CN114807074B - 一种黄曲霉毒素分解酶及其编码基因、重组载体、重组菌及应用 - Google Patents

一种黄曲霉毒素分解酶及其编码基因、重组载体、重组菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种黄曲霉毒素分解酶及其编码基因、重组载体、重组菌及应用，属于酶工程技术领域。本发明提供的黄曲霉毒素分解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的黄曲霉毒素分解酶能够在真核表达系统中异源高表达，易于后期的纯化和酶制剂的制备，适合工业化生产。另外，本发明提供的黄曲霉毒素分解酶能够高效的降解黄曲霉毒素B1且特异性强，具有对饲料和环境没有污染的优势。

Description

一种黄曲霉毒素分解酶及其编码基因、重组载体、重组菌及 应用
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，尤其涉及一种黄曲霉毒素分解酶及其编码基因、重组载体、重组菌及应用。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是黄曲霉、寄生曲霉产毒株的有毒次级代谢产物，也是已知化学物质中致癌性最强的一类毒素，分为黄曲霉毒素B族和黄曲霉毒素G族，目前已经发现大约20种。
黄曲霉毒素广泛存在于饲料中，其中黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)含量占比最大，AFB1是已知化学物质中致癌性最强的一种，广泛存在于饲料中。AFB1超标的饲料可使动物患病、死亡，甚至通过动物让人致病。黄曲霉毒素结构稳定，在光、热和酸性条件下不易降解，传统的物理化学方法去毒效率不高、饲料营养损失巨大、难以规模化生产以及不能彻底去除AFT的毒性等缺点。与传统的物理化学方法相比，生物降解具有条件相对温和、成本低廉及不会对饲料营养造成破坏等优点，而黄曲霉毒素分解酶(ADTZ)降解黄曲霉毒素具有效率高、特异性强以及对饲料和环境没有污染的优势，代表了生物解毒的新方向，即生物降解是一种高效去除黄曲霉毒素的理想方法。但是现有的用于降解黄曲霉毒素的酶的降解效率不高，或不适合工业应用，目前还没有一种黄曲霉毒素降解率高，且适合工业生产的黄曲霉毒素分解酶。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种黄曲霉毒素降解率高且适合工业生产的黄曲霉毒素分解酶，能够高效的降解黄曲霉毒素B1且特异性强，具有对饲料和环境没有污染的优势。
另外，本发明的目的还在于提供一种编码上述黄曲霉毒素分解酶的基因、携带上述基因的重组载体、表达上述黄曲霉毒素分解酶的重组菌及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种黄曲霉毒素分解酶，所述黄曲霉毒素分解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种编码上述黄曲霉毒素分解酶的基因。
优选的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种携带上述基因的重组载体。
优选的，所述载体包括毕赤酵母表达质粒pPICZαB。
本发明还提供了一种表达上述黄曲霉毒素分解酶的重组菌。
优选的，所述菌包括毕赤酵母SMD1163。
本发明还提供了一种上述黄曲霉毒素分解酶或上述基因或上述重组载体或上述重组菌在降解黄曲霉毒素中的应用。
优选的，所述应用包括降解饲料中的黄曲霉毒素。
本发明还提供了一种包含上述黄曲霉毒素分解酶的酶制剂。
本发明的有益效果：
本发明提供的黄曲霉毒素分解酶能够在真核表达系统中异源高表达，易于后期的纯化和酶制剂的制备，适合工业化生产。另外，本发明提供的黄曲霉毒素分解酶能够高效的降解黄曲霉毒素B1且特异性强，具有对饲料和环境没有污染的优势。
附图说明
图1为质粒pPICZαB的图谱；
图2为重组质粒pPICZαB-AFB1的图谱；
图3为重组质粒的双酶切验证电泳图谱，其中M为KB ladder DNA Marker(从上到下10000、8000、6000、5000、4000、3000、2000、1000和500bp)，1为质粒pPICZαB电泳图谱，2为pPICZαB-AFB1被限制性内切酶PstI和BamH I双酶切的电泳图谱(3122和2446bp)；
图4为黄曲霉毒素B1分解酶的活性。
具体实施方式
本发明提供了一种黄曲霉毒素分解酶，所述黄曲霉毒素分解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明中，所述黄曲霉毒素分解酶又称为黄曲霉毒素B1分解酶，能够高效的降解黄曲霉毒素B1且特异性强。本发明所述黄曲霉毒素分解酶(黄曲霉毒素B1分解酶，Aflatoxin-detoxinfizyme，ADTZ)与本领域已知黄曲霉毒素分解酶(氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)相比，对AFB1的降解能力显著增强。
本发明还提供了一种编码上述黄曲霉毒素分解酶的基因，优选的在编码基因5’端引入限制性酶切位点Pst I，3’端引入Sal I酶切位点，所述基因的核苷酸序列优选的如SEQID NO.2所示。
本发明还提供了一种携带上述基因的重组载体。本发明对于载体的具体类型没有特殊限定，可为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒，在本发明中，所述载体优选的为毕赤酵母表达质粒pPICZαB(图1)。本发明对于将基因连接至载体中获得重组载体的具体方式没有特殊限定，获得的重组质粒为pPICZαB-AFB1，如图2所示。
本发明还提供了一种表达上述黄曲霉毒素分解酶的重组菌，所述菌的种类优选为毕赤酵母SMD1163，毕赤酵母SMD1163基因组中的Pep4和prb1基因发生突变，造成蛋白水解酶A和蛋白水解酶B活性的丧失，可以保护表达产物免受降解，促进表达量的提高。
本发明还提供了一种上述黄曲霉毒素分解酶或上述基因或上述重组载体或上述重组菌在降解黄曲霉毒素中的应用，所述应用优选的包括降解饲料中的黄曲霉毒素。
本发明还提供了一种包含上述黄曲霉毒素分解酶的酶制剂。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的黄曲霉毒素分解酶的基因(在编码基因5’端引入限制性酶切位点Pst I，3’端引入SalI酶切位点)，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因连接到毕赤酵母表达质粒pPICZαB(图1)的相应位点上，获得重组质粒pPICZαB-AFB1(如图2所示)。获得重组质粒后，进行双酶切验证，结果如图3所示。限制性内切酶Sac I线性化连接黄曲霉毒素分解酶编码基因的pPICZαB-AFB1，进行电转化进入毕赤酵母SMD1163，通过含有博莱霉素(ZeocinTM)的YPD平板来筛选阳性克隆子，得到表达黄曲霉毒素分解酶基因的重组毕赤酵母，记为实验组重组毕赤酵母。
以本领域已知黄曲霉毒素分解酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)作为对照，重复上述步骤，得到表达本领域已知黄曲霉毒素分解酶基因的重组毕赤酵母，记为对照组重组毕赤酵母。
实施例2
将实施例1获得的实验组重组毕赤酵母和对照组重组毕赤酵母分别进行摇瓶发酵诱导表达，具体为：
将筛选到的重组毕赤酵母转化子单菌落接种于含100μL/mL博莱霉素的5mL YPD液体培养基的管中，在30℃180r/min的条件下培养到OD600值为2时，取1mL菌液接种于100mLBMGY培养液的1L的三角瓶中在30℃250r/min的条件下培养至菌液OD600＝2.0-6.0，时间约为15-24h。无菌条件下，将发酵液转入灭菌的50mL离心管，3600r/min离心5min。去上清，用BMMY培养基将菌体重悬并稀释至OD600＝1.0。将稀释后的菌液分别加入到1L的摇瓶中，每个摇瓶150mL菌液(绝不能超过200mL)。摇瓶在30℃、250rpm/min条件下诱导重组酵母表达黄曲霉毒素分解酶，每24h加入一次5％的甲醇，使甲醇的终浓度不超过1％。连续诱导表达50h。发酵液以12000rpm/min离心10min，取上清，pH值调到7.0，蛋白浓度调到400mg/L，即得实验组粗酶液和对照组粗酶液(用于后续实验)。
BMGY培养基配制(1000mL)：20g蛋白胨，10g酵母提取物，加水至700mL；115℃灭菌30min；然后在无菌条件下分别加入10×YNB 100mL，10×磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mL，10×甘油100mL。
BMMY培养基配制(1000mL)：20g蛋白胨，10g酵母提取物，加水至700mL；115℃灭菌30min；然后在无菌条件下分别加入10×YNB 100mL，10×磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mL，10×甲醇100mL。
实施例3
对实施例2所得的粗酶液进行黄曲霉毒素分解酶的活性测定，具体为：
将实验组粗酶液(改良ADTZ)(995μL)和对照组粗酶液(原始ADTZ)(995μL)分别与黄曲霉毒素B1工作液5μL(甲醇黄曲霉毒素B1溶液浓度为20μg/mL)混合于灭菌的2mL离心管中，使黄曲霉毒素B1终浓度为100ng/mL，再分别放置28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃水浴锅中保温1h，然后沸水煮10min，最后用黄曲霉毒素B1酶联免疫(ELISA)检测试剂盒测定黄曲霉毒素B1剩余量。以实验组粗酶液煮沸10min作为空白对照组。
根据酶活定义：在温度为38℃(28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、40℃)，pH7.0的条件下，反应1h降解1ng黄曲霉毒素B1的酶量(粗酶液mL)为一个酶活单位U。
结果如图4所示，本发明黄曲霉毒素分解酶的酶活比本领域已有黄曲霉毒素分解酶的活性高，在38℃时活性最高，达到28.5U/mL，比本领域已有黄曲霉毒素分解酶的20.2U/mL高了41％。
实施例4
验证实施例2所得的粗酶液对饲料中AFB1降解能力，具体为：
以玉米粉作为饲料进行试验，称取1kg玉米粉，加入0.5mg AFB1，混均后得到AFB1含量为500ng/g备用试验饲料。称取含AFB1为500ng/g的备用试验饲料20g，加入20mL实验组粗酶液(对照组加20mL对照组粗酶液)，放置密闭的塑料袋中，在温度38℃下静置，每隔2h混匀一次。12h取样2g置于50mL三角瓶中，加入10mL甲醇振荡提取AFB11h，经0.22μm无机滤膜过滤后，用AFB1酶联免疫(ELISA)检测试剂盒测定AFB1剩余量。结果表明，实验组酶解液12h的生物降解，20g试验饲料玉米粉中AFB1由初始含量10μg降解到只剩3.274μg，降解率达67.3％；对照组酶解液20g试验饲料玉米粉中AFB1由初始含量为10μg降解到只剩5.152μg，降解率达48.5％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江西省科学院生物资源研究所
<120> 一种黄曲霉毒素分解酶及其编码基因、重组载体、重组菌及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 697
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Ala Thr Thr Thr Val His Gly Glu Arg Phe Leu Ala Asp Lys Ala
1 5 10 15
Ala Pro Leu Cys Gly Leu Asp Val Gly Lys Ser Phe Asp Gln Leu Ser
20 25 30
Pro Lys Glu Lys Leu Tyr Thr His Tyr Leu Thr Glu Ala Ser Trp Ala
35 40 45
Gly Ala Arg Ile Ile Gln Ala Gln Trp Thr Ala Gln Ala Ala Asp Leu
50 55 60
Tyr Asp Leu Leu Ile Leu Thr Phe Ser Ala Asn Gly Lys Leu Ala Asp
65 70 75 80
Leu Asp Ala Leu Lys Thr Ser Ser Gly Leu Ser Glu Asp Asp Trp Glu
85 90 95
Ala Leu Ile Gln Tyr Thr Val Gln Val Leu Ser Asn Leu Val Asn Tyr
100 105 110
Lys Arg Trp Gly Phe Thr Lys Ile Ile Pro Arg Val Asp Ala Asp Lys
115 120 125
Phe Glu Ala Val Val Lys Ala Ser Ser Asn Ala Asp Gln Ala Ser Ala
130 135 140
Leu Phe Thr Lys Leu Lys Gln His Ile Tyr Ala Leu Ser Pro Glu Ala
145 150 155 160
Ala Leu Phe Ile Gly Lys Arg Lys Asp Gly His Val Ser Asn Tyr Tyr
165 170 175
Leu Gly Glu Ala Val Gly Asp Ala Glu Val Asp Ala Ile Gln Ser Ala
180 185 190
Ala Glu Arg Leu Gly Val Asp Ile Leu Asn Thr Arg Val Arg Lys Asn
195 200 205
Gly Thr Gly Asp Tyr Thr Leu Leu Val Ala Ser Ala Lys Thr Ser Pro
210 215 220
Pro Ala Ala His Asp Phe Gln Ile Asp Thr Lys Pro Ala Lys Leu Thr
225 230 235 240
Ile Gly Tyr Gly Asp Tyr Ala Ser Ser Leu Thr Lys Val Val Ala Ala
245 250 255
Leu Gln Glu Ala Lys Lys Tyr Ala Ala Asn Asp His Gln Ser Ala Leu
260 265 270
Ile Glu Gly Tyr Leu Lys Ser Phe Asp Ser Gly Ser Ile Pro Glu His
275 280 285
Lys Ala Ala Ser Thr Glu Trp Val Lys Asp Ile Gly Pro Val Val Glu
290 295 300
Ser Tyr Ile Gly Phe Val Arg Thr Tyr Val Asp Pro Tyr Gly Gly Arg
305 310 315 320
Ala Glu His Glu Val Gly Phe Thr Ala Ile Val Asn Lys Gln Leu Ser
325 330 335
Ala Lys Tyr Glu Thr Leu Val Asn Gly Ala Pro Glu Leu Ile Lys Ser
340 345 350
Leu Pro Trp Gly Thr Asp Phe Glu Val Asp Val Phe Arg Lys Pro Asp
355 360 365
Phe Thr Ala Leu Glu Val Val Ser Phe Ala Thr Gln Gly Phe Pro Gln
370 375 380
Trp Arg Asn Ile Pro Asn Tyr Tyr Glu Val Arg Glu Ser Thr Gly Phe
385 390 395 400
Lys Asn Val Ser Leu Ala Asn Arg Leu Ala Ala Trp Ala Pro Asn Glu
405 410 415
Glu Leu Thr Phe Ile His Pro Asp Asp Val Glu Leu Tyr Asn Ala Trp
420 425 430
Asp Ser Arg Ala Trp Glu Leu Gln Val Ala Asn His Arg Leu Leu Gly
435 440 445
His Gly Ser Gly Lys Leu Phe Gln Glu Ser Ala Asp Gly Lys Leu Asn
450 455 460
Phe Asp Pro Glu Lys Ile Ile Asn Pro Leu Thr Gly Lys Pro Leu Ser
465 470 475 480
Ser Trp Tyr Lys Pro Gly Gln Thr Pro Asp Ser Val Leu Gly Glu Val
485 490 495
Ser Ser Ser Leu Glu Lys Cys Arg Ala Glu Thr Val Ala Leu Tyr Leu
500 505 510
Val Ser Asn Leu Asp Ile Leu Lys Ile Phe Asn Tyr Val Asp Lys Gln
515 520 525
Glu Ile Glu Asp Ile Gln Tyr Ile Thr Phe Leu Leu Leu Ala Arg Ala
530 535 540
Gly Leu Arg Ala Leu Glu Phe Tyr Asp Pro Thr Thr Lys Lys His Gly
545 550 555 560
Gln Ala His Leu Gln Ala Arg Leu Gly Ile Thr Gln Tyr Leu Ile Arg
565 570 575
Ala Gly Ile Ala Arg Leu Asp Leu Ile Lys Asp Ala Ser Gly Glu Leu
580 585 590
Glu Asn Val Tyr Val Arg Val Asp Arg Asp Lys Val Leu Ser Lys Gly
595 600 605
Lys Glu Val Val Gly Gln Leu Leu Ile Glu Leu Gln Val Arg Lys Ser
610 615 620
Thr Ala Asp Gly Ala Gly Ser Arg Asp Phe Tyr Arg Thr Leu Thr Glu
625 630 635 640
Pro Ile Pro Gly Trp Glu Gly Lys Ile Arg Asp Ile Val Leu Lys Lys
645 650 655
Lys Leu Pro Arg Lys Ile Phe Val Gln Pro Asn Thr Leu Val Val Asp
660 665 670
Gly Glu Val Gln Leu Lys Glu Tyr Pro Leu Thr Ala Ala Gly Val Ile
675 680 685
Glu Ser Phe Ile Glu Arg Arg Val Asp
690 695
<210> 2
<211> 2093
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgcagctac tactactgtt cacggtgaaa gattcttggc tgacaaggct gctccattgt 60
gtggtttgga cgttggtaag tctttcgacc aattgtctcc aaaggaaaag ttgtacactc 120
actacttgac tgaagcttct tgggctggtg ctagaatcat ccaagctcag tggactgctc 180
aagctgctga cttgtacgac ttgttgatct tgactttctc tgctaacggt aagttggctg 240
acttggacgc tttgaagact tcttctggtt tgtctgaaga cgactgggaa gctttgatcc 300
aatacactgt tcaagttttg tctaacttgg ttaactacaa gcgttggggt ttcactaaga 360
tcatcccaag agttgacgct gacaagttcg aagctgttgt taaggcttct tctaacgctg 420
accaagcttc tgctttgttc actaagttga agcaacacat ctacgctttg tctccagaag 480
ctgctttgtt catcggtaag agaaaggacg gtcacgtttc taactactac ttgggtgaag 540
ctgttggtga cgctgaagtt gacgctatcc aatctgctgc tgaaagattg ggtgttgaca 600
tcttgaacac tagagttaga aagaacggta ctggtgacta cactttgttg gttgcttctg 660
ctaagacttc tccaccagct gctcacgact tccaaatcga cactaagcca gctaagttga 720
ctatcggtta cggtgactac gcttcttctt tgactaaggt tgttgctgct ttgcaagaag 780
ctaagaagta cgctgctaac gaccaccaat ctgctttgat cgaaggttac ttgaagtctt 840
tcgactctgg ttctatccca gaacacaagg ctgcttctac tgagtgggtt aaggacatcg 900
gtccagttgt tgaatcttac atcggtttcg ttagaactta cgttgaccca tacggtggta 960
gagctgaaca cgaagttggt ttcactgcta tcgttaacaa gcaattgtct gctaagtacg 1020
aaactttggt taacggtgct ccagaattga tcaagtcttt gccttggggt actgacttcg 1080
aagttgacgt tttcagaaag ccagacttca ctgctttgga agttgtttct ttcgctactc 1140
aaggtttccc acagtggaga aacatcccaa actactacga agttagagaa tctactggtt 1200
tcaagaacgt ttctttggct aacagattgg ctgcttgggc tccaaacgaa gaattgactt 1260
tcatccaccc agacgacgtt gaattgtaca acgcttggga ctctagagct tgggaattgc 1320
aagttgctaa ccacagattg ttgggtcacg gttctggtaa gttgttccaa gaatctgctg 1380
acggtaagtt gaacttcgac ccagaaaaga tcatcaaccc attgactggt aagccattgt 1440
cttcttggta caagccaggt caaactccag actctgtttt gggtgaagtt tcttcttctt 1500
tggaaaagtg tagagctgaa actgttgctt tgtacttggt ttctaacttg gacatcttga 1560
agatcttcaa ctacgttgac aagcaagaaa tcgaagacat ccaatacatc actttcttgt 1620
tgttggctag agctggtttg agagctttgg aattctacga cccaactact aagaagcacg 1680
gtcaagctca cttgcaagct agattgggta tcactcaata cttgatcaga gctggtatcg 1740
ctagattgga cttgatcaag gacgcttctg gtgaattgga aaacgtttac gttagagttg 1800
acagagacaa ggttttgtct aagggtaagg aagttgttgg tcaattgttg atcgaattgc 1860
aagttagaaa gtctactgct gacggtgctg gttctagaga cttctacaga actttgactg 1920
aaccaatccc aggttgggaa ggtaagatca gagacatcgt tttgaagaag aagttgccaa 1980
gaaagatctt cgttcaacca aacactttgg ttgttgacgg tgaagttcaa ttgaaggaat 2040
acccattgac tgctgctggt gttatcgaat ctttcatcga aagaagagtc gac 2093
<210> 3
<211> 697
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Ala Thr Thr Thr Val His Gly Glu Arg Phe Leu Ala Asp Lys Ala
1 5 10 15
Ala Pro Leu Cys Gly Met Asp Val Gly Lys Ser Phe Asp Gln Leu Ser
20 25 30
Pro Lys Glu Lys Leu Tyr Thr His Tyr Leu Thr Glu Ala Ser Trp Ala
35 40 45
Gly Ala Arg Ile Ile Gln Ala Gln Trp Thr Ala Gln Ala Ala Asp Leu
50 55 60
Tyr Asp Leu Leu Ile Leu Thr Phe Ser Ala Asn Gly Lys Leu Ala Asp
65 70 75 80
Leu Asp Ala Leu Lys Thr Ser Ser Gly Leu Ser Glu Asp Asp Trp Glu
85 90 95
Ala Leu Ile Gln Tyr Thr Val Gln Val Leu Ser Asn Leu Val Asn Tyr
100 105 110
Lys Thr Phe Gly Phe Thr Lys Ile Ile Pro Arg Val Asp Ala Asp Lys
115 120 125
Phe Glu Ala Val Val Lys Ala Ser Ser Asn Ala Asp Gln Ala Ser Ala
130 135 140
Leu Phe Thr Lys Leu Lys Gln His Ile Tyr Ala Leu Ser Pro Glu Ala
145 150 155 160
Ala Leu Phe Ile Gly Lys Arg Lys Asp Gly His Val Ser Asn Tyr Tyr
165 170 175
Leu Gly Glu Ala Val Gly Asp Ala Glu Val Asp Ala Ile Gln Ser Ala
180 185 190
Ala Glu Arg Leu Gly Val Asp Ile Leu Asn Thr Arg Val Arg Lys Asn
195 200 205
Gly Thr Gly Asp Tyr Thr Leu Leu Val Ala Ser Ala Lys Thr Ser Pro
210 215 220
Pro Ala Ala His Asp Phe Gln Ile Asp Thr Lys Pro Ala Lys Leu Thr
225 230 235 240
Ile Gly Tyr Gly Asp Tyr Ala Ser Ser Leu Thr Lys Val Val Ala Ala
245 250 255
Leu Gln Glu Ala Lys Lys Tyr Ala Ala Asn Asp His Gln Ser Ala Met
260 265 270
Ile Glu Gly Tyr Met Lys Ser Phe Asp Ser Gly Ser Ile Pro Glu His
275 280 285
Lys Ala Ala Ser Thr Glu Trp Val Lys Asp Ile Gly Pro Val Val Glu
290 295 300
Ser Tyr Ile Gly Phe Val Glu Thr Tyr Val Asp Pro Tyr Gly Gly Arg
305 310 315 320
Ala Glu Trp Glu Val Gly Phe Thr Ala Ile Val Asn Lys Gln Leu Ser
325 330 335
Ala Lys Tyr Glu Thr Leu Val Asn Gly Ala Pro Glu Leu Ile Lys Ser
340 345 350
Leu Pro Trp Gly Thr Asp Phe Glu Val Asp Val Phe Arg Lys Pro Asp
355 360 365
Phe Thr Ala Leu Glu Val Val Ser Phe Ala Thr Gly Gly Ile Pro Ala
370 375 380
Gly Ile Asn Ile Pro Asn Tyr Tyr Glu Val Arg Glu Ser Thr Gly Phe
385 390 395 400
Lys Asn Val Ser Leu Ala Asn Ile Leu Ala Ala Lys Ala Pro Asn Glu
405 410 415
Glu Leu Thr Phe Ile His Pro Asp Asp Val Glu Leu Tyr Asn Ala Trp
420 425 430
Asp Ser Arg Ala Phe Glu Leu Gln Val Ala Asn His Glu Leu Leu Gly
435 440 445
His Gly Ser Gly Lys Leu Phe Gln Glu Ser Ala Asp Gly Lys Leu Asn
450 455 460
Phe Asp Pro Glu Lys Ile Ile Asn Pro Leu Thr Gly Lys Pro Met Ser
465 470 475 480
Ser Trp Tyr Lys Pro Gly Gln Thr Pro Asp Ser Val Leu Gly Glu Val
485 490 495
Ser Ser Ser Met Glu Glu Cys Arg Ala Glu Thr Val Ala Leu Tyr Leu
500 505 510
Val Ser Asn Leu Asp Ile Leu Lys Ile Phe Asn Tyr Val Asp Lys Gln
515 520 525
Glu Ile Glu Asp Ile Gln Tyr Ile Thr Phe Leu Leu Met Ala Arg Ala
530 535 540
Gly Leu Arg Ala Leu Glu Phe Tyr Asp Pro Thr Thr Lys Lys His Gly
545 550 555 560
Gln Ala His Met Gln Ala Arg Met Gly Ile Thr Gln Tyr Leu Ile Arg
565 570 575
Ala Gly Ile Ala Arg Leu Asp Leu Ile Lys Asp Ala Ser Gly Glu Leu
580 585 590
Glu Asn Val Tyr Val Arg Val Asp Arg Asp Lys Val Leu Ser Lys Gly
595 600 605
Lys Glu Val Val Gly Gln Leu Leu Ile Glu Leu Gln Val Arg Lys Ser
610 615 620
Thr Ala Asp Gly Ala Gly Ser Arg Asp Phe Tyr Arg Thr Leu Thr Glu
625 630 635 640
Pro Ile Pro Gly Trp Glu Gly Lys Ile Arg Asp Ile Val Leu Lys Lys
645 650 655
Lys Leu Pro Arg Lys Ile Phe Val Gln Pro Asn Thr Leu Val Val Asp
660 665 670
Gly Glu Val Gln Leu Lys Glu Tyr Pro Leu Thr Ala Ala Gly Val Ile
675 680 685
Glu Ser Phe Ile Glu Arg Arg Val Asp
690 695
<210> 4
<211> 2093
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgcagccac cactaccgtc catggcgaga gatttctagc tgacaaagcc gctcctctgt 60
gtggcatgga cgttggtaaa tcttttgacc aattgtctcc taaagaaaaa ctgtacactc 120
attacttgac agaagctagt tgggccggcg ctagaataat tcaggctcag tggaccgctc 180
aagccgctga tctttacgat ctgctgatct taactttcag tgccaacggt aagttggctg 240
atcttgacgc cttaaagact tcctctggtc tttcagaaga tgactgggaa gcattgattc 300
aatacaccgt ccaagtgctg tcaaacttag ttaactacaa gacattcgga tttacaaaga 360
ttatcccaag agttgatgct gacaagtttg aggccgtagt gaaagccagt tcaaatgctg 420
atcaagcatc cgccttgttt acgaaactta aacaacatat ttatgctcta agtcccgagg 480
ctgctttgtt cataggtaag agaaaagacg gtcatgtttc aaattattac ttgggcgagg 540
cagttggtga cgctgaagtc gatgctatcc agtcagccgc cgaaagactg ggagtggaca 600
tcctgaacac tagagtaaga aagaacggta ccggagatta cacattgctt gtcgcttccg 660
ctaaaacatc ccctcctgcc gcccatgatt ttcaaattga tacgaagcct gcaaagctaa 720
cgataggtta cggtgattac gcttcttctc ttacaaaagt cgttgccgct ttgcaggaag 780
ctaagaagta tgctgctaat gatcaccaat ccgctatgat tgagggttat atgaagtctt 840
ttgattctgg ctctatacct gagcataaag cagcctctac tgaatgggtt aaggatattg 900
gacctgttgt ggaatcctat ataggtttcg ttgaaactta tgtcgatcct tacggtggaa 960
gagcagaatg ggaggtgggt tttactgcta ttgtaaacaa acaattaagt gcaaaatacg 1020
aaacactagt taatggtgct ccagaactta ttaagagttt accatgggga actgatttcg 1080
aggtggatgt tttcagaaaa ccagatttta ctgctttgga agtagttagt tttgctactg 1140
gtggaattcc tgctggaatt aacatcccaa actattacga ggtaagagag tcaactggtt 1200
tcaagaacgt ttccttggcc aatattctgg ctgctaaggc ccccaacgaa gagttaactt 1260
ttatacatcc agatgacgtg gaactgtaca acgcctggga ctcaagagcc ttcgagttgc 1320
aagttgcaaa tcacgaactt cttggacatg gttccggaaa gttgtttcaa gaatctgctg 1380
acggaaaatt gaatttcgac cctgaaaaga tcattaaccc attgactgga aaacccatgt 1440
catcttggta caagccaggt caaacccctg actcagttct tggtgaagtc tcttcttcaa 1500
tggaggagtg tagggctgag acagttgctc tgtaccttgt ctcaaatcta gatatcctta 1560
agatctttaa ctatgtcgat aaacaagaaa ttgaagatat tcagtatatc acttttttgt 1620
tgatggctcg agcaggatta agggctttag agttttatga tcctaccact aaaaagcatg 1680
gtcaggccca tatgcaagcc cgtatgggaa ttacccaata tctaattcgt gctggtatcg 1740
ctagacttga ccttattaaa gacgcctctg gtgaattgga aaatgtttac gtcagagttg 1800
acagagataa agttctttct aagggaaaag aggttgtcgg tcaattgttg atcgagctgc 1860
aagttaggaa gtccactgct gacggtgcag gctctagaga tttctatcga actttaaccg 1920
aaccaattcc aggttgggaa ggaaaaatca gagatattgt cttgaagaaa aaactgccaa 1980
gaaagatttt cgttcaaccc aacactctag ttgttgatgg tgaagttcaa ctaaaagagt 2040
acccccttac agcagctggt gttattgaga gttttattga aagaagagtc gac 2093

Claims (4)

1.一种黄曲霉毒素分解酶在降解饲料中黄曲霉毒素B1中的应用，其特征在于，所述黄曲霉毒素分解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述黄曲霉毒素分解酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，携带权利要求2所述基因的重组载体包括毕赤酵母表达质粒pPICZαB。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，表达所述黄曲霉毒素分解酶的重组菌包括毕赤酵母SMD1163。
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