32h后，各补加1％的甲醇，在48h和56h后，各补加1％的甲醇，于24h、48h、72h取样，获得四种菌株的发酵上清液，使用pNPP法测定脂肪酶活力。

脂肪酶活力测定方法如下：

A.脂肪酶酶活单位的定义

在温度为40℃，pH值8.0的条件下，样品水解底物pNPP，将每分钟释放出1μmol对硝基苯酚(pNP)所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。

B.测定原理

脂肪酶在一定温度和pH条件下，水解底物对pNPP，生成黄颜色的对硝基苯酚。在一定的浓度范围内，生成对硝基苯酚的量和反应液的410nm处吸光值，呈线性关系。据此可以通过测定反应液的410nm吸光值来计算脂肪酶活力。

C.脂肪酶活力测定标准曲线的绘制

称取0.1391g对硝基苯酚，溶于50ml异丙醇中配成20mmol/L的母液，取10ml母液用异丙醇准确定容至100ml，即为2.0mmol/L的工作液。各种试剂的添加量参见表1。制作标准曲线时的反应体积和反应条件与试验中测定样品酶活的条件相一致。

表1：标准曲线的绘制

编号	1	2	3	4	5	6	7	8
									2.0mmol/L pNP(μl)	0	7.5	15	30	60	90	120	180
异丙醇(μl)	250	242.5	235	220	190	160	130	70
									底物缓冲液(ml)	2.25	2.25	2.25	2.25	2.25	2.25	2.25	2.25
pNP总量(μmol)	0	0.015	0.03	0.06	0.12	0.18	0.24	0.36

将表1中的2.0mmol/L的pNP工作液与异丙醇、底物缓冲液混合后，使得pNP总量分别为0、0.015、0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.36μmol，分别将它们在37℃水浴锅内处理15分钟，并分别加入95％乙醇2ml。所绘制的pNP标准曲线如图2所示。

D.脂肪酶活力测定

称取pNPP溶于异丙醇中配成0.03％的溶液，取1ml的pNPP溶液加入9ml的0.05mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 8.0)(其中，含有0.23％的脱氧胆酸钠、0.11％的阿拉伯树胶粉)中混匀，即为反应液，在上述2.4ml的反应液中分别加入100μl稀释的RMLprolinker和RML2prolinker的72小时发酵上清液，反应条件同上。

如图3所示，RMLprolinker的发酵上清液中RML的酶活力为72U/ml，而对照菌株pro/RML的发酵上清液中RML的酶活力为31U/ml。因此，在具有一个拷贝的前导肽的RML表达构建体中，在前导肽和成熟肽之间增加肽接头，使得最终获得的发酵上清液中RML的酶活力提高约100％(从31U/ml提高至72U/ml)。进一步地，如图3所示，RML2prolinker的发酵上清液中RML的酶活力为133U/ml。由此说明，在RMLprolinker的基础上，增加第二个拷贝的前导肽，能够使获得的酶活力提高约400％(从31U/ml提高至133U/ml)。

图4所示为pro/RML、2pro/RML、RMLprolinker和RML2prolinker的发酵上清液在浓缩2倍后的SDS-PAGE电泳图，电泳图显示出RML成熟肽条带明显地增加了，而前导肽未切除的proRML条带减少了，这说明前导肽的切割效率增加。

本说明书中引用的所有出版物和专利文献引入本文作为参考，如同每个出版物或专利被分别明确指明引入本文作为参考。在不偏离本申请公开的真实思想和范围的情况下，可对本申请公开的各实施方案进行多种改变和用等同物替换。除非上下文中另有说明，否则本公开的实施方案的任何特征、步骤或实施方案都可以与任何其他特征、步骤或实施方案组合使用。

序列表

<110> 丰益（上海）生物技术研发中心有限公司

<120> 提高分泌型蛋白的成熟肽产生的方法

<130> 17C12706CN

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 364

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser

20 25 30

Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro

35 40 45

Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu

50 55 60

Pro Ser Asp Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Pro Asp Ser Val Val Gln Ala Met Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ser

85 90 95

Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu

100 105 110

Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val Ile

115 120 125

Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu Asp Leu

130 135 140

Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met

145 150 155 160

Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly

165 170 175

Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val

180 185 190

Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe Leu Asp

195 200 205

Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu Asp Gln

210 215 220

Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu

225 230 235 240

Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu

245 250 255

Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro

260 265 270

Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Val Ser Thr Gly Ile

275 280 285

Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro

290 295 300

Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr

305 310 315 320

Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Thr

325 330 335

Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His

340 345 350

Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys Thr

355 360

<210> 2

<211> 1095

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgtt 60

ccaatcaaga gacaatctaa ttccactgtc gattctttgc ctccattgat tccttctaga 120

actagtgcac cttcatcctc tccatctaca actgaccctg aggctccagc tatgtcaaga 180

aatggtccac ttccttctga tgttgagacc aagtacggaa tggccctgaa tgctacttct 240

tatccagatt ctgtcgttca agctatgaaa agagaggctg aagcttccat cgacggaggt 300

attagagccg ctacttctca ggaaatcaac gaacttactt actatacaac tttgtcagct 360

aattcttact gtagaactgt tattcctggt gctacttggg attgcataca ttgtgacgcc 420

actgaagatt taaagataat taaaacctgg tctactttga tttacgacac taacgctatg 480

gttgctagag gagattccga gaagactatt tatatcgtgt ttagaggttc ttcatctatt 540

cgtaattgga tcgctgattt gacattcgtt ccagtctctt accctccagt ttctggtact 600

aaggttcaca aaggatttct tgattcttat ggtgaagttc aaaacgagtt ggttgctact 660

gtcttggatc agtttaaaca atacccatct tataaggttg ctgtcactgg tcactctttg 720

ggaggtgcta ctgccttgct gtgtgcttta ggtttatacc agagagagga aggattgtct 780

tcaagtaacc tattcttgta cactcaaggt cagcctagag ttggagatcc agcatttgct 840

aattatgtgg tttctactgg tattccatat agacgtactg ttaacgaaag agacatagta 900

ccacacttgc ctccagctgc cttcggattt ctgcatgccg gtgaagagta ctggatcaca 960

gataattctc ctgaaaccgt tcaagtgtgt acatctgatt tagagacttc cgactgctct 1020

aacagtattg ttccatttac ttcagttctt gatcatttgt cttattttgg aattaacacc 1080

ggtttgtgta cttaa 1095

<210> 3

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser

20 25 30

Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro

35 40 45

Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu

50 55 60

Pro Ser Asp Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Pro Asp Ser Val Val Gln Ala Met Lys Arg Glu Ala Glu Ala Glu

85 90 95

Ala Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro

100 105 110

Pro Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr

115 120 125

Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser

130 135 140

Asp Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser Tyr Pro

145 150 155 160

Asp Ser Val Val Gln Ala Met Lys Arg Glu Ala Glu Ala Glu Ala Ser

165 170 175

Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu

180 185 190

Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val Ile

195 200 205

Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu Asp Leu

210 215 220

Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met

225 230 235 240

Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly

245 250 255

Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val

260 265 270

Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe Leu Asp

275 280 285

Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu Asp Gln

290 295 300

Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu

305 310 315 320

Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu

325 330 335

Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro

340 345 350

Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Val Ser Thr Gly Ile

355 360 365

Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro

370 375 380

Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr

385 390 395 400

Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Thr

405 410 415

Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His

420 425 430

Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys Thr

435 440

<210> 4

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagatttc cttccatctt cacggctgtg ctatttgcag catcctccgc acttgcagtg 60

cccataaaga gacaatccaa ctccacagtc gattcccttc caccattaat tccttccagg 120

acatcagcac cttcttcttc tccttctacc accgaccctg aagcacctgc tatgtcaaga 180

aacggacctt tgccatcaga tgttgaaacg aagtacggta tggctttaaa cgctacctct 240

tacccagaca gtgtcgttca ggctatgaaa cgagaggctg aggctgaagc tgttccaatc 300

aaacgtcaat ctaattctac tgttgactca ctgccacccc tgattccctc tcgtacaagt 360

gctccatcta gtagtccttc tactactgat ccagaggccc ctgccatgtc aagaaatggg 420

ccattgccaa gtgatgttga aactaaatat ggcatggcct tgaatgccac ttcatatccc 480

gattcagtag tacaggccat gaagagggag gctgaagccg aagcttccat cgacggaggt 540

attagagccg ctacttctca ggaaatcaac gaacttactt actatacaac tttgtcagct 600

aattcttact gtagaactgt tattcctggt gctacttggg attgcataca ttgtgacgcc 660

actgaagatt taaagataat taaaacctgg tctactttga tttacgacac taacgctatg 720

gttgctagag gagattccga gaagactatt tatatcgtgt ttagaggttc ttcatctatt 780

cgtaattgga tcgctgattt gacattcgtt ccagtctctt accctccagt ttctggtact 840

aaggttcaca aaggatttct tgattcttat ggtgaagttc aaaacgagtt ggttgctact 900

gtcttggatc agtttaaaca atacccatct tataaggttg ctgtcactgg tcactctttg 960

ggaggtgcta ctgccttgct gtgtgcttta ggtttatacc agagagagga aggattgtct 1020

tcaagtaacc tattcttgta cactcaaggt cagcctagag ttggagatcc agcatttgct 1080

aattatgtgg tttctactgg tattccatat agacgtactg ttaacgaaag agacatagta 1140

ccacacttgc ctccagctgc cttcggattt ctgcatgccg gtgaagagta ctggatcaca 1200

gataattctc ctgaaaccgt tcaagtgtgt acatctgatt tagagacttc cgactgctct 1260

aacagtattg ttccatttac ttcagttctt gatcatttgt cttattttgg aattaacacc 1320

ggtttgtgta cttaa 1335

<210> 5

<211> 374

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser

20 25 30

Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro

35 40 45

Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu

50 55 60

Pro Ser Asp Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Pro Asp Ser Val Val Gln Ala Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

85 90 95

Gly Gly Ser Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg

100 105 110

Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu

115 120 125

Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp

130 135 140

Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp

145 150 155 160

Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met Val Ala Arg Gly Asp Ser

165 170 175

Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn

180 185 190

Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser

195 200 205

Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln

210 215 220

Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser

225 230 235 240

Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu

245 250 255

Leu Cys Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser

260 265 270

Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala

275 280 285

Phe Ala Asn Tyr Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val

290 295 300

Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe

305 310 315 320

Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr

325 330 335

Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser

340 345 350

Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile

355 360 365

Asn Thr Gly Leu Cys Thr

370

<210> 6

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgtt 60

ccaatcaaga gacaatctaa ttccactgtc gattctttgc ctccattgat tccttctaga 120

actagtgcac cttcatcctc tccatctaca actgaccctg aggctccagc tatgtcaaga 180

aatggtccac ttccttctga tgttgagacc aagtacggaa tggccctgaa tgctacttct 240

tatccagatt ctgtcgttca agctatgggt ggtggaggtt ctggaggtgg tggatctaaa 300

agagaggctg aagcttccat cgacggaggt attagagccg ctacttctca ggaaatcaac 360

gaacttactt actatacaac tttgtcagct aattcttact gtagaactgt tattcctggt 420

gctacttggg attgcataca ttgtgacgcc actgaagatt taaagataat taaaacctgg 480

tctactttga tttacgacac taacgctatg gttgctagag gagattccga gaagactatt 540

tatatcgtgt ttagaggttc ttcatctatt cgtaattgga tcgctgattt gacattcgtt 600

ccagtctctt accctccagt ttctggtact aaggttcaca aaggatttct tgattcttat 660

ggtgaagttc aaaacgagtt ggttgctact gtcttggatc agtttaaaca atacccatct 720

tataaggttg ctgtcactgg tcactctttg ggaggtgcta ctgccttgct gtgtgcttta 780

ggtttatacc agagagagga aggattgtct tcaagtaacc tattcttgta cactcaaggt 840

cagcctagag ttggagatcc agcatttgct aattatgtgg tttctactgg tattccatat 900

agacgtactg ttaacgaaag agacatagta ccacacttgc ctccagctgc cttcggattt 960

ctgcatgccg gtgaagagta ctggatcaca gataattctc ctgaaaccgt tcaagtgtgt 1020

acatctgatt tagagacttc cgactgctct aacagtattg ttccatttac ttcagttctt 1080

gatcatttgt cttattttgg aattaacacc ggtttgtgta cttaa 1125

<210> 7

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser

20 25 30

Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro

35 40 45

Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu

50 55 60

Pro Ser Asp Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Pro Asp Ser Val Val Gln Ala Met Lys Arg Glu Ala Glu Ala Glu

85 90 95

Ala Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro

100 105 110

Pro Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr

115 120 125

Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser

130 135 140

Asp Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser Tyr Pro

145 150 155 160

Asp Ser Val Val Gln Ala Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

165 170 175

Ser Lys Arg Lys Arg Glu Ala Glu Ala Glu Ala Ser Ile Asp Gly Gly

180 185 190

Ile Arg Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr

195 200 205

Thr Leu Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr

210 215 220

Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys

225 230 235 240

Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met Val Ala Arg Gly

245 250 255

Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile

260 265 270

Arg Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Ser Tyr Pro Pro

275 280 285

Val Ser Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu

290 295 300

Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu Asp Gln Phe Lys Gln Tyr

305 310 315 320

Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Thr

325 330 335

Ala Leu Leu Cys Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser

340 345 350

Ser Ser Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp

355 360 365

Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg

370 375 380

Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro Ala Ala Phe

385 390 395 400

Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser Pro

405 410 415

Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Thr Ser Asp Cys Ser

420 425 430

Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe

435 440 445

Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys Thr

450 455

<210> 8

<211> 1371

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgagatttc cttccatctt cacggctgtg ctatttgcag catcctccgc acttgcagtg 60

cccataaaga gacaatccaa ctccacagtc gattcccttc caccattaat tccttccagg 120

acatcagcac cttcttcttc tccttctacc accgaccctg aagcacctgc tatgtcaaga 180

aacggacctt tgccatcaga tgttgaaacg aagtacggta tggctttaaa cgctacctct 240

tacccagaca gtgtcgttca ggctatgaaa cgagaggctg aggctgaagc tgttccaatc 300

aaacgtcaat ctaattctac tgttgactca ctgccacccc tgattccctc tcgtacaagt 360

gctccatcta gtagtccttc tactactgat ccagaggccc ctgccatgtc aagaaatggg 420

ccattgccaa gtgatgttga aactaaatat ggcatggcct tgaatgccac ttcatatccc 480

gattcagtag tacaggccat gggtggtgga ggttctggag gtggtggatc taaacgtaag 540

agggaggctg aagccgaagc ttccatcgac ggaggtatta gagccgctac ttctcaggaa 600

atcaacgaac ttacttacta tacaactttg tcagctaatt cttactgtag aactgttatt 660

cctggtgcta cttgggattg catacattgt gacgccactg aagatttaaa gataattaaa 720

acctggtcta ctttgattta cgacactaac gctatggttg ctagaggaga ttccgagaag 780

actatttata tcgtgtttag aggttcttca tctattcgta attggatcgc tgatttgaca 840

ttcgttccag tctcttaccc tccagtttct ggtactaagg ttcacaaagg atttcttgat 900

tcttatggtg aagttcaaaa cgagttggtt gctactgtct tggatcagtt taaacaatac 960

ccatcttata aggttgctgt cactggtcac tctttgggag gtgctactgc cttgctgtgt 1020

gctttaggtt tataccagag agaggaagga ttgtcttcaa gtaacctatt cttgtacact 1080

caaggtcagc ctagagttgg agatccagca tttgctaatt atgtggtttc tactggtatt 1140

ccatatagac gtactgttaa cgaaagagac atagtaccac acttgcctcc agctgccttc 1200

ggatttctgc atgccggtga agagtactgg atcacagata attctcctga aaccgttcaa 1260

gtgtgtacat ctgatttaga gacttccgac tgctctaaca gtattgttcc atttacttca 1320

gttcttgatc atttgtctta ttttggaatt aacaccggtt tgtgtactta a 1371

Claims

1.融合蛋白，其包含第一前导肽部分、柔性肽接头和成熟肽部分，任选地，所述融合蛋白还包含位于第一前导肽部分的N端侧的信号肽部分。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中柔性肽接头和成熟肽部分之间包括第一酶切位点；和/或，其中所述融合蛋白进一步包含第二前导肽部分，所述第二前导肽部分位于所述第一前导肽部分和所述成熟肽部分之间，所述第二前导肽部分优选位于所述第一前导肽部分和所述柔性肽接头之间，第一前导肽部分和第二前导肽部分之间优选包括第二酶切位点，其中所述第一前导肽部分和第二前导肽部分可以相同或不同；和/或，所述柔性肽接头包含氨基酸序列(GS)_a(GGS)_b(GGGS)_c(GGGGS)_d，其中a、b、c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1；例如，柔性肽接头包含氨基酸序列GGGSGGGS、GGGSGGGS、GGSGGSGGS、GSGSGSGSGS、GSGGSGS、GGSGGGS、GGGSGGGGS、GSGGSGGGS、GGGGSGGS、GSGGGSGGGGSGGGGS、GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS、GSGGGGSGGGGSGGGGS、GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS、GGSGGSGGSGGS或GGGGSGGGSGS；优选地，柔性肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)₂。

3.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中信号肽部分、第一前导肽部分、第二前导肽部分、成熟肽部分独立地来自微生物来源脂肪酶，所述微生物例如为细菌、真菌或酵母，优选为真菌，更优选为霉菌，最优选为米黑根毛霉菌、米根霉菌或华根霉菌；优选的，所述第一前导肽部分、第二前导肽部分、成熟肽部分来自同一微生物物种来源的脂肪酶。

4.如权利要求2-3中任一项所述的融合蛋白，其中第一和/或第二酶切位点独立地或共同地为kex2/ste13酶切位点。

5.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中信号肽部分和/或第一前导肽部分和/或第二前导肽部分以及成熟肽部分来自米黑根毛霉脂肪酶，第一和第二酶切位点均为kex2/ste13酶切位点，柔性肽接头为GGGGSGGGGS；和/或，所述信号肽部分选自黑根毛霉脂肪酶的信号肽、华根霉脂肪酶的信号肽、米根霉脂肪酶的信号肽、a-因子信号肽、α-淀粉酶信号序列、葡糖淀粉酶信号序列、血清白蛋白信号序列、菊粉酶导肽、转化酶信号序列、杀手蛋白质信号序列或溶菌酶信号序列。

6.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID No：5或SEQID No：7所示的氨基酸序列，或包含SEQ ID No：5或SEQ ID No：7所示的氨基酸序列经取代、替换和/或增加1个或2个或3个氨基酸的活性变体。

7.编码上述权利要求中任一项所述的融合蛋白的核酸分子；优选的，其包含SEQ IDNo：6或SEQ ID No：8所示的序列。

8.含有权利要求7所述的核酸分子的载体。

9.含有权利要求7所述的核酸分子或权利要求8所述的载体的宿主细胞；优选的，所述宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞，优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母(pichia pastoris)，进一步优选地，第一前导肽部分和/或第二前导肽部分和/或信号肽部分以及成熟肽部分的编码序列根据毕赤酵母的偏好密码子进行优化。

10.产生成熟肽的方法，其包括在允许融合蛋白表达的情况下，培养权利要求9所述的宿主细胞，以及允许对所述融合蛋白进行切割，从而产生所述成熟肽。