CN110055240A

CN110055240A - 一种可降解低浓度氨基甲酸乙酯的脲酶重组酶

Info

Publication number: CN110055240A
Application number: CN201910338782.2A
Authority: CN
Inventors: 方芳; 贾云耀; 陈坚; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-04-25
Filing date: 2019-04-25
Publication date: 2019-07-26

Abstract

本发明涉及一种可降解低浓度氨基甲酸乙酯的脲酶重组酶，属于生物工程技术领域。本发明分别将脲酶在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中进行异源表达，结果表明此脲酶在大肠杆菌系统中为包涵体表达，而在枯草芽孢杆菌系统中得到了较好的可溶性表达。纯化的脲酶能够在较短的时间内，利用较少的酶量降低低浓度(低于500μg/L)的EC，在50小时内可降解约30％的氨基甲酸乙酯，将氨基甲酸乙酯的含量降至安全范围内(少于400μg/L)。与其他脲酶相比，具有EC降解率高、达到相同降解效果酶用量少等优点，使其在发酵食品中具有巨大的应用价值。

Description

一种可降解低浓度氨基甲酸乙酯的脲酶重组酶

技术领域

本发明涉及一种可降解低浓度氨基甲酸乙酯的脲酶重组酶，属于生物工程技术领域。

背景技术

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate或Urethane，简称EC)是一种2A类致癌物质，人体过量摄入会引起癌症，普遍存在于发酵食品(如酱油、泡菜等)及酒精饮料(黄酒、白酒、葡萄酒等)中，发酵食品中氨基甲酸乙酯的存在已成为影响食品安全的一个不可忽视的因素。减少或消除发酵食品中的氨基甲酸乙酯成为了一个亟待解决的问题。

目前消除发酵食品中氨基甲酸乙酯的思路主要有三种：

一是降低或消除氨基甲酸乙酯的前体物质(主要是尿素)的含量。包括精选原料，降低原料中氨基甲酸乙酯的前体物质的含量，还可以利用酸性脲酶将尿素分解为氨和二氧化碳，在发酵过程中可以有效减少氨基甲酸乙酯的形成。由于尿素不是形成氨基甲酸乙酯的唯一前体，所以此种方法的应用还是具有一定局限性的。

二是优选低产尿素的发酵菌株。选育低产尿素酵母菌的方法只适用于纯种发酵的发酵过程。如白酒窖内发酵是混菌发酵，所以对某一菌株的优选是无法实现对EC及其前体物质的积累有效控制。

三是利用酶法降解已形成的EC。氨基甲酸乙酯水解酶(Urethanase)和脲酶(Urease)具有分解氨基甲酸乙酯成为氨和二氧化碳的能力，从而降解氨基甲酸乙酯。但已有的脲酶降解低浓度氨基甲酸乙酯的效果并不理想。比如，刘庆涛等用复地衣芽孢杆菌6000U/L脲酶处理50h，EC从450ppb降至380ppb，降解率为15.9％；杨宇清等用罗伊氏乳杆菌50000U/L脲酶处理，无明显降解效果。因此，提供一种酶法去除低浓度氨基甲酸乙酯的有效途径，具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种脲酶突变体，所述脲酶突变体的结构亚基UreA、UreB、UreC的氨基酸序列：

(a)分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；

或，(b)是在(a)中氨基酸序列的基础上经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸得到的，且编码具有氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶活性的由(a)衍生的蛋白质，比如在C端或者N端添加或缺失一个或数个氨基酸残基、添加融合标签等，虽然在形式上进行修饰但不降低所述脲酶的酶活。

本发明的第二个目的是提供编码上述脲酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明的第三个目的是提供含上述基因的载体或细胞。

本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，是以大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，B.subtilis)为宿主，表达权利要求1所述的脲酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌BL21为宿主，以pET系列质粒为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌WB600为宿主，以pP43NMK质粒为表达载体。

本发明的第五个目的是提供一种脲酶的生产方法，应用上述基因工程菌进行发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括将基因工程菌接种至LB培养基中，于35-38℃，200-220rpm摇床培养8-16h，将得到的培养液按1-5％的接种量转接至TB培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入IPTG诱导，35-38℃培养10-12h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括将基因工程菌接种至LB培养基中，于35-38℃，200-220rpm条件下培养8-16h，将得到的培养液按1-5％的接种量转接到TB培养基中，35-38℃，200-220rpm培养20-30h。

本发明的第六个目的是提供上述的脲酶突变体在降低发酵食品中的氨基甲酸乙酯含量方面的应用。

本发明分别将脲酶在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中进行异源表达，结果表明此脲酶在大肠杆菌系统中为包涵体表达，而在枯草芽孢杆菌系统中得到了较好的可溶性表达。获得的脲酶重组酶能够在较短的时间内，利用较少的酶量降解低浓度(低于500μg/L)的EC，在50小时内可降解32.6％的500μg/L的氨基甲酸乙酯，将氨基甲酸乙酯的含量降至安全范围内(400μg/L以下)。与其他脲酶相比，具有EC降解率高、达到相同降解效果酶用量少等优点，使其在发酵食品中具有巨大的应用价值。

附图说明

图1：A：用于构建大肠杆菌质粒的ureABC的PCR扩增电泳图谱，其中M为DNA Marker(5000bp，Takara公司)，1、2为ureABC的PCR扩增产物；B：用于构建枯草芽孢杆菌质粒的ureABC的PCR扩增电泳图谱，其中M为DNA Marker(5000bp，Takara公司)，3、4为ureABC的PCR扩增产物。

图2：A：表达质粒pET-28a-ure的构建示意图；B：表达质粒pP43NMK-ure的构建示意图。

图3：A：重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-ure表达产物包涵体复性的SDS-PAGE蛋白电泳图，其中M为Standard protein marker，1为重组菌诱导后全细胞，2为复性的包涵体；B：重组菌B.subtilis WB600/pP43NMK-ureABC表达产物及镍柱纯化的SDS-PAGE蛋白电泳图，其中3为50％洗脱液出峰，4为60％洗脱液出峰。

图4：脲酶降解EC测定结果。

图5：脲酶降解EC曲线。

具体实施方式

材料与方法

LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L(固体培养基另加2％的琼脂粉)。

TB培养基：将下列组分溶解在0.9L水中：12g蛋白胨，24g酵母粉，4mL甘油。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃后，再加100mL无菌的0.17mM KH₂PO₄，0.72mM K₂HPO₄。

使用的限制性内切酶和胶回收试剂盒菌购自ThermoFisher公司，基因组提取试剂盒购自TIANGEN公司，质粒提取试剂盒购自Sangon Biotech公司，一步克隆试剂盒II One Step Cloning Kit购自Vazyme公司，具体的反应条件和使用方法参考其说明书。

氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶酶活测定方法：取两支10mL比色管，分别加入1mL酶液和1mL灭活的酶液，然后在两管中分别加入1mL 3％EC或尿素底物溶液(用50mM pH 5.5的柠檬酸缓冲液配制)，在37℃恒温水浴锅中反应15min后，在两管中各加入1mL终止剂(10％三氯乙酸)，混合均匀后加入1mL显色剂I(15g苯酚和0.625g亚硝基铁氰化钠，用超纯水定容至250mL)和1mL显色剂II(13.125g NaOH和7.5mL NaClO，用超纯水定容至250mL)，混合均匀后在37℃水浴锅中保温20min后取出，用超纯水稀释到10mL，在625nm处比色，测定OD值，计算酶活(采用氯化铵绘制标准曲线)。

氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶酶活单位定义：在37℃常压下，50mM pH 5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，每分钟分解1μmol EC或尿素生成1μmol NH₄ ⁺所需要的酶量为一个酶活单位。

氨基甲酸乙酯采用GC-MS法进行检测，检测方法参考GB 5009.223-2014国标方法。

氨基甲酸乙酯降解率＝(初始浓度-终浓度)/初始浓度。

实施例1大肠杆菌表达载体和表达体系的构建

1、获得目的片段：人工合成SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，如图1A所示有2500bp左右的条带，与目的条带大小一致。

2、获得载体：将含有质粒pET-28a的大肠杆菌划线到含卡那霉素的LB平板上，培养12h后，挑单菌落到50mL/250mL摇瓶LB培养基中(含卡那霉素)，37℃下220r/min过夜培养，使用质粒提取试剂盒提取质粒。

3、酶切连接：根据脲酶基因序列和载体序列选择合适的限制性内切酶EcoRI、NotI，37℃金属浴中反应45min。

表1 50μL限制性内切酶酶切反应体系

酶切后的基因片段和质粒经过回收纯化后，按摩尔比4～10：1的比例混合，通过SolutionI连接酶进行连接反应，于16℃金属浴中连接过夜(见图2A)。

4、转化：将感受态细胞大肠杆菌JM109(克隆宿主)加入10μL连接产物，均匀混合后于冰中放置30min，42℃水浴90s后立即取出于冰中放置2-5min，然后加入700μL LB培养基摇床(37℃，220r/min)振荡培养1h。4000r/min离心3min，弃去大部分上清液，留100μL左右上清液重悬菌体。菌液均匀涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基上，置于37℃培养箱中过夜培养。次日挑取单菌落，通过菌落PCR筛选阳性转化子。

5、筛选出含重组质粒的转化菌落，提取质粒，酶切验证。

6、选2～3个酶切验证结果正确的重组质粒送至苏州金唯智测序，挑选测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，获得BL21/pET-28a-ure。

实施例2BL21/pET-28a-ure的脲酶蛋白的表达

挑取重组菌BL21/pET-28a-ure单菌落接种到LB培养基中，于37℃、220r/min条件下过夜培养。将种子液按1％的接种量转接到TB培养基中，于37℃、220r/min条件下培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG，37℃220rpm振荡培养12h。将培养后的培养液于10000g离心10min收集菌体，按原体积加入20mM pH7.4的PBS缓冲液，洗涤菌体，重复2次。然后将洗涤的菌体重悬，置于冰水浴上，利用超声波破碎菌体细胞，超声破碎条件设置：300W、破2s停4s，破碎10min。将得到的破碎液4℃10000g离心15min，收集沉淀，用20mMpH7.4PBS缓冲液洗涤三遍，即为新鲜的脲酶包涵体，将包涵体重悬于Buffer I(50mM PBS缓冲液，1mM EDTA，pH 7.4)中，并通过超声破碎细胞，4℃10000g离心15min。随后，用BufferII(50mM PBS缓冲液，1mM EDTA，500mM NaCl，0.3TritonX-100，pH7.4)洗涤包涵体两次并溶解于Buffer III(8M尿素，50mM PBS缓冲液，1mM EDTA，0.2mM氧化型谷胱甘肽，2mM还原型谷胱甘肽，20％甘油，1％甘氨酸，pH 7.4)中，并震荡30min。4℃10000g离心10min后收集上清即得到包涵体溶解液。将包涵体溶解液装入透析袋中，用含有不同尿素浓度的Buffer III进行透析，复性缓冲液的尿素浓度分别为7.0、6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0M。最后一步，复性的包涵体溶液在50mM，pH 5.5的柠檬酸缓冲液中透析。每一步透析都需要在4℃下搅拌透析6h。最终通过在10000g，4℃离心15min来去除不可溶的蛋白。复性的包涵体溶液在4℃下保存。上清液即为脲酶重组酶粗酶液，经测定，脲酶酶活为191U/L，氨基甲酸乙酯水解酶酶活为145U/L，蛋白电泳结果见图3A。

实施例3枯草芽孢杆菌表达载体和表达体系的构建

1、获得目的片段：人工合成SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，如图1B所示有2500bp左右的条带，与目的条带大小一致。

2、获得载体：将含有质粒pP43NMK的大肠杆菌划线到含氨苄青霉素的LB平板上，培养12h后，挑单菌落到50mL/250mL摇瓶LB培养基中(含氨苄青霉素)，37℃下220r/min过夜培养，使用质粒提取试剂盒提质粒。

3、一步克隆连接：利用II One Step Cloning Kit连接片段和载体(图2B)。

表1 20μL限制性内切酶酶切反应体系

将连接体系配置好后吹吸混匀，置于37℃金属浴中连接30min。

4、转化：将感受态细胞大肠杆菌JM109(克隆宿主)加入5μL连接产物，均匀混合后于冰中静置30min。42℃水浴90s后立即取出于冰中放置2-5min。加入700μL LB培养基摇床(37℃，220r/min)振荡培养1h。4000r·min-1离心2min，弃去大部分上清液，留100μL左右上清液重悬菌体。菌液均匀涂布于含有氨苄青霉素的平板上，置于37℃培养箱中过夜培养。次日挑取单菌落，通过菌落PCR筛选阳性转化子。

5、选2～3个阳性转化子的重组质粒送至苏州金唯智测序，挑选测序正确的重组质粒转化至枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中，获得WB600/pP43NMK-ure。

实施例4B.subtilis WB600/pP43NMK-ure的脲酶蛋白的表达及镍柱纯化

挑取重组菌WB600/pP43NMK-ure单菌落接种到LB培养基中，于37℃，220r/min条件下过夜培养。将种子液按1％的接种量转接到TB培养基中，37℃，220rpm振荡培养24h。将发酵液于10000g离心10min收集菌体，按原体积加入20mM pH 7.4的PBS缓冲液，洗涤菌体，重复2次。然后将洗涤的菌体用50mM pH 5.5的柠檬酸缓冲液重悬，置于冰水浴上，利用超声波破碎菌体细胞，将得到的破碎液利用于4℃，10000g离心15min，收集上清，即为脲酶粗酶液，粗酶液脲酶酶活和EC酶酶活分别为213U/L和128U/L。经过镍柱纯化后，脲酶酶活为2.0U/mg，氨基甲酸乙酯水解酶酶活为1.3U/mg，蛋白电泳结果见图3B。

实施例5枯草芽孢杆菌表达的脲酶重组酶降解EC的能力

分别向含有100μg/L，500μg/L，1000μg/L浓度EC的缓冲体系中添加200U/L的枯草芽孢杆菌表达的脲酶重组酶，37℃处理3h后，用GC-MC进行EC含量的测定，结果显示，在1000μg/L的体系中降解了37％的EC，在500μg/L的体系中降解了12.4％的EC，显示出该脲酶具有良好的降解EC的能力，测定结果如图4。

向含有500μg/L EC的缓冲体系中添加2000U/L的枯草芽孢杆菌表达的脲酶重组酶，37℃处理50h，分别在第0、5、10、20、30、40、50h取样测定EC浓度。结果显示，在前5小时EC降解了20％，在50小时共降解了32.6％的EC，测定结果如图5。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种可降解低浓度氨基甲酸乙酯的脲酶重组酶

<130> 233

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2395

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaaactga caccggttga acaagaaaaa ttgcttattt ttacggcggg agagctcgct 60

aagcagcgga aggcgcgcgg cgttctgctg aattatcccg aagccgccgc atatttgacc 120

tgttatctga tggaaggcgc gagagacgga aaaagcgttg ctgagctgat ggaatccggc 180

cgcaatgtat tgacggaaaa agacgttatg gaaggcgttg cggaaatgct ggacagcatt 240

caggtggaag cgacgttccc ggacggggtt aagcttgtca ccgttcatca gccgatcaaa 300

gcggaggtga agtcatgaag ccgggagcga ttcaagtcgc aaaggggacc atcaccatta 360

acgaaggccg gaagacgctg gaggtgtcag tcaccaataa cggaacgcgg tcagtgcagg 420

tcggatcgca ttttcatttt gccgaagcca acggcgccct ttccttcaat cgggacaaag 480

ccatcggcat gcgccttgat atcccgtcag gcacatctgt ccgttttgaa ccgggagaag 540

agaaaaccgt cacgctcgtg gaaatcggag ggcgaaaaac ggtcagaggt ctcaacggca 600

tggccgatac gtacatggat gagcggggaa aagagaagac gctgtcaaat cttaaaaaag 660

ccggatggat ggaggaggcg atccgatgaa aatgtcgcgt gagcaatacg cagaactgtt 720

cggaccgaca acgggagaca aagtcagact cggagatacg gatttatgga ttgaagtcga 780

aaaagatttc acgaattacg gggaagaaat gattttcggc ggagggaaaa caatccggga 840

cggcatgggg cagaacgggc gtatcaccgg gaaagacgga gcgcttgatc tggtcattac 900

aaacgccgtc atcctggatt ataccggaat cgtcaaggcg gatatcgggg tgaaggacgg 960

ccggattgtc ggcgtcggga aaagcggcaa ccctgatatg atggatgggg tggacccgca 1020

catgattatc ggtgccggaa cagaagtcat ttccggcgaa gggaaaatcg taacggccgg 1080

cggggtggat acgcatatcc actttatctg cccgcagcag atggaagtcg cgctttcttc 1140

aggcgtgact acgcttctcg gcggcggaac aggtcctgcg acgggaagta aagcgacgac 1200

ttgtacatcc ggtgtatggt acatgtcgag aatgctggaa gcggccgagg agtttccgat 1260

caatgtcggt ttcttaggaa aaggaaatgc atccgataaa gcgccgctga tcgagcaggt 1320

ggaagcaggc gcaatcggcc tgaagctgca tgaagattgg ggatcaacgc caagcgctat 1380

taaagcttgc atggaagcag cggatgaggc ggacattcag gtggcgatcc acacagacac 1440

gataaatgaa gcgggctttt tagaaaatac gcttgatgcg atcggcgacc gggttatcca 1500

tacatatcac atagagggag ccggcggagg ccatgcaccg gatattatga aactcgcatc 1560

ttacgccaat atcctgccgt cctctacgac gccgacgatt ccatataccg tcaacacgat 1620

ggacgagcat cttgatatga tgatggtctg ccatcattta gattcaaaag tgcctgaaga 1680

cgtggcgttc agtcattcac gcatcagagc ggccaccatt gcggcggagg atattctgca 1740

cgatatcggc gcgatcagca tgacgtcatc tgactcgcag gcgatgggca gggtgggaga 1800

agtgattatc cggacatggc aggtggccga taaaatgaaa aaacagcgcg gtgctctatc 1860

gggagaaaac ggcaatgaca atgtgcgcgc caaacgctat atcgccaaat acacgatcaa 1920

cccggctgtc actcacggtc tgagccatga agtcggttcc gttgaaaaag gaaagctcgc 1980

cgacctcgta ctatgggacc cggttttctt cggcgtcaaa cctgaacttg tgctcaaagg 2040

cggcatgatt gcccgcgccc agatgggaga tccgaatgct tccattccga cgcctgagcc 2100

cgtgtttatg cggcagatgt acgcatcata cggtaaagca aaccgcaaca cctctattac 2160

atttatgtcc caggccggta tcgcaaacgg tgtgccggaa aagctcggcc ttgaaaaaat 2220

gatttctccc gtacggaata tccgtaagct gagtaagctc gacatgaagc tgaatgacgc 2280

gatgccgaat atacgtgtcg atccgaaaac ctatcaggtg ttcgccgacg gagaagagct 2340

ggcatgccag cccgtcagct atgttccgct aggacagcgt tatttcttat tttaa 2395

<210> 2

<211> 805

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Lys Leu Thr Pro Val Glu Gln Glu Lys Leu Leu Ile Phe Thr Ala

1 5 10 15

Gly Glu Leu Ala Lys Gln Arg Lys Ala Arg Gly Val Leu Leu Asn Tyr

20 25 30

Pro Glu Ala Ala Ala Tyr Leu Thr Cys Tyr Leu Met Glu Gly Ala Arg

35 40 45

Asp Gly Lys Ser Val Ala Glu Leu Met Glu Ser Gly Arg Asn Val Leu

50 55 60

Thr Glu Lys Asp Val Met Glu Gly Val Ala Glu Met Leu Asp Ser Ile

65 70 75 80

Gln Val Glu Ala Thr Phe Pro Asp Gly Val Lys Leu Val Thr Val His

85 90 95

Gln Pro Ile Lys Ala Glu Val Lys Ser Met Lys Pro Gly Ala Ile Gln

100 105 110

Val Ala Lys Gly Thr Ile Thr Ile Asn Glu Gly Arg Lys Thr Leu Glu

115 120 125

Val Ser Val Thr Asn Asn Gly Thr Arg Ser Val Gln Val Gly Ser His

130 135 140

Phe His Phe Ala Glu Ala Asn Gly Ala Leu Ser Phe Asn Arg Asp Lys

145 150 155 160

Ala Ile Gly Met Arg Leu Asp Ile Pro Ser Gly Thr Ser Val Arg Phe

165 170 175

Glu Pro Gly Glu Glu Lys Thr Val Thr Leu Val Glu Ile Gly Gly Arg

180 185 190

Lys Thr Val Arg Gly Leu Asn Gly Met Ala Asp Thr Tyr Met Asp Glu

195 200 205

Arg Gly Lys Glu Lys Thr Leu Ser Asn Leu Lys Lys Ala Gly Trp Met

210 215 220

Glu Glu Ala Ile Arg Met Asp Gly Gly Gly Asp Pro Met Lys Met Ser

225 230 235 240

Arg Glu Gln Tyr Ala Glu Leu Phe Gly Pro Thr Thr Gly Asp Lys Val

245 250 255

Arg Leu Gly Asp Thr Asp Leu Trp Ile Glu Val Glu Lys Asp Phe Thr

260 265 270

Asn Tyr Gly Glu Glu Met Ile Phe Gly Gly Gly Lys Thr Ile Arg Asp

275 280 285

Gly Met Gly Gln Asn Gly Arg Ile Thr Gly Lys Asp Gly Ala Leu Asp

290 295 300

Leu Val Ile Thr Asn Ala Val Ile Leu Asp Tyr Thr Gly Ile Val Lys

305 310 315 320

Ala Asp Ile Gly Val Lys Asp Gly Arg Ile Val Gly Val Gly Lys Ser

325 330 335

Gly Asn Pro Asp Met Met Asp Gly Val Asp Pro His Met Ile Ile Gly

340 345 350

Ala Gly Thr Glu Val Ile Ser Gly Glu Gly Lys Ile Val Thr Ala Gly

355 360 365

Gly Val Asp Thr His Ile His Phe Ile Cys Pro Gln Gln Met Glu Val

370 375 380

Ala Leu Ser Ser Gly Val Thr Thr Leu Leu Gly Gly Gly Thr Gly Pro

385 390 395 400

Ala Thr Gly Ser Lys Ala Thr Thr Cys Thr Ser Gly Val Trp Tyr Met

405 410 415

Ser Arg Met Leu Glu Ala Ala Glu Glu Phe Pro Ile Asn Val Gly Phe

420 425 430

Leu Gly Lys Gly Asn Ala Ser Asp Lys Ala Pro Leu Ile Glu Gln Val

435 440 445

Glu Ala Gly Ala Ile Gly Leu Lys Leu His Glu Asp Trp Gly Ser Thr

450 455 460

Pro Ser Ala Ile Lys Ala Cys Met Glu Ala Ala Asp Glu Ala Asp Ile

465 470 475 480

Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr Ile Asn Glu Ala Gly Phe Leu Glu

485 490 495

Asn Thr Leu Asp Ala Ile Gly Asp Arg Val Ile His Thr Tyr His Ile

500 505 510

Glu Gly Ala Gly Gly Gly His Ala Pro Asp Ile Met Lys Leu Ala Ser

515 520 525

Tyr Ala Asn Ile Leu Pro Ser Ser Thr Thr Pro Thr Ile Pro Tyr Thr

530 535 540

Val Asn Thr Met Asp Glu His Leu Asp Met Met Met Val Cys His His

545 550 555 560

Leu Asp Ser Lys Val Pro Glu Asp Val Ala Phe Ser His Ser Arg Ile

565 570 575

Arg Ala Ala Thr Ile Ala Ala Glu Asp Ile Leu His Asp Ile Gly Ala

580 585 590

Ile Ser Met Thr Ser Ser Asp Ser Gln Ala Met Gly Arg Val Gly Glu

595 600 605

Val Ile Ile Arg Thr Trp Gln Val Ala Asp Lys Met Lys Lys Gln Arg

610 615 620

Gly Ala Leu Ser Gly Glu Asn Gly Asn Asp Asn Val Arg Ala Lys Arg

625 630 635 640

Tyr Ile Ala Lys Tyr Thr Ile Asn Pro Ala Val Thr His Gly Leu Ser

645 650 655

His Glu Val Gly Ser Val Glu Lys Gly Lys Leu Ala Asp Leu Val Leu

660 665 670

Trp Asp Pro Val Phe Phe Gly Val Lys Pro Glu Leu Val Leu Lys Gly

675 680 685

Gly Met Ile Ala Arg Ala Gln Met Gly Asp Pro Asn Ala Ser Ile Pro

690 695 700

Thr Pro Glu Pro Val Phe Met Arg Gln Met Tyr Ala Ser Tyr Gly Lys

705 710 715 720

Ala Asn Arg Asn Thr Ser Ile Thr Phe Met Ser Gln Ala Gly Ile Ala

725 730 735

Asn Gly Val Pro Glu Lys Leu Gly Leu Glu Lys Met Ile Ser Pro Val

740 745 750

Arg Asn Ile Arg Lys Leu Ser Lys Leu Asp Met Lys Leu Asn Asp Ala

755 760 765

Met Pro Asn Ile Arg Val Asp Pro Lys Thr Tyr Gln Val Phe Ala Asp

770 775 780

Gly Glu Glu Leu Ala Cys Gln Pro Val Ser Tyr Val Pro Leu Gly Gln

785 790 795 800

Arg Tyr Phe Leu Phe

805

<210> 3

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Lys Leu Thr Pro Val Glu Gln Glu Lys Leu Leu Ile Phe Thr Ala

1 5 10 15

Gly Glu Leu Ala Lys Gln Arg Lys Ala Arg Gly Val Leu Leu Asn Tyr

20 25 30

Pro Glu Ala Ala Ala Tyr Leu Thr Cys Tyr Leu Met Glu Gly Ala Arg

35 40 45

Asp Gly Lys Ser Val Ala Glu Leu Met Glu Ser Gly Arg Asn Val Leu

50 55 60

Thr Glu Lys Asp Val Met Glu Gly Val Ala Glu Met Leu Asp Ser Ile

65 70 75 80

Gln Val Glu Ala Thr Phe Pro Asp Gly Val Lys Leu Val Thr Val His

85 90 95

Gln Pro Ile Lys Ala Glu Val Lys Ser

100 105

<210> 4

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Lys Pro Gly Ala Ile Gln Val Ala Lys Gly Thr Ile Thr Ile Asn

1 5 10 15

Glu Gly Arg Lys Thr Leu Glu Val Ser Val Thr Asn Asn Gly Thr Arg

20 25 30

Ser Val Gln Val Gly Ser His Phe His Phe Ala Glu Ala Asn Gly Ala

35 40 45

Leu Ser Phe Asn Arg Asp Lys Ala Ile Gly Met Arg Leu Asp Ile Pro

50 55 60

Ser Gly Thr Ser Val Arg Phe Glu Pro Gly Glu Glu Lys Thr Val Thr

65 70 75 80

Leu Val Glu Ile Gly Gly Arg Lys Thr Val Arg Gly Leu Asn Gly Met

85 90 95

Ala Asp Thr Tyr Met Asp Glu Arg Gly Lys Glu Lys Thr Leu Ser Asn

100 105 110

Leu Lys Lys Ala Gly Trp Met Glu Glu Ala Ile Arg

115 120

<210> 5

<211> 576

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Asp Gly Gly Gly Asp Pro Met Lys Met Ser Arg Glu Gln Tyr Ala

1 5 10 15

Glu Leu Phe Gly Pro Thr Thr Gly Asp Lys Val Arg Leu Gly Asp Thr

20 25 30

Asp Leu Trp Ile Glu Val Glu Lys Asp Phe Thr Asn Tyr Gly Glu Glu

35 40 45

Met Ile Phe Gly Gly Gly Lys Thr Ile Arg Asp Gly Met Gly Gln Asn

50 55 60

Gly Arg Ile Thr Gly Lys Asp Gly Ala Leu Asp Leu Val Ile Thr Asn

65 70 75 80

Ala Val Ile Leu Asp Tyr Thr Gly Ile Val Lys Ala Asp Ile Gly Val

85 90 95

Lys Asp Gly Arg Ile Val Gly Val Gly Lys Ser Gly Asn Pro Asp Met

100 105 110

Met Asp Gly Val Asp Pro His Met Ile Ile Gly Ala Gly Thr Glu Val

115 120 125

Ile Ser Gly Glu Gly Lys Ile Val Thr Ala Gly Gly Val Asp Thr His

130 135 140

Ile His Phe Ile Cys Pro Gln Gln Met Glu Val Ala Leu Ser Ser Gly

145 150 155 160

Val Thr Thr Leu Leu Gly Gly Gly Thr Gly Pro Ala Thr Gly Ser Lys

165 170 175

Ala Thr Thr Cys Thr Ser Gly Val Trp Tyr Met Ser Arg Met Leu Glu

180 185 190

Ala Ala Glu Glu Phe Pro Ile Asn Val Gly Phe Leu Gly Lys Gly Asn

195 200 205

Ala Ser Asp Lys Ala Pro Leu Ile Glu Gln Val Glu Ala Gly Ala Ile

210 215 220

Gly Leu Lys Leu His Glu Asp Trp Gly Ser Thr Pro Ser Ala Ile Lys

225 230 235 240

Ala Cys Met Glu Ala Ala Asp Glu Ala Asp Ile Gln Val Ala Ile His

245 250 255

Thr Asp Thr Ile Asn Glu Ala Gly Phe Leu Glu Asn Thr Leu Asp Ala

260 265 270

Ile Gly Asp Arg Val Ile His Thr Tyr His Ile Glu Gly Ala Gly Gly

275 280 285

Gly His Ala Pro Asp Ile Met Lys Leu Ala Ser Tyr Ala Asn Ile Leu

290 295 300

Pro Ser Ser Thr Thr Pro Thr Ile Pro Tyr Thr Val Asn Thr Met Asp

305 310 315 320

Glu His Leu Asp Met Met Met Val Cys His His Leu Asp Ser Lys Val

325 330 335

Pro Glu Asp Val Ala Phe Ser His Ser Arg Ile Arg Ala Ala Thr Ile

340 345 350

Ala Ala Glu Asp Ile Leu His Asp Ile Gly Ala Ile Ser Met Thr Ser

355 360 365

Ser Asp Ser Gln Ala Met Gly Arg Val Gly Glu Val Ile Ile Arg Thr

370 375 380

Trp Gln Val Ala Asp Lys Met Lys Lys Gln Arg Gly Ala Leu Ser Gly

385 390 395 400

Glu Asn Gly Asn Asp Asn Val Arg Ala Lys Arg Tyr Ile Ala Lys Tyr

405 410 415

Thr Ile Asn Pro Ala Val Thr His Gly Leu Ser His Glu Val Gly Ser

420 425 430

Val Glu Lys Gly Lys Leu Ala Asp Leu Val Leu Trp Asp Pro Val Phe

435 440 445

Phe Gly Val Lys Pro Glu Leu Val Leu Lys Gly Gly Met Ile Ala Arg

450 455 460

Ala Gln Met Gly Asp Pro Asn Ala Ser Ile Pro Thr Pro Glu Pro Val

465 470 475 480

Phe Met Arg Gln Met Tyr Ala Ser Tyr Gly Lys Ala Asn Arg Asn Thr

485 490 495

Ser Ile Thr Phe Met Ser Gln Ala Gly Ile Ala Asn Gly Val Pro Glu

500 505 510

Lys Leu Gly Leu Glu Lys Met Ile Ser Pro Val Arg Asn Ile Arg Lys

515 520 525

Leu Ser Lys Leu Asp Met Lys Leu Asn Asp Ala Met Pro Asn Ile Arg

530 535 540

Val Asp Pro Lys Thr Tyr Gln Val Phe Ala Asp Gly Glu Glu Leu Ala

545 550 555 560

Cys Gln Pro Val Ser Tyr Val Pro Leu Gly Gln Arg Tyr Phe Leu Phe

565 570 575

Claims

1.一种脲酶突变体，其特征在于，所述脲酶突变体的结构亚基UreA、UreB、UreC的氨基酸序列：

(a)分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；

或，(b)是在(a)中氨基酸序列的基础上经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸得到的，且编码具有脲酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述脲酶突变体的基因。

3.含权利要求2所述基因的载体或细胞。

4.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主，表达权利要求1所述的脲酶突变体。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21为宿主，以pET系列质粒为表达载体。

6.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌WB600为宿主，以pP43NMK质粒为表达载体。

7.一种脲酶的生产方法，其特征在于，应用权利要求4-6任一所述的基因工程菌进行发酵。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求5所述的基因工程菌接种至LB培养基中，于35-38℃，200-220rpm摇床培养8-16h，将得到的培养液按1-5％的接种量转接至TB培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入IPTG诱导，35-38℃培养10-12h。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求6所述的基因工程菌接种至LB培养基中，于35-38℃，200-220rpm条件下培养8-16h，将得到的培养液按1-5％的接种量转接到TB培养基中，35-38℃，200-220rpm培养20-30h。

10.权利要求1所述的脲酶突变体在降低发酵食品中的氨基甲酸乙酯含量方面的应用。