CN112921010A - 一种适用于发酵食品的多铜氧化酶重组酶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于发酵食品的多铜氧化酶重组酶，属于生物工程技术领域。本发明中将不同来源的多铜氧化酶基因及其优良突变体基因在乳酸乳球菌食品级表达系统NZ3900/pNZ8149中成功表达，并通过优化诱导条件，使得重组野生型多铜氧化酶MCOB和突变体L386Y、L386Y/T317N、L386Y/T317N/S427E的表达水平分别达到了2325.84U/L、4488.06U/L、4289.78U/L、2254.45U/L。将乳酸乳球菌食品级表达的多铜氧化酶用于生物胺的降解，可使多铜氧化酶对组胺的降解能力提高了63.41％，可以作为安全的食品添加剂应用于发酵食品降解生物胺。

Description

一种适用于发酵食品的多铜氧化酶重组酶

技术领域

本发明涉及一种适用于发酵食品的多铜氧化酶重组酶，属于生物工程技术领域。

背景技术

生物胺是生物体内产生的一类低分子量含氮有机化合物的总称，是发酵食品卫生标准中的一个限制性指标。适量的生物胺可以促进人体正常的生理活动，但通过食物摄入过量生物胺则会引起偏头痛，头痛，胃和肠道问题以及假性过敏反应等不良反应，严重时可能危及生命。因此，需要将其在发酵食品中的含量降至合适的浓度。

目前用于控制和减少发酵食品中生物胺的措施主要可分为三种：1、源头减控。对生产原料进行优化，减少原料中的蛋白质，控制游离氨基酸的数量，这种方法可以减少生物胺的生成。其弊端在于这种方法极大可能会对产品风味和品质造成较大影响。其它方法如减少发酵体系中产胺的微生物一般仅适用于封闭的单菌体系发酵，对于混菌体系或者开放体系(易染菌)效果不大。2、过程减控。这涉及到改进食品加工方法，对发酵条件(如发酵温度、发酵时间、pH等条件)进行优化以及添加外源抑制剂等来减少因菌株代谢及酶促反应而生成的胺前体物质，从而达到抑制胺产生的目的。但即使改变发酵条件，依然会有生物胺生成，且产品的加工温度和盐度等因素多由食物特性决定，而低温贮藏会提高设备和能耗费用。3、末端减控，也称为酶法减控。这种方法可以消除已生成的生物胺，且基本不用调整和改变食品发酵工艺，对食品营养和风味的影响也较小，是目前最具有应用前景的方法。

多铜氧化酶(MCO)家族的某些酶可以降解食品中的胺类危害物生物胺，但因酶的产量低、催化能力有限等因素从而造成了酶对生物胺的降解率低；食品酶的添加必须符合食品安全标准，所用生产菌株必须安全，工程菌不能使用任何抗性筛选标记，这些因素也限制了多铜氧化酶在实际中的应用。

发明内容

技术问题：本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种适用于发酵食品的多铜氧化酶重组酶。

本发明提供了一种多铜氧化酶突变体，是在SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的基础上，对第317位、386位、427位的至少一个氨基酸进行了突变。

在一种实施方式中，所述多铜氧化酶突变体是在SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的基础上，将第317位苏氨酸(T)突变为天冬酰胺(N)。

在一种实施方式中，所述多铜氧化酶突变体是在SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的基础上，将第386位亮氨酸(L)突变为酪氨酸(Y)。

在一种实施方式中，所述多铜氧化酶突变体是在SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的基础上，将第427位丝氨酸(S)突变为谷氨酸(E)。

在一种实施方式中，所述多铜氧化酶突变体是在SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的基础上，将第317位苏氨酸(T)突变为天冬酰胺(N)，并将第386位亮氨酸(L)突变为酪氨酸(Y)。

在一种实施方式中，所述多铜氧化酶突变体是在SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的基础上，将第317位苏氨酸(T)突变为天冬酰胺(N)，并将第386位亮氨酸(L)突变为酪氨酸(Y)，并将第427位丝氨酸(S)突变为谷氨酸(E)。

本发明还提供了编码所述多铜氧化酶突变体的基因。

本发明还提供了携带所述基因的表达载体。

在一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8149质粒。

本发明还提供了表达多铜氧化酶或多铜氧化酶突变体的乳酸乳球菌，所述多铜氧化酶来源于魏斯氏菌(W.cibaria)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5所示；所述多铜氧化酶突变体为上述任一所述的多铜氧化酶突变体。

在一种实施方式中，编码所述多铜氧化酶的基因序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6所示。

在一种实施方式中，所述乳酸乳球菌以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ3900为宿主，以pNZ8149为载体。

本发明还提供了含有所述乳酸乳球菌的食品添加剂。

在一种实施方式中，所述食品添加剂含有所述乳酸乳球菌和细胞保护剂。

本发明还提供了一种生产多铜氧化酶的方法，是用所述重组乳酸乳球菌发酵生产多铜氧化酶。

在一种实施方式中，发酵所用的培养基为GM17培养基。

在一种实施方式中，所述重组乳酸乳球菌培养至OD₆₀₀为0.4～0.6后，采用终浓度0.00001～45mg/mL的nisin诱导，诱导温度为30℃，诱导时间为12h。

在一种实施方式中，所述诱导还采用终浓度0.15～0.25mmol/L Cu²⁺。

本发明还提供所述多铜氧化酶、多铜氧化酶突变体，或表达所述多铜氧化酶或多铜氧化酶突变体的乳酸乳球菌在降低生物胺中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是将所述多铜氧化酶或多铜氧化酶突变体加入至含生物胺的环境中，于30～40℃反应。

在一种实施方式中，控制反应pH为4～4.5。

有益效果：本发明利用乳酸乳球菌食品级表达系统Lactococcus lactis NZ3900/pNZ8149对多铜氧化酶成功实现了食品级表达。通过对重组野生型多铜氧化酶MCOB_L0及其突变体的诱导条件、以及Cu²⁺的添加条件等进行了优化，使得重组MCOB_L0的表达水平达到了2325.84U/L，同比初始表达水平酶活力提高了9.06倍，优良突变体L386Y、L386Y/T317N、L386Y/T317N/S427E的表达水平分别达到了4488.06U/L、4289.78U/L、2254.45U/L，分别提高了12.35、12.25、6.97倍，4488.06U/L是目前异源表达可降解生物胺的多铜氧化酶所达到的最高水平。通过比较大肠杆菌与乳酸乳球菌两个表达体系表达的多铜氧化酶MCOB_Ls和MCOB_Es的酶学性质发现，MCOB_Ls的最适反应pH和温度分别为pH 4.5，65℃，相较于已知的MCOB_Es的最适pH和温度(pH 3.0，55℃)发生了明显变化。在pH 2.5-5.5范围内，MCOB_Ls具有更高的稳定性，MCOB_L0对底物的催化效率较已知(MCOB_E0)提高了59.75％。进而通过比较MCOB_L0、MCOB_E0降解组胺的能力发现，以乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ3900表达的食品级多铜氧化酶对组胺的降解能力提高的63.41％。这表明该发明中具有生物胺降解能力的食品级多铜氧化酶更适用于应用到发酵食品中降解以组胺为代表的生物胺。另外需要强调的是，本发明中使用的是食品级表达系统Lactococcus lactis NZ3900/pNZ8149，构建的重组质粒均不带有任何抗性筛选标记，所获得的食品级重组多铜氧化酶MCOB_Ls可以作为安全的食品添加剂应用于发酵食品降解生物胺，所获得的食品级重组乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8149-MCOB_Ls也有望于直接作为安全的食品添加剂应用到发酵食品中减控食品中的生物胺。

附图说明

图1为食品级重组质粒pNZ8149-MCOs的构建；其中MCOB_L1:L386Y；

MCOB_L2:L386Y/T317N；MCOB_L3:L386Y/T317N/S427E；

图2为重组食品级MCOF_L0、MCOW_L0、MCOB_L0及MCOB_L0突变体的SDS-PAGE表达验证；(A)M:marker；1:对照；2:MCOB_L0；3:MCOF_L0；4:MCOW_L0；

(B)M:marker；1:MCOB_L0；2:MCOB_L1；3:MCOB_L2；4:MCOB_L3；

图3为重组食品级MCOB_L0及MCOB_L0突变体表达水平分析；

图4为重组食品级MCOB_Ls表达条件的优化；

图5为pH对MCOB_L0及其突变体活性及稳定性的影响；

图6为温度对MCOB_L0及其突变体活性及稳定性的影响；

图7为MCOB_L0与MCOB_E0对组胺降解能力的比较。

具体实施方式

材料与方法：

M17培养基：称取4.25g M17培养基，溶于80ml蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7.2，定容至100mL，121℃高压灭菌20min。固体培养基加20g/L琼脂粉。

GM17培养基：称取4.25g M17培养基，溶于80mL蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7.2，定容至100mL，121℃高压灭菌20min，冷却后加入葡萄糖至终浓度为5.0g/L。固体培养基加20g/L琼脂粉。

GSGM17培养基(制备感受态用)：称取85.50g蔗糖，12.50g甘氨酸，18.63g M17培养基，溶于400ml蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7.2，定容至500ml，高压灭菌。冷却后加入葡萄糖至终浓度为5.0g/L。

GM17MC恢复培养基(电击转化后用)：称取3.73g M17培养基，0.19g MgCl₂，0.02gCaCl₂，溶于80mL蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH至7.2，定容至100mL，高压灭菌。冷却后加入葡萄糖至终浓度为5.0g/L。

Elliker筛选平板：称取2g胰蛋白胨，0.5g酵母膏，0.4g NaCl，0.15g无水醋酸钠，0.05g抗坏血酸，1.5g琼脂粉，溶于90mL双蒸水，5M NaOH调节pH到6.8，121℃，20min。待温度降至40℃左右，超净工作台中，加入20％乳糖储液2.5mL，0.4％溴甲酚紫储液1mL，混匀后，每板10mL左右，倾倒平板，凝固后，密封，4℃冰箱保存备用。

Nisin储液：标准品为含2.5％nisin的混合物；首先配制5％乙酸溶液：10mL去离子水中加入500μL乙酸；配制0.05％乙酸溶液：取5％乙酸溶液1ml于100mL去离子水中；取上述0.05％的乙酸溶液25ml，加入nisin 1g,，静置10min后离心取上清，过滤除菌，得到40mg/ml的nisin粗品溶液(此溶液中含有1mg/mL的纯nisin)，分装与无菌1.5EP管中，-80℃保存备用。

多铜氧化酶酶活的测定方法：采用可见光吸收法，即以2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)为底物，通过检测酶氧化ABTS的量计算多铜氧化酶酶活。反应时间为1min，反应体系为50μL酶液、0.95mL含1mmol/L ABTS和1mmol/L CuCl₂的柠檬酸钠缓冲液。将每分钟氧化1μmol ABTS所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

多铜氧化酶最适反应pH及pH稳定性测定方法：利用pH 2.5-5.5的50mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液来确定野生型MCOB和其突变体的最适反应pH，反应温度为50℃。野生型MCOB和其突变体的pH稳定性：孵育前测定初始酶活，然后放在4℃下，在不同pH(2.5-5.5)条件下孵育2h后测定残余酶活，残余酶活比上初始酶活即为相对酶活。

多铜氧化酶最适反应温度及温度稳定性测定方法：在不同温度(35-75℃)下，使用ABTS作为底物，在pH 4.5下测定野生型MCOB和其突变体的酶活来确定最适反应温度。野生型MCOB和其突变体的温度稳定性：孵育前测定初始酶活，在不同温度(35-75℃)下孵育2h后测定残余酶活，残余酶活比上初始酶活即为相对酶活。

实施例1：多铜氧化酶的乳酸乳球菌食品级体系的构建

(1)MCOW、MCOF和MCOB基因序列：分别合成SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.6所示的基因序列。

(2)编码突变体L386Y、L386Y/T317N、L386Y/T317N/S427E的基因的扩增：

分别以来源于魏斯氏菌(W.cibaria)的MCOW、来源于发酵乳杆菌(L.fermentum)的MCOF、来源于解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)的MCOB及MCOB的三个优良突变体L386Y、L386Y/T317N、L386Y/T317N/S427E的基因(突变体构建方法已公开于公开号为CN110106153B的专利文件中)为模板，分别用特异性引物W-L/W-R和F-L/F-R扩增MCOW和MCOF基因、用引物B-L/B-R扩增MCOB及MCOB三个突变体的基因。

(3)重组质粒的构建：

以质粒pNZ8149为模板，用引物P1/P2将质粒pNZ8149进行PCR扩增线性化。按照Primer STAR HS DNA Polymerase(Takara)试剂盒说明书配制50μL反应体系：2x PrimerSTAR DNA聚合酶12.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，模板DNA 0.5μL，ddH₂O 11μL，扩增条件：98℃3min 1个循坏,98℃10S,55℃15S,72℃1min 30S,30个循坏,72℃5min一个循坏。PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳进行验证，将获得的条带单一的目的片段进行柱回收，回收方法参照柱回收试剂盒(Thermo Fisher)说明书进行。将获得的片段与线性化载体pNZ8149按照Gibson组装方法进行连接，分别获得食品级重组质粒：pNZ8149-MCOW_L0、pNZ8149-MCOF_L0、pNZ8149-MCOB_L0、pNZ8149-MCOB_L1、pNZ8149-MCOB_L2、pNZ8149-MCOB_L3。

(4)重组乳酸乳球菌的构建

分别将步骤(3)构建的重组质粒转入宿主乳酸乳球菌Lactococcus lactisNZ3900感受态细胞中。通过菌落PCR验证，将与目的条带大小符合的重组菌送至无锡天霖测序公司测定核苷酸序列。食品级重组质粒pNZ8149-MCOs的构建示意图如图1所示，食品级重组质粒均不带有抗性筛选标记。

成功构建的重组菌株分别是：表达重组多铜氧化酶MCOW_L0的重组菌NZ3900/pNZ8149-MCOW_L0、表达重组多铜氧化酶MCOF_L0的重组菌NZ3900/pNZ8149-MCOF_L0、表达重组多铜氧化酶MCOB_L0的重组菌NZ3900/pNZ8149-MCOB_L0、表达重组L386Y(MCOB_L1)的重组菌NZ3900/pNZ8149-MCOB_L1、表达重组L386Y/T317N(MCOB_L2)的重组菌NZ3900/pNZ8149-MCOB_L2、表达L386Y/T317N/S427E(MCOB_L3)的重组菌NZ3900/pNZ8149-MCOB_L3。

表1引物

注：下划线标出了用于Gibson组装的同源序列。

实施例2：多铜氧化酶在乳酸乳球菌中的表达及表达优化

(1)多铜氧化酶在乳酸乳球菌中食品级表达系统的表达：

按照实施例1的方法分别构建表达不同多铜氧化酶的重组乳酸乳球菌，将重组乳酸乳球菌在30℃条件下于GM17培养基中静置培养12h，再按照2％的接种量转入GM17培养基中在30℃条件下静置培养至OD＝0.4，加入终浓度为10ng/mL nisin诱导剂和0.25mM Cu²⁺，继续培养8h诱导蛋白表达，以空质粒pNZ8149做对照。诱导表达结束用PBS洗涤两次后再重新悬浮菌体，超声破碎15min，12000r/min离心5min收集上清液，即获得重组多铜氧化酶粗酶液，可用于进行酶活测定。

通过表达分析发现，重组多铜氧化酶MCOB_L0及三个优良突变体均成功在L.lactisNZ3900中表达，MCOW_L0没有活性表达，MCOF_L0没有表达(图2)。酶活力测定分析表明，MCOB_L0在L.lactis NZ3900中的表达水平为231.11U/L，MCOB_L1表达水平为336.19U/L，MCOB_L2表达水平为323.76U/L，MCOB_L3表达水平为282.83U/L(图3)。

(2)多铜氧化酶的表达条件优化

将实施例1构建的表达食品级多铜氧化酶的乳酸乳球菌在30℃条件下于GM17培养基中静置培养12h，再按照2％的接种量转入GM17培养基中在30℃条件下静置培养至OD＝0.5，添加终浓度为35ng/mL nisin诱导剂，诱导表达4h后再添加终浓度为0.15mmol/LCuCl₂溶液继续诱导蛋白表达8h，最终将重组MCOB_L0的表达水平提高到2325.84U/L，同比初始表达水平酶活力提高了9.06倍。优良突变体L386Y、L386Y/T317N、L386Y/T317N/S427E的表达水平分别达到了4488.06U/L、4289.78U/L、2254.45U/L，分别提高了12.35、12.25、6.97倍，4488.06U/L是目前异源表达可降解生物胺的多铜氧化酶达到的最高水平(图4)。与已经公开的在大肠杆菌中表达野生型MCOB及其突变体获得的酶活力相比，活性重组多铜氧化酶MCOB_Ls的表达水平与MCOB_Es相比提高了2.40-2.98倍。

实施例3：活性多铜氧化酶的酶反应动力学参数

利用镍柱进行亲和层析获得MCOB_Ls纯酶并且测得其酶反应动力学参数。与已发表的MCOB_Es酶反应动力学参数比较发现(表2)，同一基因编码的同一种酶因宿主不同(L.lactis NZ3900和E.coli BL21(DE3))，它的酶学性质会存在很大差异。野生型多铜氧化酶MCOB_L0，催化效率相较于MCOB_E0提高了59.75％，突变体MCOB_L1、MCOB_L2、MCOB_L3的催化效率没有发生明显变化。另外，MCOB_L0的比活力提高了2.5倍，突变体提高了1.1～1.4倍。

表2 MCOB_Ls和MCOB_Es的酶反应动力学参数比较

注：MCOB_Ls表示在乳酸乳球菌中表达的野生型MCOB及其突变体；MCOB_Es表示在大肠杆菌中表达的野生型MCOB及其突变体。*已发表数据

实施例4：pH和温度对活性多铜氧化酶的影响

通过测定MCOB_Ls的酶学性质可知，MCOB_Ls的最适反应pH为4.5，最适反应温度为65℃，与已发表数据比较(MCOB_Es)，最适反应pH和温度(MCOB_Es，pH 3.0，55℃)发生了明显变化。MCOB_Ls在pH 2.5-5.5条件下具有良好的稳定性，例如，将MCOB_Ls在pH 2.5的条件下孵育2h，MCOB_Ls的酶活力依然能保持在50％以上。在pH 4.5的条件下孵育2h，MCOB_Ls的酶活力依然能保持在80％左右。MCOB_L0的温度稳定性高于其突变体MCOB_L1、MCOB_L2、MCOB_L3(图5，图6)。

实施例5：多铜氧化酶MCOB_L0与MCOB_E0应用性能的评价

在组胺终浓度为50mg/L，pH 4.5，温度为37℃的条件下进行组胺降解，分别向该体系中添加终浓度为5000U/L的实施例2制备的MCOB_L0和MCOB_E0酶液。通过考察MCOB_L0和MCOB_E0对组胺的降解能力发现，MCOB_L0对组胺的降解速率高于MCOB_E0对组胺的降解速率，且大部分组胺主要是在前24h被降解。在48h时，MCOB_L0对组胺的降解率为34.25％，同比MCOB_E0对组胺的降解能力提高了63.41％(图7)。

实施例6：重组乳酸乳球菌用于降解生物胺

按照实施例2的方法培养重组乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8149-MCOW_L0、NZ3900/pNZ8149-MCOF_L0、NZ3900/pNZ8149-MCOB_L0、NZ3900/pNZ8149-MCOB_L1、NZ3900/pNZ8149-MCOB_L2和NZ3900/pNZ8149-MCOB_L3。

按照实施例5的方法配制生物胺反应体系，所述生物胺包括但不限于腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等脂肪族胺，或酪胺、苯乙胺等芳香族胺，或组胺、色胺等杂环胺，反应体系中的生物胺浓度为50mg/L.

将重组乳酸乳球菌细胞按照20～35g/L菌体湿重的添加量加入至生物胺反应体系中，于30～37℃反应12～72h。结果显示，重组乳酸乳球菌可作为细胞催化剂降低反应体系中的生物胺。

对比例1：

具体实施方式同实施例2，区别在于，调整Cu²⁺添加时间为诱导表达后第10h，结果显示，诱导表达后的MCOB及其突变体的产酶量均低于1000U/L。

对比例2：

具体实施方式同实施例2，区别在于，将多铜氧化酶MCOB基因替换为SEQ ID NO.2所示的魏斯氏菌来源的序列为MCOW的基因，按照实施例2的方法培养，获得的酶没有活性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种适用于发酵食品的多铜氧化酶重组酶

<130> BAA210046A

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 509

<212> PRT

<213> Weissella cibaria

<400> 1

Met Lys Asn Tyr Thr Asp Tyr Phe Phe Asp Glu Pro Ala Phe Asp Leu

1 5 10 15

His Asp Gly Gly Tyr Val Pro Leu Glu Val Ser Asp Ala Pro Glu Lys

20 25 30

Pro Leu Asn Val Pro Pro Leu Leu Lys Pro Asp Lys Glu Thr Ala Thr

35 40 45

Asp Val Tyr Tyr Thr Val Thr Ala Glu Ala Gly Glu Thr Gln Leu Leu

50 55 60

Pro Gly Ala Lys Thr Lys Thr Trp Gly Tyr Asn Thr Ser Leu Leu Gly

65 70 75 80

Gln Thr Ile Val Tyr Arg Arg Gly Gln His Thr His Val Thr Leu Lys

85 90 95

Asn Thr Leu Pro Glu Leu Thr Thr Phe His Trp His Gly Ala Asn Val

100 105 110

Ser Gly Pro Tyr Val Asp Gly Gly Cys His Ala Pro Val Tyr Pro Gly

115 120 125

Glu Ser Lys His Ile Asp Phe Thr Leu Glu Gln Pro Ala Thr Thr Leu

130 135 140

Trp Leu His Ala His Pro Cys Pro Ser Thr Ala Glu Gln Val Trp His

145 150 155 160

Gly Leu Ala Ala Met Val Ile Val Lys Asp Asp His Glu Ala Ser Leu

165 170 175

Pro Leu Pro Arg Asn Tyr Gly Val Asp Asp Ile Pro Val Ile Leu Gln

180 185 190

Asp Arg Arg Phe His Glu Asn Asn Gln Trp Asp Tyr Arg Ala Asp Tyr

195 200 205

Asp Pro Asp Gly Val Ala Gly Pro Thr Ala Met Ile Asn Gly Thr Ile

210 215 220

Asn Pro Tyr Phe Asp Val Thr Thr Gln Lys Val Arg Leu Arg Phe Leu

225 230 235 240

Asp Gly Ala Asn Arg Arg Glu Trp Arg Leu His Phe Ser Asp Asp Leu

245 250 255

Pro Phe Thr Gln Ile Gly Gly Asp Gly Ser Leu Leu Pro Glu Pro Val

260 265 270

Lys Phe Thr His Leu Met Leu Thr Cys Ala Glu Arg Ala Glu Val Val

275 280 285

Val Asp Phe Gly Gln Tyr His Glu Gly Asp Glu Val Thr Leu Tyr Thr

290 295 300

Asp Asp Val Pro Leu Leu Lys Phe Arg Ile His Ala Phe Lys Pro Asp

305 310 315 320

Gln Thr Thr Leu Pro Asp Lys Leu Phe Asp Val Lys Ala Pro Val Val

325 330 335

Asp Pro Ala Leu Pro Val Arg His Val Val Met Gln Gly Met Asp Glu

340 345 350

Gly Val Ala Ile Asp Gly Lys Lys Phe Ala Met Gln Arg Ile Asp Ala

355 360 365

Thr Gln Pro Ile Gly Lys Ala Gln Tyr Trp Asp Val Thr Asn Ser Asn

370 375 380

Asp Ala Pro Gly Met Val His Pro Phe His Val His Gly Thr Gln Phe

385 390 395 400

Leu Val Leu Ser Arg Asn Gly His Ala Pro Tyr Pro Asn Glu His Gly

405 410 415

Phe Lys Asp Thr Val Gly Val Asn Pro Gly Glu Thr Val Arg Leu Leu

420 425 430

Val Arg Phe Asp Leu Pro Gly Val Tyr Met Tyr His Cys His Ile Ile

435 440 445

Glu His Glu Asp Gly Gly Met Met Ala Gln Ile Glu Thr Phe Asp Pro

450 455 460

Ala Lys Pro Lys Gln Glu Tyr Lys Leu Met Asp Met Asp Thr Leu Met

465 470 475 480

Met Ser Leu Ala Lys Glu Arg Gly Val Lys Pro Ser Glu Ile Trp Met

485 490 495

Gly Gly Met Gln Ser Tyr Glu Lys Met Gly Met Lys Met

500 505

<210> 2

<211> 1530

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaaaaact atacggacta tttctttgat gagccagcgt ttgatctcca cgatggcgga 60

tacgtgccgc ttgaggtcag tgatgcgccc gagaagccct taaatgtgcc gccgttgttg 120

aaaccggata aagagacggc gaccgacgtt tattacacgg tgacagcaga ggctggggaa 180

acgcaactgt tacctggggc gaagaccaag acgtggggct acaataccag tctgttaggt 240

cagacgattg tgtatcgccg tggtcagcat acgcatgtga cactgaaaaa caccctgcct 300

gagttgacca cttttcattg gcatggggct aatgtcagtg gcccttatgt tgatggcgga 360

tgccatgcgc cggtttatcc gggtgaaagt aagcatatcg acttcacatt ggaacaacca 420

gcgacgactt tgtggctgca cgcgcatccg tgcccatcca cagccgagca ggtttggcat 480

ggtttggctg ccatggtgat tgtcaaagac gaccatgaag ccagcctgcc attgccaagg 540

aactatggcg ttgacgatat tccggtcatt ttgcaagacc ggcgttttca tgagaacaac 600

cagtgggact accgggctga ttatgatcct gacggtgttg ctgggccaac tgcaatgatt 660

aacggtacaa tcaatcccta ttttgatgtc accacgcaaa aggcccggtt gcgttttctg 720

gatggtgcta atcgccgtga atggcggttg catttttccg atgacctgcc atttacacaa 780

attggcgggg atggctcact gttaccggag ccggtcaaat ttacccattt gatgctgact 840

tgtgctgagc gtgccgaagt ggttgttgat tttggccaat accatgaagg cgacgaggtc 900

accttatata cggatgatgt gccattgcta aagttccgca ttcatgcgtt caaaccggat 960

cagactacct tgcctgataa gttgttcgat gtgaaggcac cagtggttga cccggctttg 1020

ccagttcgcc acgttgtgat gcagggcatg gacgaaggtg tcgcgattga tggtaaaaag 1080

tttgccatgc agcggattga tgccacgcaa ccaattggca aagcccagta ctgggatgtt 1140

accaatagca atgatgcgcc tggaatggtt catccattcc atgtgcatgg aacccaattc 1200

ttagtcttgt cgcggaatgg gcatgcgccg tatccaaatg aacatggttt caaagatacc 1260

gttggcgtga atcctggtga aacggttcgg ctgctggttc gctttgattt gccaggggtt 1320

tatatgtatc actgccatat cattgagcac gaagatggcg gcatgatggc acagattgaa 1380

acattcgatc cagccaagcc aaagcaagaa tataaattga tggatatgga tacgttaatg 1440

atgtccttgg ctaaagaacg tggcgtcaaa ccatctgaga tttggatggg cggtatgcag 1500

tcttatgaaa aaatgggaat gaaaatgtaa 1530

<210> 3

<211> 512

<212> PRT

<213> Lactobacillus fermentum

<400> 3

Met Asn Glu Pro Val Phe Asp Ser Tyr Phe Tyr Asp Glu Gln Ala Phe

1 5 10 15

Asn Leu His Asp Ala Ala Tyr Lys Pro Leu Lys Gln Ala Gln Ala Pro

20 25 30

Ala Thr Pro Leu Asn Ile Pro Pro Leu Leu Thr Pro Asp Lys Val Asp

35 40 45

Gly Asp Asp Val Tyr Tyr Thr Val Thr Ala Gln Ala Gly Ala Thr Gln

50 55 60

Leu Leu Pro Gly Glu Lys Thr Lys Thr Trp Gly Phe Asn Ala Ser Met

65 70 75 80

Leu Gly Gln Thr Val Val Phe Glu Arg Gly Lys Thr Tyr His Met His

85 90 95

Leu Val Asn His Leu Pro Glu Val Thr Thr Phe His Trp His Gly Leu

100 105 110

Glu Ile Pro Gly Pro Ile Glu Asp Gly Gly Cys His Ala Pro Val Tyr

115 120 125

Pro Gly Glu Ala Arg Asp Val Thr Phe Lys Ile Ile Gln Pro Ala Ala

130 135 140

Thr Ala Trp Leu His Ala His Pro Cys Pro Glu Thr Ala Tyr Gln Val

145 150 155 160

Trp Gln Gly Leu Ala Thr Met Ala Ile Ile His Asp Gln Glu Glu Ala

165 170 175

Ser Leu Pro Leu Pro His Thr Tyr Gly Val Asp Asp Leu Pro Leu Ile

180 185 190

Leu Gln Asp Arg Asn Phe His Ala Gly Asn Gln Phe Asp Tyr Arg Ala

195 200 205

Asp Tyr Asp Pro Asp Gly Val Gln Gly Asp Thr Ala Val Ile Asn Ala

210 215 220

Thr Val Asn Pro Tyr Phe Asp Val Thr Thr Gln Arg Leu Arg Leu Arg

225 230 235 240

Ile Leu Asn Gly Ser Asn Arg Arg Glu Tyr Arg Leu His Phe Ser Asp

245 250 255

Asp Leu Thr Phe Thr Gln Ile Gly Ser Asp Leu Ser Phe Leu Pro His

260 265 270

Pro Val Lys Leu Lys Lys Leu Met Thr Thr Cys Ala Glu Arg Gln Glu

275 280 285

Ile Val Val Asp Phe Ala Gly Tyr Gln Pro Gly Asp Thr Val Thr Leu

290 295 300

Tyr Ser Asp Asp Ser Pro Leu Val Glu Phe Arg Ile His Glu Phe Thr

305 310 315 320

Pro Ala Gly Glu Glu Leu Pro Thr Thr Leu Thr Lys Ile Asp Tyr Pro

325 330 335

Thr Pro Asp Pro Ser Leu Pro Val Lys Gln Val Val Met Ser Gly Met

340 345 350

Asp Glu Thr Val Met Ile Asp Gly Lys Lys Phe Gln Met Asp Arg Ile

355 360 365

Asp Tyr Thr Met Pro Met Gly Lys Cys Gln Leu Trp Asp Ile Thr Asn

370 375 380

Thr Asn Asp Met Asn Gly Gly Met Ile His Pro Phe His Met His Gly

385 390 395 400

Cys Ala Phe Glu Ile Val Ser Arg Asn Gly Gln Glu Pro Tyr Pro Phe

405 410 415

Glu His Gly Leu Asn Asp Thr Val Ala Val Asn Pro Gly Glu His Val

420 425 430

Ile Ile Lys Val Tyr Phe Gln Val Pro Gly Val Phe Met Tyr His Cys

435 440 445

His Ile Ile Glu His Glu Asp Gly Gly Met Met Ala Gln Leu Lys Val

450 455 460

Val Asp Pro Ala Ala Pro Asp Arg Glu Tyr His Leu Leu Asn His Met

465 470 475 480

Thr Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Glu Arg Gly Val Thr Met Asp Glu

485 490 495

Leu Trp Leu Gly Gly Met Asp Ser Tyr Lys Lys Met Gly Met His Met

500 505 510

<210> 4

<211> 1539

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaatgaac cagttttcga ttcctacttt tacgatgagc aagccttcaa ccttcacgat 60

gcggcctaca agccactgaa gcaggctcaa gcacccgcga cgcccctcaa cattccgccc 120

ctgttaaccc cagacaaggt ggacggcgac gacgtgtact acaccgttac cgcccaggcg 180

ggggcaaccc agctattgcc gggggaaaag accaagacct ggggctttaa cgcctcaatg 240

ctggggcaga cggtggtctt tgagcgcggc aagacttacc acatgcacct ggtcaaccac 300

ctaccggaag tgacgacctt ccactggcac ggactagaga ttcccgggcc aattgaagac 360

ggcggctgcc acgccccggt ttacccgggc gaggcccgcg acgtgacctt taagatcatt 420

cagccggccg ccaccgcctg gctccacgcc cacccctgcc cggaaacggc ctaccaggtt 480

tggcagggac tggcgacgat ggcgatcatt cacgaccaag aagaagctag tttgcccctg 540

ccgcacactt acggagttga tgacctgccg ttgatcttgc aggaccgcaa cttccacgcg 600

ggcaaccagt ttgattaccg ggccgattac gaccctgatg gcgtccaggg tgacacggcg 660

gtgattaacg ccaccgtcaa tccttacttt gacgtcacca cccagcgcct gcggttgcga 720

attttaaacg gctctaaccg ccgcgagtac cggctccact tctcggacga cttaaccttc 780

acccaaattg gctcggacct gagctttttg ccccacccgg tcaagttaaa gaagctgatg 840

actacctgtg ccgagcgcca ggagatcgtg gtcgactttg ccggctacca gccgggcgac 900

acggttaccc tgtactccga cgacagtccg ctggtcgagt tccggatcca cgagtttacg 960

ccggcaggag aggagttgcc caccaccctg accaagattg attacccgac cccagacccg 1020

agcctacccg tcaagcaggt ggtgatgtct gggatggacg agacggtgat gattgacggc 1080

aagaagttcc agatggaccg gatcgattac acgatgccga tgggcaagtg ccagctttgg 1140

gacattacca acaccaacga catgaatggc gggatgattc accccttcca catgcacggc 1200

tgcgcctttg agatcgtctc ccgtaacggc caggaaccct acccgtttga acacggactt 1260

aacgacaccg tcgccgttaa cccgggcgaa cacgtcatca tcaaggtcta cttccaagta 1320

ccgggggtct ttatgtacca ttgtcacatt atcgaacacg aagatggcgg gatgatggcc 1380

caactaaagg ttgtcgaccc ggccgccccg gaccgggagt accacttgct caaccatatg 1440

accctgatgg aggcctttgc caaggagcgg ggcgtcacga tggatgaact ctggcttggt 1500

gggatggact cctacaagaa gatggggatg cacatgtaa 1539

<210> 5

<211> 512

<212> PRT

<213> Bacillus amyloliquefaciens

<400> 5

Met Ala Leu Glu Lys Phe Ala Asp Glu Leu Pro Ile Ile Glu Thr Leu

1 5 10 15

Lys Pro Gln Lys Thr Ser Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Glu Val Thr Met

20 25 30

Lys Glu Cys Phe His Lys Leu His Arg Asp Leu Pro Pro Thr Arg Leu

35 40 45

Trp Gly Tyr Asn Gly Leu Phe Pro Gly Pro Thr Ile Asp Val Asn Gln

50 55 60

Asp Glu Asn Val Tyr Ile Lys Trp Met Asn Asp Leu Pro Asp Lys His

65 70 75 80

Phe Leu Pro Val Asp His Thr Ile His His Ser Glu Gly Gly His Gln

85 90 95

Glu Pro Asp Val Lys Thr Val Val His Leu His Gly Gly Ala Thr Pro

100 105 110

Pro Asp Ser Asp Gly Tyr Pro Glu Ala Trp Phe Thr Arg Asp Phe Lys

115 120 125

Glu Lys Gly Pro Tyr Phe Lys Lys Glu Val Tyr His Tyr Pro Asn Lys

130 135 140

Gln Arg Gly Ala Leu Leu Trp Tyr His Asp His Ala Met Ala Ile Thr

145 150 155 160

Arg Leu Asn Val Tyr Ala Gly Leu Ala Gly Met Tyr Ile Ile Arg Glu

165 170 175

Arg Lys Glu Lys Gln Leu Lys Leu Pro Ala Gly Glu Tyr Asp Val Pro

180 185 190

Leu Met Ile Met Asp Arg Thr Leu Asn Asp Asp Gly Ser Leu Phe Tyr

195 200 205

Pro Ser Gly Pro Asp Asn Pro Ser Glu Thr Leu Pro Asn Pro Ser Ile

210 215 220

Val Pro Phe Leu Cys Gly Asn Thr Ile Leu Val Asn Gly Lys Ala Trp

225 230 235 240

Pro Tyr Met Glu Val Glu Pro Arg Thr Tyr Arg Phe Arg Ile Leu Asn

245 250 255

Ala Ser Asn Thr Arg Thr Phe Ser Leu Ser Leu Asn Asn Gly Gly Arg

260 265 270

Phe Ile Gln Ile Gly Ser Asp Gly Gly Leu Leu Pro Arg Ser Val Lys

275 280 285

Thr Gln Ser Ile Ser Leu Ala Pro Ala Glu Arg Tyr Asp Val Leu Ile

290 295 300

Asp Phe Ser Ala Phe Asp Gly Glu His Ile Ile Leu Thr Asn Gly Thr

305 310 315 320

Gly Cys Gly Gly Asp Val Asn Pro Asp Thr Asp Ala Asn Val Met Gln

325 330 335

Phe Arg Val Thr Lys Pro Leu Lys Gly Glu Asp Thr Ser Arg Lys Pro

340 345 350

Lys Tyr Leu Ser Ala Met Pro Asp Met Thr Ser Lys Arg Ile His Asn

355 360 365

Ile Arg Thr Leu Lys Leu Thr Asn Thr Gln Asp Lys Tyr Gly Arg Pro

370 375 380

Val Leu Thr Leu Asn Asn Lys Arg Trp His Asp Pro Val Thr Glu Ala

385 390 395 400

Pro Arg Leu Gly Ser Thr Glu Ile Trp Ser Ile Ile Asn Pro Thr Arg

405 410 415

Gly Thr His Pro Ile His Leu His Leu Val Ser Phe Gln Val Leu Asp

420 425 430

Arg Arg Pro Phe Asp Leu Glu Arg Tyr Asn Lys Phe Gly Asp Ile Val

435 440 445

Tyr Thr Gly Pro Ala Val Pro Pro Pro Pro Ser Glu Lys Gly Trp Lys

450 455 460

Asp Thr Val Gln Ala His Ser Gly Glu Val Ile Arg Ile Ala Ala Thr

465 470 475 480

Phe Ala Pro Tyr Ser Gly Arg Tyr Val Trp His Cys His Ile Leu Glu

485 490 495

His Glu Asp Tyr Asp Met Met Arg Pro Met Asp Val Thr Glu Lys Gln

500 505 510

<210> 6

<211> 1557

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggcacttg aaaaatttgc agatgaactg ccgattatcg aaacactgaa gccgcagaag 60

acatcaaacg gcagcacgta ttatgaagtc acgatgaagg aatgctttca caagctgcac 120

cgtgatctcc cgccgacccg gctgtgggga tataacggtt tgtttcccgg cccgacgatt 180

gatgtgaacc aagatgaaaa cgtctatatt aaatggatga atgacctgcc ggataagcat 240

tttctccctg tggaccatac cattcaccat tcagagggcg gccatcagga acccgacgtc 300

aaaactgtcg tccatttaca cggaggagca acgccgccgg acagcgacgg ctatccggaa 360

gcctggttca cacgggattt caaggagaag gggccttatt ttaaaaaaga ggtataccac 420

tatccaaaca aacagcgcgg ggcgctatta tggtatcacg accacgccat ggcaattacg 480

aggctcaatg tgtacgccgg gcttgccggc atgtatatca tccgcgagcg aaaagaaaag 540

cagctgaagc ttcccgccgg agaatacgac gtaccgctta tgattatgga ccgcacgtta 600

aatgacgacg gttccttgtt ttatccgagc gggcccgata atccttccga aacgctgccg 660

aatccttcaa tcgttccgtt tctttgcgga aataccattc tcgtcaacgg caaagcgtgg 720

ccgtatatgg aagtcgaacc gcggacatat cgtttccgta tccttaacgc ctcaaatacg 780

agaacatttt ctctctcgct caataatggc ggccggttta tccaaatcgg ttcagacggc 840

ggactgctcc cccgttctgt caaaacacag tccatcagct tagcaccggc tgagcggtat 900

gatgtgctca ttgatttctc cgcttttgac ggagaacata ttattttaac gaacggcacc 960

ggctgcgggg gcgacgtcaa tccggatacc gacgccaatg tgatgcaatt ccgcgtcaca 1020

aaaccgctga agggagaaga caccagccgg aagcctaaat atctgtcagc catgcctgat 1080

atgacatcaa aaagaataca caatatcagg acgcttaaac tcacaaacac gcaagacaaa 1140

tacggccggc cggttttaac gctcaataac aagcgctggc atgatcccgt gacagaagcg 1200

ccgcggctcg gctcaacgga aatctggtcg attatcaatc cgacgcgggg aacccatccg 1260

atacacctgc acttggtttc cttccaagtc cttgaccggc gtccttttga cttagaacgt 1320

tataacaaat tcggcgacat tgtgtataca ggccccgccg tcccgccgcc tccaagtgaa 1380

aaaggctgga aagacaccgt gcaggcgcac tccggagaag tcatcagaat cgcggcgaca 1440

ttcgcccctt acagcggacg gtacgtatgg cattgtcata ttttagaaca cgaagattat 1500

gacatgatga gaccgatgga cgtcacagaa aagcagcatc atcaccacca ccactaa 1557

Claims (10)

1.表达多铜氧化酶或多铜氧化酶突变体的乳酸乳球菌，其特征在于，所述多铜氧化酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示；所述多铜氧化酶突变体是在SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的基础上，对第317位、386位、427位中的至少一个氨基酸进行了突变。

2.根据权利要求1所述的乳酸乳球菌，其特征在于，所述多铜氧化酶突变体是在SEQ IDNO.5所示氨基酸序列的基础上，将第317位苏氨酸突变为天冬酰胺；或

将第386位亮氨酸突变为酪氨酸；或

将第427位丝氨酸突变为谷氨酸；或

将第317位苏氨酸突变为天冬酰胺，并将第386位亮氨酸突变为酪氨酸；或

将第317位苏氨酸突变为天冬酰胺，并将第386位亮氨酸突变为酪氨酸，并将第427位丝氨酸突变为谷氨酸。

3.根据权利要求1或2所述的乳酸乳球菌，其特征在于，所述表达载体为pNZ8149质粒。

4.根据权利要求3所述的乳酸乳球菌，其特征在于，以乳酸乳球菌NZ3900为宿主，以pNZ8149为载体。

5.含有权利要求1～4任一所述乳酸乳球菌的食品添加剂。

6.一种生产多铜氧化酶的方法，其特征在于，用权利要求1～4任一所述的乳酸乳球菌发酵生产多铜氧化酶。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述乳酸乳球菌培养至OD₆₀₀为0.4～0.6后，采用nisin和/或Cu²⁺诱导。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，诱导剂nisin的终浓度为0.00001～45ng/mL，Cu²⁺的终浓度0.15～0.25mmol/L。

9.权利要求1～4任一所述的乳酸乳球菌，或权利要求5所述的食品添加剂在降低生物胺中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用是将权利要求1～4任一所述的乳酸乳球菌或权利要求5所述的食品添加剂加入至含生物胺的环境中，于30～40℃反应。

Images